Winning projects and candidates

Les réponses immunitaires dues aux cellules Natural Killer (NK) et B surviennent aux premiers stades de l’infection virale B et sont essentielles pour l’éradiquer. Pourtant, l’infection chronique (CHB) se produit parce que la réponse immunitaire antivirale est insuffisante. Les événements qui conduisent à un dysfonctionnement immunitaire ont été étudiés par notre groupe et nos partenaires. Grâce aux financements de l’ANRS, nous avons montré que les cellules B et NK sont dysfonctionnelles au cours de l’infection liée au virus de l’hépatite B (VHB) dans des modèles humains in vitro et validé ces résultats chez les patients atteints d’une infection chronique. Nous avons observé que les réponses des cellules B médiées par le Toll Like Receptor 9 (TLR9) étaient inhibées par la protéine d’enveloppe du virus (HBsAg). Nous avons noté que la perte d’expression de TLR9 sur la totalité des sous-ensembles de cellules B était médiée par la perte de l’activité de promoteur du VHB qui s’accompagne d’un blocage de la phosphorylation du facteur de transcription CREB. En outre, les réponses des cellules B médiées par TLR9, telles que la prolifération et la production de cytokines ont été inhibées chez les patients CHB. Pour les cellules NK, nous avons démontré plusieurs changements significatifs dans l’expression de leurs récepteurs, la perte de cytokines tels que IFNg, MIP1a et de la fonction de cytotoxicité par rapport aux donneurs sains. Cependant, la base moléculaire et la voie de signalisation du dysfonctionnement des cellules NK et B sont mal caractérisées. De plus, si cet état pouvait être inversé, ce que nous cherchons à déterminer, l’impact thérapeutique serait clef. Nous avons des données montrant que la perte de la fonction pCREB dans les cellules B entraîne non seulement la perte de l’expression de TLR9 mais également des gènes tels que BCL-2 qui est important dans le contrôle de la croissance cellulaire. Nous émettons l’hypothèse que la dérégulation de CREB joue un rôle dans la fonction des cellules B par TLR9 et non chez les patients CHB. Notre groupe dispose également de données montrant que la perte de fonction des cellules NK chez les patients CHB peut dépendre de mTOR, une voie qui est essentielle à la réponse des cellules NK. Plus frappant, nous avons des données récentes montrant que les cellules NK des patients CHB expriment Lag3 et TOX qui sont des gènes associés aux cellules T lorsque ceux-ci deviennent sur-stimulés et épuisés. Nous émettons l’hypothèse que plusieurs changements moléculaires se produisent dans les cellules NK des patients CHB qui dépendent de la modification de la voie mTOR par le VHB et plus spécifiquement l’HBsAg. Notre objectif est de définir les signatures génétiques qui conduisent à la fonction des cellules B et NK afin de contribuer à la compréhension du dysfonctionnement immunitaire induit par le VHB.

Pour explorer nos hypothèses, nous prévoyons d’utiliser des modèles humains in vitro de VHB, des plateformes de séquençage, des écrans CRISPR / Cas9, la cytométrie en flux et les techniques de biologie moléculaire. Dans les études sur les cellules NK et B, nous explorerons les altérations génétiques qui se produisent au cours des différents stades chroniques de la maladie, ce qui nous amène à inclure des patients aux différents stades cliniques de la maladie. Bien qu’il s’agisse d’un défi ambitieux, nous sommes convaincus d’avoir accumulé les outils de purification cellulaire, de production virale de VHB, de cohortes cliniques et de plates-formes de séquençage au sein de notre centre et d’avoir consolidé nos différentes collaborations pour explorer nos nouvelles hypothèses. Nous pensons que nos découvertes permettront de comprendre la signature moléculaire des cellules NK et B dans le contexte d’une infection par le VHB. À la fin du projet, nous espérons exploiter nos résultats dans des perspectives cliniques qui permettront d’identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques et surtout de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients VHB.

L’hépatite E est une pathologie hépatique causée par le virus de l’hépatite E (HEV) et transmise principalement par voie féco-orale. Le HEV représente la cause majeure d’hépatites virales dans le monde et l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) estime à 20 millions le nombre de nouvelles infections par an. Le HEV cause une infection aiguë qui finit par être résorbée par le système immunitaire dans la majorité des cas.  Cependant, l’infection peut évoluer vers une hépatite chronique ou fulminante chez les patients immuno-déprimés et les femmes enceintes, respectivement. Le taux de mortalité est estimé de 40 000 à plus de 70 000 décès par an. HEV est le seul membre de la famille des Hepeviridae classé dans le genre Orthohepevirus.  Le génome du HEV est à ARN monocaténaire de polarité positive d’environs 7 kb. Il contient trois cadres ouverts de lectures (ORF1 à 3). L’ORF1 code pour une poly-protéine non structurale, impliquée dans la réplication du génome. Les produits des ORF 2 et 3 sont, quant à eux, impliqués dans l’encapsidation et la libération des particules virales néoformées. L’ORF1 code pour sept protéines non-structurales incluant:  la méthyltransférase (MeT), le Y-domaine (Y), la cystéine peptidase apparentée à la papaïne, un domaine hypervariable riche en proline (HVR), un Macro domaine (ou X domaine), un domaine hélicase ainsi qu’une ARN polymérase –ARN dépendante (RdRp).  Ces différents domaines jouent un rôle crucial dans l’inhibition de la réponse immunitaire innée pour promouvoir la progression de l’infection. 

 Dans les cellules infectées il se produit une accumulation d’intermédiaires de réplication d’ARN double brin (ARNdb), qui va induire la réponse immunitaire innée de l’hôte par activation du système Oligoadenylate synthetase /endoribonuclease L (OAS/RNAse L), interféron dépendant. L’OAS est activée suite à sa fixation à des ARN db et génère, à partir de l’ATP, des oligoadenylates (2’5’A). Ces derniers vont se fixer sur la ribonucléase cellulaire RNAse L et provoquer son activation. La RNAse L activée clive les ARN cellulaires et viraux. Ce processus conduit à l’activation de signaux promouvant la transcription des gènes stimulés par les interférons, l’inhibition de l’infection virale et l’apoptose de la cellule infectée. En contrepartie, les virus ont développé différents moyens pour échapper à la réponse antivirale de l’hôte. Des études sur les virus tels que l’Ebola, l’hépatite C, l’influenza A, et plus récemment les Coronavirus et les Rotavirus, ont montré que les protéines non structurales de ces virus peuvent inhiber le système OAS/RNAse L par séquestration d’ARNdb ou l’inhibition directe de la voie OAS/ RNAse L. Cette inhibition dépend de la présence de motifs H-x-(S/T)-x, assurant une activité phosphodiestérase. La transfection des différents segments de l’ORF1 dans les cellules de mammifère inhibe fortement la production d’interférons. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans cette évasion restent à être élucidés.  

Le but de ce projet est d’une part d’identifier et de caractériser des activités enzymatiques, et d’autre part de déterminer des motifs moléculaires impliqués dans l’inactivation de la réponse immunitaire innée. La réalisation de ce projet repose sur (i) la conception de façon rationnelle de constructions contenant les motifs H-x-(S/T)-x; (ii) l’expression des constructions générées en système cellulaire afin d’étudier leur effet sur la modulation de la réponse immunitaire innée ; (iii) la caractérisation biochimique des protéines recombinantes de l’ORF1, permettant d’élucider les mécanismes moléculaires observées en cellules ; (iv) la confirmation du rôle des motifs /domaines identifiés, à l’aide de mutagénèse dirigée, dans la modulation de la réponse immunitaire innée.

Finalement, l’identification et la compréhension des activités virales, impliquées dans l’inactivation de la défense cellulaire, pourrait permettre l’identification de cibles pouvant être exploitées pour la génération d’agents antiviraux spécifiques.

L’infection chronique par le VHB (CHB) est une maladie complexe entraînant une inflammation chronique du foie et compliquée par le développement d’une cirrhose et d’un carcinome hépatocellulaire (CHC). Différentes phases de la maladie ont été caractérisées en fonction du niveau de réplication virale, ainsi que des réponses immunitaires et inflammatoires de l’hôte. La prise en charge de l’infection chronique par le VHB repose sur un dépistage à l’échelle de la population et sur l’identification précise de la phase de la maladie et des patients nécessitant un traitement antiviral. La décision de traiter est aujourd’hui principalement basée, selon les principales recommandations internationales, sur le chrage viral VHB qui est aussi utilisé pour surveiller les traitements actuels basés sur les analogues nucléos (t) ide (NUC) ou l’interféron alpha pégylé (IFNa). Bien que la plupart des patients sous traitement avec NUCs atteignent des charges virales indétectables, avec un bénéfice clinique clair (risque plus faible de développer une cirrhose et un CHC), il n’y a actuellement aucun « cure » de l’infection VHB en raison de la persistance du mini chromosome viral, l’ADNccc, dans le foie des patients. Plusieurs nouveaux composés, visant à diminuer le pool de molécules d’ADNccc  et/ou bloquer l’activité transcriptionnelle de l’ADNccc pour obtenir avec une durée de traitement finie une guérison fonctionnelle (perte de l’AgHBs), sont en cours de développement.

Nouveaux et anciens biomarqueurs non invasifs sont actuellement évalués pour leur capacité à: a) refléter avec précision la taille et l’activité transcriptionnelle du pool d’ADNccc intrahépatique; b) mieux classer les patients non traités en fonction de leur histoire naturelle; c) prédire le succès d’une guérison fonctionnelle (perte de HBsAg) avec les thérapies antivirales actuelles ou nouvelles en cours de développement clinique; d) évaluer le risque de réactivation virale chez les patients qui arrêtent le traitement antiviral ou chez ceux qui suivent un traitement immunosuppresseur. Une étape critique pour la validation de ces nouveaux biomarqueurs et pour aider au développement de nouveaux médicaments pour la guérison du VHB est la disponibilité de méthodes fiables pour étudier le réservoir viral VHB dans le foie (taille du pool d’ADNcc, activité transcriptionnelle et statut épigénétique).

Dans ce projet, nous nous appuierons sur un certain nombre d’avancées technologiques ainsi que sur les résultats récents de notre laboratoire pour optimiser (dans des modèles d’infection VHB in vitro et in vivo) et valider (dans des échantillons cliniques) une nouvelle méthode basée sur le séquençage de nouvelle génération (NGS) de l’accessibilité à la chromatine du ADNccc (cccDNA-ATAC-sec) comme approche de référence pour définir l’état fonctionnel du mini-chromosome ADNccc dans le foie des patients CHB (non traités et traités) et pour aider a l’évaluation mécanistique de nouveaux médicaments ou nouvelles interventions immunitaires anti-VHB.

Les objectifs spécifiques du projet sont :

– la réduction du nombre de cellules infectées nécessaires pour un cccDNA-ATAC-seq;

– l’adaptation du protocole cccDNA-ATAC-seq afin de son utilisation dans des échantillons de biopsie hépatique ou d’aspiration à l’aiguille fine (FNA) du foie ;

– la validation du meilleur protocole cccDNA-ATAC-sec dans le contexte clinique en définissant davantage la relation entre les profils cccDNA-ATAC-seq, les modifications post-traductionelles des histones liées au a ADNccc (statut épigénétique du ADNccc) et la transcription du ADNccc dans 2 cohortes de patients CHB.

Objectif principal :

Le projet Bè Djè a pour objectif principal de comprendre la situation des UD à Bamako et Sikasso au Mali, des drogues qui circulent, leurs usages et leur lien avec les infections VIH, VHC et VHB. Ce projet vise à plus long terme à proposer des réponses de réduction des risques adaptées à la situation des personnes usagères de drogues illicites (UD) y compris injectables (UDI) à Bamako et Sikasso.

Objectifs secondaires :

OS1 : Estimer la taille de la population des UD à Bamako et Sikasso

OS2 : Décrire les profils, les drogues consommées et les pratiques associées des UD

OS3 : Estimer la prévalence du VIH, VHB et VHC dans la population des UD

OS4 : Comprendre les facteurs pouvant influencer les usages et les pratiques à risque

OS5 : Etudier l’impact de la pandémie Covid19 sur le quotidien des usagers de drogues (pauvreté, marginalisation, pratiques de consommation…)

Méthodologie :

Recherche exploratoire mixte par triangulation combinant une investigation qualitative (entretiens semi-directifs, focus groupes), une enquête quantitative par questionnaire utilisant la méthode Respondent Driven Sampling (RDS) et une capture-recapture, ainsi qu’une étude toxicologique des drogues consommées par les UD. L’étude s’inscrit dans le champ de la recherche communautaire et se construit autour des besoins des usagers identifiés soit par les animateurs communautaires ou par les usagers pairs qui collaborent avec ARCAD Santé PLUS. Ces derniers contribueront au recrutement des participants à la recherche à la construction des outils et à la collecte de données. Toutes les mesures seront prises pour éviter les contacts (coupons RDS stériles, distribution de masques, gel hydroalcoolique, informations de prévention, focus groupes à moins de 10 personnes dans des lieux adaptées).

Nombre de participants prévus :

• 300 participants (questionnaires, dépistages VIH/VHC/VHB et étude toxicologique) ;
• 30 participants usagers de drogues et 10 intervenants et institutionnels du domaine de la réduction des risques et/ou du VIH pour des entretiens semi-directifs ;
• 2 focus groups auprès d’intervenants du domaine de la réduction des risques et/ou du VIH.

Critères étudiés :

• Drogues identifiées dans les échantillons prélevés auprès des UD par les animateurs d’ARCAD Santé PLUS ;
• Taille de la population des UD à Bamako et Sikasso définis comme tout consommateur régulier de produits psychoactifs illicites dans les villes de Bamako et Sikasso ;
• Proportion d’UD avec dépistages VIH/VHC/VHB positifs ;
• Types de drogues consommées et mode de consommation ;
• Pratiques à risque associées aux risques infectieux ;
• Pratiques de prévention en lien avec le Covid19.

Population de la recherche :

Critères d’inclusion :

• Age + 18 ans
• Etre usager de drogue actif défini par :
  • Déclaration de consommation actuelle et régulière (au moins 10 fois au cours des 30 derniers jours) de produits psychoactifs illicites autres que le cannabis (tous produits et tous modes de consommation confondus)
• Résident à Bamako ou Sikasso et ses alentours.

Echéancier :

Le projet est d’une durée totale de 3 ans.

Année 1 : Préparation du terrain et recueil des données qualitatives

Année 2 : Recueil des données quantitatives et toxicologiques

Année 3 : Analyse des résultats, recommandations.

Le programme « Au labo sans ordo » a pour objectif d’augmenter la couverture du dépistage du VIH, afin d’améliorer le premier palier de la cascade de prise en charge du VIH à Paris et dans les Alpes Maritimes, territoires qui font face à une épidémie VIH beaucoup plus élevée que les autres régions de France métropolitaine. Les deux départements sont engagés dans Fast Track Cities Initiative et développent un large programme de prévention combinée « Vers Paris sans sida » (VPSS) et « Objectif sida zéro. Nice et les Alpes-Maritimes s’engagent » (OSZ).

Le programme s’appuie sur l’hypothèse qu’une offre de dépistage du VIH gratuite, proposée dans tous les laboratoires de biologie médicale (LBM) de ville, sans rendez-vous ni prescription préalable et associée à une communication ciblée sur l’offre augmentera de manière significative la couverture du dépistage. Cette offre peut lever certains des multiples freins au dépistage du VIH et faciliter le passage à l’action, en particulier dans des populations clés qui contribuent à la plus grande part de la dynamique de l’épidémie.

Ce programme nouveau dans les conditions d’accès au dépistage a été décidé conjointement par les collectivités territoriales, l’Assurance maladie et les Agences régionales de santé, face à la trop faible augmentation du dépistage malgré la diversification de l’offre et les recommandations de 2010, renouvelées en 2017, en faveur d’un dépistage généralisé et répété dans les  populations clés.

L’expérimentation sera engagée pour 12 mois dans tous les LBM des départements de Paris (n=170) et des Alpes-Maritimes (n=116) dans l’objectif d’augmenter de 15% le volume total des tests réalisés hors de l’hôpital. L’évaluation portera sur le nombre de dépistages réalisés et de nouveaux diagnostics VIH portés, ainsi que sur l’effet de substitution potentiel vis-à-vis de l’offre existante, notamment les CeGIDD (Centre gratuit d’information, de diagnostic et de dépistage) et les actions de dépistage communautaire. Le lien au soin des utilisateurs recevant un test positif sera organisé et évalué. Les caractéristiques des utilisateurs du programme seront recueillies et comparées à celles des usagers se présentant dans les LBM avec une prescription médicale et des usagers de CegGIDD. La faisabilité et l’acceptabilité du programme par les LBM seront évaluées, puis seront menées une analyse du cout-efficacité d’une telle stratégie de dépistage à l’échelle nationale et une estimation de son impact budgétaire.

Le contrat d’initiation doit permettre de préparer l’évaluation du programme, d’affiner les hypothèses épidémiologiques ; de définir les circuits nécessaires à la collecte d’informations ; de créer des procédures et outils de recueil des données ; d’établir des fiches de parcours de soins permettant le recueil systématisé des données depuis le laboratoire jusqu’à la première consultation hospitalière ; enfin de préparer les questionnaires auto-administrés recueillant le profil des usagers du programme d’une part et mesurant la faisabilité du programme auprès des personnels de laboratoires d’autre part ; enfin mettre en place le cadre réglementaire de la recherche.

La décision d’arrêter ou pérenniser le dispositif sera prise à l’issue de l’évaluation de l’objectif principal et le cas échéant, son extension sur le territoire sera prise à l’issue de l’analyse économique.

En dépit d’énormes efforts pour le développement d’un vaccin contre le VIH-1, aucun vaccin n’a réussi pour l’instant à induire des anticorps protecteurs chez l’homme. Malgré de très grandes avancées dans la compréhension des mécanismes conduisant à la génération d’anticorps neutralisants et l’existence de très nombreuses plateformes vaccinales, protéines recombinantes stabilisées, vecteurs viraux, adjuvants innovants, etc, il y a toujours des opportunités pour tester de nouvelles plateformes vaccinales. Par exemple, une nouvelle plateforme vaccinale basée sur l’utilisation d’ARN messagers comme candidats vaccins reste encore sous explorée. Déjà prometteuse et validée dans plusieurs modèles d’infections virales, comme Zika ou influenza, la vaccination par ARN messager se heurte à la difficulté de vectoriser correctement l’ARN messager afin d’amplifier une réponse humorale de longue durée et à large spectre de protection. Les principales raisons sont liées au fait que l’injection d’ARNm induit une forte réponse innée qui peut contrecarrer la réponse adaptative et que l’ARN messager est très instable et peut s’exprimer plus ou moins bien dans une cellule cible. Nous avons récemment développé une plateforme de vectorisation d’ARN messagers, basée sur des nanoparticules biodégradables avec une couronne lipidique (lipoparticules) permettant l’expression d’ARNm dans les cellules dendritiques, après complexation avec un peptide cationique. Nous avons aussi conçu des systèmes de production d’ARN messagers et identifié des séquences stabilisatrices qui permettent une expression stable et de longue durée dans différentes cellules cibles. Dans ce projet, nous proposons d’utiliser ces expertises pour concevoir des formulations vaccinales, utilisant un ARN messager d’enveloppe du VIH-1, basée sur une protéine d’enveloppe stabilisée, et de tester leurs capacités à induire des anticorps neutralisants. Dans ce but, trois objectifs sont poursuivis : 1) Identifier une formulation vaccinale utilisant un ARN messager optimisé, capable de sur-exprimer l’enveloppe SOSIP dans des cellules présentatrices d’antigènes, tout en exposant les épitopes cibles de neutralisation, 2) Tester plusieurs molécules immuno-stimulantes, co-formulées, (Nod2, Sting, IL-21) afin de favoriser l’induction de centres germinatifs dans les ganglions drainant le site d’injection, et ainsi la production d’anticorps de forte avidité, dans un modèle souris, 3) Evaluer la capacité des meilleures formulations à induire des anticorps protecteurs à large spectre (neutralisants et non neutralisants) chez des lapins.

Ce projet, très ambitieux, repose sur un partenariat privilégié entre deux équipes d’expertises très complémentaires. En cas de succès, nous envisageons de tester rapidement chez le primate non humain cette plateforme vaccinale, qui pourrait ainsi être adaptée très facilement à d’autres maladies infectieuses.

La phase aiguë de l’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) est une étape clé dans l’histoire naturelle de la maladie. Caractérisée par des niveaux de réplication virale élevée, cette phase est associée à un risque important de transmission du virus et son évolution est conditionnée par des facteurs viraux et des facteurs liés à l’hôte. Le suivi prospectif et la collecte d’échantillons depuis plus de 10 ans au décours d’hépatites B aiguës a permis d’identifier des clusters de transmission dont un lié au génotype A du virus. La disponibilité de ces échantillons constitue une réelle opportunité pour étudier de manière approfondie les formes virales circulantes au décours de cette entité particulière, en particulier pour ce génotype peu étudié. Notre objectif est de caractériser les formes virales circulantes du VHB au décours de l’hépatite B aiguë. L’approche méthodologique reposera sur la réalisation de gradients de vélocité, technique maitrisée au laboratoire, et l’analyse précise des fractions obtenues au moyen de tests quantitatifs et standardisés disponibles à ce jour. La caractérisation et la quantification des ARN-VHB circulants lors de la phase aiguë, élément  également novateur, sera effectuée à partir des fractions générées après gradient de vélocité. Une analyse moléculaire, après obtention des séquences génomiques virales complètes, par séquençage haut débit dit de nouvelle génération (NGS), permettra d’étudier la quasi-espèce et de conduire des analyses phylodynamiques afin de caractériser les chaînes de transmission. Les profils de gradients générés pour ces patients en phase aiguë pourront être comparés à ceux obtenus pour des patients en phase chronique avec ou sans AgHBe infectés par un virus de génotype A. Ainsi, nous pourrons déterminer si la production des différentes formes virales en début d’infection est sensiblement différente de celle observée alors que l’infection atteint une forme d’équilibre avec l’hôte. Cette étude permettra d’améliorer les connaissances virologiques actuelles sur la phase aiguë de l’infection.