Winning projects and candidates

L’épissage alternatif (EA) est un processus cellulaire médié par un large complexe ribonucléoprotéique, le splicéosome, qui permet de générer à partir d’un ARN pré-messager un éventail d’isoformes d’ARNm. C’est est un moyen pour la majorité des gènes cellulaires d’étendre et de réguler leur expression.

Lors de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1), le virus utilise ce processus d’EA pour générer, à partir d’un seul ARN pré-messager non épissé (unspliced, US), plus d’une centaine de transcrits viraux. Ce processus permet à la fois de réguler la production des ARNm US, qui seront soit traduits en protéines Gag et Gag-Pol, soit seront encapsidés dans les nouvelles particules en tant que génome viral, et la production des différentes isoformes d’ARN qui seront traduites en protéines virales nécessaires pour générer de nouveaux virus. Un déséquilibre dans ce processus peut avoir des conséquences importantes sur la réplication virale. l’EA du VIH est donc une étape particulièrement régulée, spatialement et temporellement, au cours de l’infection.

Déterminer les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation du transcriptome du VIH est donc crucial pour une meilleure compréhension de l’infection virale.

En exportant les ARN non-épissés (US) ou partiellement épissés vers le cytoplasme, la protéine virale Rev s’est révélée être un régulateur clé de l’expression du transcriptome viral. Les facteurs de régulation « classiques » de l’épissage tels que les protéine hnRNP ou les protéines SR ont également été très étudiées et jouent un rôle capital. Bien que son rôle soit controversé et les mécanismes impliqués ne soit pas clairs, certaines études suggèrent que la protéines virale Tat, le trans-activateur de la transcription du virus, pourrait également être impliquée dans la régulation de l’EA. Nos résultats préliminaires suggèrent en effet que Tat pourrait favoriser l’épissage de certaines isoformes virales et notamment ses propres isoformes, Tat 1 et Tat 2. 

Cependant, il est de plus en plus clair que l’épissage alternatif est une étape extrêmement modulable, influencée par de nombreux processus cellulaires tels que la transcription, la traduction ou la dégradation des ARNm. L’importance de l’ensemble de ces processus sur l’EA et la production des isoformes virales au cours de l’infection a peu été étudiée, encore moins à l’échelle de l’ensemble du transcriptome du virus. 

L’objectif de ce projet de recherche est de mieux caractériser l’ensemble des acteurs viraux et cellulaires qui interviennent dans la régulation de l’épissage alternatif lors de l’infection par le VIH-1. Ce projet s’articule autour de 2 axes :

1-Définir le rôle de la protéine virale Tat, le trans-activateur de transcription, dans la dynamique du transcriptome viral au cours de l’infection en caractérisant son impact sur l’ensemble du transcriptome viral et en définissant les mécanismes moléculaires impliqués.

2-Identifier et caractériser des nouveaux acteurs et processus cellulaires impliqués dans la régulation du transcriptome viral en utilisant une stratégie de criblage génomique par CRISPR/cas9 en présence d’un système rapporteur bi-chromatique de l’EA du VIH-1.

Ce projet repose sur une combinaison d’approches moléculaires et cellulaires (RT-qPCR, tests de complémentations, pontage et purification des complexes ARN-protéines, identification des facteurs cellulaires liés au pré-ARNm viral, etc..). De plus, un nouvel essai, récemment mis au point dans notre équipe et reposant sur le séquençage pleine longueur fournit un outil unique pour étudier la régulation de l’ensemble du transcriptome viral pendant l’infection.

Dans l’ensemble, ce projet de recherche nous permettra de mieux caractériser une étape clé de la réplication du VIH-1 et possiblement de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques. Il permettra également d’améliorer nos connaissances générales sur un processus cellulaire qui régule l’expression de plus de 90% des gènes cellulaires humains.

L’histoplasmose disséminée est une infection fongique qui touche principalement les patients immunodéprimés et particulièrement les patients VIH en stade avancé, avec un taux de mortalité élevé en l’absence de traitement (16,8% en Guyane). En l’absence de diagnostic et donc de traitement, l’histoplasmose est une maladie mortelle. En Afrique subsaharienne (SSA) et dans les pays d’Afrique de l’Ouest, cette infection est rarement diagnostiquée en raison d’un manque d’informations sur l’épidémiologie, de formation et de sensibilisation insuffisantes du personnel de santé de première ligne, mais aussi en raison de caractéristiques cliniques très similaires à celles de la tuberculose. Le spectre clinique de l’histoplasmose est varié, allant d’une infection pulmonaire isolée à une infection disséminée avec atteinte des poumons, de la peau, des ganglions lymphatiques et/ou de la moelle osseuse.

Les méthodes de diagnostic classiques sont l’observation microscopique d’une levure à la morphologie évocatrice dans un échantillon biologique et la culture. Cependant, l’examen direct requiert une pratique régulière et les levures peuvent être confondues avec d’autres agents pathogènes. La culture, quant à elle, nécessite une incubation prolongée (souvent de 2 à 4 semaines), et implique, quand elle est positive, une manipulation dans un laboratoire de sécurité de niveau 3.

La mise en place d’outils de diagnostic non invasifs permettrait d’améliorer le diagnostic de l’histoplasmose chez les patients les plus exposés mais aussi d’évaluer la prévalence de cette infection fongique dans les pays Africains où les données sont encore insuffisantes. Les tests de diagnostic rapides (TDRs) tels que le TB Urinary-Lam pour le diagnostic de la tuberculose ou le CrAg Lateral Flow Assay pour le diagnostic de la cryptococcose ont démontré leur impact sur la prise en charge des pathologies associées aux patients VIH. Ces TDRs reposent sur des procédures simples et réalisables pour la plupart des centres de soins de santé primaires ou pour une utilisation au lit du patient dans les pays aux ressources limités. Dans les zones à forte prévalence du VIH et de la tuberculose, nous pensons qu’il est essentiel de mettre en œuvre de nouvelles méthodes de diagnostic pour une meilleure prise en charge des patients atteints d’histoplasmose.

Notre objectif est donc de tester deux nouveaux TDRs basés sur la détection urinaire, pour évaluer leurs performances et la prévalence de l’histoplasmose, sur des échantillons récoltés en Afrique (Afrique de l’Ouest et SSA), où la prévalence de l’infection à VIH et de la tuberculose est élevée. Ces TDRs ont une sensibilité (Se ³ 93 %) et une spécificité (Sp ³ 95 %) élevées dans des études menées au Mexique et en Colombie, et semblent très prometteurs. Il n’y a pas encore de données disponibles dans les pays Africains.

Nous nous intéressons plus particulièrement aux patients et aux échantillons Ivoiriens et Camerounais, puisque les histoplasmoses diagnostiquées en France concernent majoritairement des patients originaires de ces deux pays. Suite à la demande d’accès à la bio banque du projet STATIS (ANRS_12290), nous souhaitons évaluer ces TDRs sur cette collection d’échantillons. Cette collection répond en effet à nos critères pour l’évaluation d’une cohorte de terrain (grille STARD) et particulièrement les échantillons de patients sans diagnostics définitifs de tuberculose et ceux associés à une mortalité inexpliquée malgré le traitement antituberculeux administré.

En combinant ces nouveaux outils de diagnostic, une formation appropriée des cliniciens et des équipes de laboratoire et l’accessibilité aux traitements, la mortalité liée à l’histoplasmose pourrait être réduite.

Activités anti-VIH des 12 sous-types d’interféron alpha

Les études de l’inhibition de la réplication du VIH par l’interféron alpha sont généralement limitées à l’utilisation d’un seul sous-type (alpha 2). Cependant, le génome humain code pour 12 sous-types, qui lient le même récepteur, mais avec des affinités différentes, et sont capables d’induire l’expression de séries de gènes communs et d’autres spécifiques à chaque sous-type. En conséquence, leur efficacité antivirale est différente à la fois sur un virus donné et sur des virus appartenant à des familles différentes.

Concernant le VIH, des publications relativement récentes ont démontré que certains sous-types sont plus efficaces que d’autres.  Nous avons entrepris une étude systématique de l’effet anti-VIH des 12 sous-types d’IFN alpha. Nous avons initialement confirmé une hiérarchie de l’effet antivirale sur la réplication du virus. Ensuite, de façon originale, nous avons mis en évidence des spécificités dans leur puissance d’inhibition sur des étapes précises du cycle viral.  Pour identifier des facteurs potentiellement responsables des différences d’inhibition observées, nous avons conduit une analyse de l’expression des ARN (RNAseq) par des cellules exposées à chaque sous-type ; analyse que nous avons réalisée par séquençage profond, à génome entier. Cette analyse a permis d’identifier un nombre restreint de gènes induits spécifiquement par certains sous-types. Notre but est d’identifier, parmi ces gènes, ceux qui sont responsables de l’inhibition observée à chaque étape du cycle viral. Le caractère non-biaisé de notre approche (RNAseq) nous permettra d’explorer l’implication de facteurs inattendus. En effet, notre analyse a mis en évidence l’induction de l’expression de gènes jusqu’alors non associés à la réponse interféron.

Cette étude nous permettra de définir le potentiel anti-VIH des IFN-alpha, qui se révèle bien plus vaste qu’initialement imaginé.  L’identification de nouveaux facteurs capables de cibler des étapes précises du cycle viral pourra inspirer des approches antivirales novatrices.

Malgré l’efficacité des traitements antirétroviraux, les personnes vivant avec le VIH (PVVIH) présentent des altérations de leur système immunitaire. Le vieillissement immunitaire associé à l’augmentation de l’âge chez les PVVIH accentue encore ces altérations. Celles-ci peuvent être associées à l’augmentation de maladies, ainsi qu’à une réactivité réduite à la vaccination, chez les PVVIH. Ainsi, l’incidence du zona, due à la réactivation du virus de l’herpès zoster, est plus élevée chez les patients âgés vivant avec le VIH, même sous traitement, par rapport aux témoins de même âge. Ceci met en avant l’importance de la vaccination contre le virus de l’herpès zoster dans cette population. Cependant, il existe encore peu de données publiées disponibles sur l’immunogénicité et l’innocuité du vaccin recombinant contre le zona (VRZ) de dernière génération chez les PVVIH, en particulier chez les personnes ayant un faible taux de lymphocytes T CD4 et des facteurs de risque supplémentaires, tels que l’âge et les comorbidités. Aucune donnée n’existe pour les PVVIH de plus de 75 ans, qui pourraient être les moins réactifs au vaccin. Enfin, il est bien établi que la vaccination peut induire une augmentation transitoire de la charge virale du VIH, même chez les personnes présentant une virémie indétectable au départ, bien qu’avec peu ou pas de conséquence clinique. Ainsi, une meilleure caractérisation de l’immunogénicité et de l’effet du VRZ sur la charge virale du VIH chez les PVVIH âgées est fortement justifiée.

Au travers d’une collaboration entre des laboratoires de Genève et de Bordeaux, nous proposons ici d’améliorer nos connaissances concernant la vaccination avec VRZ chez les PVVIH, en particulier âgées (plus de 75 ans) par la réalisation d’un essai clinique de phase IV. Nous allons effectuer une évaluation approfondie de la réponse au VRZ chez les patients VIH de plus de 75 ans sous traitement antirétroviral à long terme (> 20 ans) par rapport aux témoins adultes plus âgés non séropositifs. Nous comparerons également la réponse des patients séropositifs plus jeunes (50 à 75 ans) pour étudier l’effet combiné du vieillissement et de l’immunosuppression due à l’infection par le VIH. Les patients (n=150) seront recrutés à partir de deux grandes cohortes VIH, à savoir la cohorte ANRS CO3 en Aquitaine et l’étude suisse de cohorte VIH SHCS, avec accès aux échantillons biologiques et antécédents médicaux de plus de 2500 patients. Nous réaliserons une étude longitudinale et approfondie de l’innocuité et de l’immunogénicité du VRZ (c.a.d. quantité et qualité des réponses humorale, cellulaire et innée) au travers d’analyses fonctionnelles et transcriptomiques. Ainsi nous définirons des facteurs prédictifs (en particulier liés au vieillissement immunitaire) de l’efficacité du VRZ chez les PVVIH âgées.

La collaboration entre Genève et Bordeaux, compte tenu de l’expertise clinique et scientifique, des caractéristiques uniques des cohortes sélectionnées, devrait permettre des avancées significatives concernant la prévention du zona chez les PVVIH. En examinant si le RZV est immunogène avec un profil d’innocuité acceptable chez les PVVIH âgées, nous soutiendrons les directives de vaccination dans cette population et favoriserons l’acceptation du vaccin. Ce projet nous permettra aussi de mieux comprendre et d’informer sur l’efficacité vaccinale de manière générale chez les PVVIH plus âgées.

La primoinfection de l’enfant a lieu en contexte d’immaturité du système immunitaire. Son évolution naturelle est bimodale : en l’absence de traitement antirétroviral, environ 15% des enfants infectés par le VIH-1 en période périnatale présentent une évolution rapide vers le stade SIDA et un risque élevé de décès avant 3 à 4 ans. Une multithérapie instaurée dans les premiers mois de vie réduit considérablement la mortalité. Fait notable, le bénéfice clinique d’un traitement précoce perdure après l’arrêt des traitements, avec la disparition de la forme clinique rapide et sévère pour les enfants traités. L’initiation du traitement antirétroviral pendant la primo-infection peut conduire à un contrôle virologique pendant plusieurs années chez l’adulte. Plusieurs cas de contrôle post-traitement ont été décrits suite à une infection en période périnatale traitée précocement.

Le traitement précoce des nourrissons induit donc un équilibre beaucoup plus favorable entre l’hôte et le virus, avec un bénéfice clinique lors d’interruptions thérapeutiques. Le succès du traitement précoce est d’autant plus important que la situation d’échec virologique après un succès initial est fréquente dans la population infectée en période périnatale.

L’objectif du projet est de documenter les aspects physiopathologiques du traitement précoce en étudiant la reconstitution immunitaire qualitative, l’activation immunologique, l’immunité cellulaire adaptative et innée et le réservoir viral.

L’étude CLEAC est une enquête transversale multicentrique au sein de la file active des enfants infectés par le VIH-1, suivis dans les services franciliens participant à la cohorte ANRS-CO10-EPF consistant à effectuer des prélèvements sanguins couplés aux prises de sang réalisées dans le cadre du suivi biologique de routine, à visée d’explorations immuno-virologiques détaillées.

L’étude CLEAC cible des sujets âgés de 5 à 18 ans infectés par le VIH-1 par voie verticale dont le traitement antirétroviral a débuté avant l’âge de 6 mois (groupe « traitement précoce ») ou après l’âge de 24 mois (groupe « traitement tardif ») et avec un succès thérapeutique initial (obtention d’une virémie VIH-1 <400 copies/ml au plus tard 24 mois après l’instauration du traitement).

L’ANRS soutient ce projet et a accordé un financement partiel (AO 2015-2). Les inclusions dans l’étude CLEAC seront achevées le 31 mars 2018 et l’objectif sera atteint : 79 des 80 sujets prévus sont inclus au 1er mars 2018. Une analyse pilote des résultats déjà obtenus montre la pertinence des hypothèses initiales et  pointe deux nouveaux axes de recherche. La présente demande concerne la réalisation des tests évaluant :

• la polyfonctionnalité des lymphocytes T spécifiques du VIH,
• les marqueurs plasmatiques de l’activation immunitaire,
• les lymphocytes T « follicular helper » (TFH) et des lymphocytes B,
• l’ADN VIH-1 intégré,
• les caractéristiques virales (sous-type, génotropisme, sérologie).

Le bilan immuno-virologique détaillé de l’étude CLEAC chez des sujets dont l’histoire de l’infection par le VIH-1 est connue permettra de progresser dans la compréhension physiopathologique des interactions hôte/virus chez l’enfant et de l’impact de la période d’initiation du traitement antirétroviral.

Il permettra l’étude les caractéristiques immunologiques et virologiques d’enfants et d’adolescents chez qui pourrait être espéré un contrôle immuno-virologique lors de l’interruption ultérieure du traitement antirétroviral. En effet, le traitement précoce dans ce contexte pédiatrique pourrait favoriser l’accumulation de conditions nécessaires à une rémission.