Projets et candidats lauréats

La tuberculose (TB) est l’une des principales causes de décès dans le monde, causée par la bactérie Mycobacterium tuberculosis (Mtb). La compréhension des interactions hôte-pathogène dans la TB aidera à développer de nouvelles thérapeutiques, y compris dirigée contre l’hôte pour lutter contre la résistance aux antimicrobiens. Cependant, ni les cultures cellulaires conventionnelles ni les modèles animaux ne reproduisent la complexité de la TB. Les organoïdes pulmonaires partagent les caractéristiques des poumons humains, constituant ainsi un modèle unique pour étudier les étapes précoces de la TB. L’objectif du projet, initié il y a trois ans et déjà couronné de succès avec deux articles soumis, est d’adapter la technologie des organoïdes avéolaires dans le contexte de la TB pour déchiffrer les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la translocation de Mtb dans le tissu pulmonaire. Ce modèle sera extensible au criblage de nouvelles molécules pharmacologiques.

La transmission hétérosexuelle de l’homme à la femme est la principale voie de transmission des infections sexuellement transmissibles (IST) et se produit via les muqueuses du tractus reproducteur féminin (TRF). Le TRF est composé d’un tractus supérieur et d’un tractus inférieur qui diffèrent par leur architecture. Le tractus inférieur du TRF (vagin/endocol) est composé d’un épithélium pluristratifié contrairement au tractus supérieur. Différents facteurs environnementaux sont présents dans le TRF, notamment le sperme, suite à un rapport hétérosexuel, et le microbiote vaginal. Le sperme est l’un des principaux vecteurs des IST et est composé de facteurs capables d’inhiber ou d’augmenter la susceptibilité aux IST dans le TRF. La composition du microbiote vaginal peut influencer l’inflammation locale, entraînant une modulation de la susceptibilité aux IST. Chlamydia trachomatis (CT) est une bactérie à Gram négatif, responsable d’une IST, qui infecte principalement les cellules épithéliales cervicales. CT induit une inflammation locale qui peut entraîner des séquelles graves, notamment l’infertilité.

Les modèles in vitro simples composés d’une monocouche de cellules sont très utiles pour comprendre le rôle de facteurs dans un environnement spécifique, cependant, ces modèles ne tiennent pas compte de l’environnement complexe d’un tissu. La muqueuse du TRF est un environnement composé de différents types de cellules mais aussi de facteurs solubles qui interagissent les uns avec les autres, par conséquent, de nouveaux modèles capables de reproduire l’environnement in vivo sont nécessaires. De nouveaux modèles sont actuellement disponibles, tels que les modèles d’épithélium en 3D, les organoïdes ou les organes sur puces.

EpiVaginal est un modèle composé d’un épithélium pluristratifié obtenu à partir de cellules épithéliales primaires de donneurs sains. Il s’agit d’un modèle commercialisé auquel des fibroblastes et des cellules de Langerhans peuvent être ajoutés. Ce modèle peut produire du mucus, du glycogène et réagir à la stimulation hormonale. Des études sur la santé du TRF (microbiote, sperme ou infection par le VIH-1) ont été réalisées à l’aide de ce modèle. Ce modèle pourrait être très utile pour mieux comprendre les facteurs pouvant inhiber ou favoriser la susceptibilité aux IST.

Les objectifs de ce projet sont donc d’établir et de valider un modèle EpiVaginal en 3D adapté à l’infection par CT et à l’évaluation de l’effet des facteurs environnementaux sur la susceptibilité aux IST. Tout d’abord, le modèle EpiVaginal sera caractérisé pour évaluer l’architecture globale, la production de glycogène, la perméabilité et la polarisation de l’épithélium, les marqueurs cellulaires et la production de mucus. Une fois le modèle validé, l’infection par CT sera réalisée à différentes doses. L’infection sera suivie par immunofluorescence et qPCR, tandis que la production de cytokines sera mesurée dans les surnageants apicaux et basolatéraux. Ensuite, l’effet du liquide séminal (LS), la fraction acellulaire du sperme, sera testé sur l’infection CT et l’inflammation. Par la suite, le modèle EpiVaginal avec les cellules de Langerhans sera utilisé en chambre double pour étudier l’infection par le VIH-1. En effet, les PBMC seront ensemencées dans le compartiment basolatéral. La perméabilité de la barrière épithéliale, l’infection par le VIH-1 et la concentration en cytokines seront évaluées.

Ce projet nous permettra de valider ce modèle en tant qu’outil précieux pour l’étude de l’infection à CT et de l’impact des facteurs environnementaux tels que le sperme ou la composition du microbiote vaginal sur l’infection à CT et/ou au VIH-1.

Depuis la découverte du VIH comme agent causal du SIDA en 1983, un long chemin a été parcouru dans la compréhension de la réplication du virus ce qui a permis le développement d’antiviraux efficaces. Bien que nous soyons aujourd’hui capable de limiter la transmission du virus et l’évolution de la maladie, la présence d’un réservoir viral archivé au sein des cellules du patient ainsi que les problèmes de résistance aux traitements posent de vrais problèmes de santé publique. Les procédures actuelles de suivi des mutations de résistance sont basées sur la technologie Sanger, standard très largement accessible, peu coûteuse et ne nécessitant que de très peu de ressources informatiques. La limite technologique du séquençage à quelques centaines de bases oblige la mise en place de réactions indépendantes multiples pour couvrir toutes les régions d’intérêts, et ne permet de distinguer que les formes majoritaires. A l’inverse, les technologies de séquençage nouvelle génération permettent de faire un séquençage du génome entier avec une très grande profondeur de lecture à partir de fragments de petites tailles (150 bases). Toutefois, l’accès aux variants minoritaires se fait ici au sacrifice du cout et de la lourdeur de l’analyse bio-informatique qui en découle. Ces technologies ont également été employées avec succès pour étudier les sites d’intégration du virus dans le génome cellulaire. Cependant, c’est un procédé lourd (grand nombre d’étapes de biologie moléculaire) et seule une petite fraction des sites d’intégration sont in fine analysables du fait même de la technologie. En effet, la petite taille des fragments ne permet pas de séquencer plus de quelques dizaines de bases du génome humain. Il est alors extrêmement difficile de repositionner sans ambiguïté le site d’intégration, notamment lorsque celle-ci se trouve dans des régions répétées du génome humain.

Le projet présenté propose de mettre en place une méthodologie permettant de séquencer le provirus en seulement quelques étapes simples, rapides et peu couteuses (moins de 2 heures contre plus de 3 jours actuellement). Pour cela, nous proposons d’associer la technologie Nanopore de séquençage de grands fragments à un procédé d’enrichissement basé sur le ciblage par la Cas9 sans aucune étape d’amplification et seulement une étape de purification. Cette méthode doit permettre de produire des données de séquençage génome entier associé à une identification sans ambiguïté du site d’intégration. Ce nouveau procédé de séquençage direct (sans amplification PCR) devrait de plus permettre d’accéder au statut de méthylation de l’ADN proviral archivé et de son environnement cellulaire. Ces données impossibles à obtenir actuellement sont clés pour comprendre la dormance virale. Ce développement technologique permettra donc à tout un chacun de faire le séquençage soit même en quelques heures et avec seulement très peu d’investissement financier pour une avancée majeure dans l’étude de la latence virale, de la relation intégration/cancer, et peut-être de se rapprocher de l’objectif « Cure HIV ».

Le projet METEOR est axé sur l'exploration de l'exométabolome de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) afin de comprendre son rôle dans l'adaptation et la virulence de cette bactérie pathogène. Bien que l'exométabolome joue un rôle crucial à l'interface hôte-pathogène, aucune analyse approfondie et systématique de l'exométabolome de Mtb n'a été réalisée jusqu'à présent. Les données préliminaires indiquent que Mtb sécrète une large variété d'intermédiaires métaboliques dans son environnement, ce qui pourrait être crucial pour influencer les interactions hôte-pathogène.

Le projet a trois principaux objectifs. Premièrement, il vise à réaliser la première caractérisation sans a priori de l'exométabolome de Mtb sous diverses conditions de stress. Cela impliquera l'identification des exométabolites libérés lors des différentes réponses au stress, révélant ainsi des mécanismes d'adaptation de Mtb. Deuxièmement, le projet se concentrera sur l’élucidation des voies de biosynthèse de ces exométabolites clés, qui sont essentielles pour l'adaptation de Mtb aux stress. Troisièmement, le projet examinera comment ces métabolites affectent la virulence de Mtb en utilisant des modèles in vitro (macrophages) et in vivo(modèle murins). Cela impliquera le ciblage d'enzymes spécifiques au sein de ces voies pour comprendre leur impact sur la virulence de Mtb.

Pour atteindre ces objectifs, le projet METEOR utilise une combinaison d’approches de métabolomique basée sur la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la spectrométrie de masse (SM). Cette approche bénéficie de la facilité expérimentale d'accès à l'exométabolome par rapport aux métabolites intracellulaires et, de la capacité à identifier les métabolites abondants dans l’exométabolome grâce aux techniques de RMN et de SM.

Le projet est divisé en trois workpackages (WPs). Dans le WP1, l’étude se concentre sur une analyse approfondie de l'exométabolome de Mtb, incluant l'identification et la quantification des métabolites libérés sous diverses conditions de stress. Dans le WP3, l’étude vise à moduler la production et l'excrétion des métabolites en modifiant génétiquement les réseaux métaboliques de Mtb, en créant des mutants pour tester les effets sur les profils métaboliques et l'activité métabolique. Enfin, dans le WP3, le rôle de ces métabolites dans la virulence de Mtb est exploré en testant leur impact sur des macrophages infectés et des modèles murins. Cela inclut l'évaluation de la fitness des souches de Mtb et de la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection.

Le projet METEOR fournira donc une vision unique sur le fonctionnement du réseau métabolique de Mtb et les interactions hôte-pathogène, offrant l’opportunité d'identifier de nouvelles cibles pour des thérapies anti-TB innovantes.

Différents processus cellulaires controlant la stabilité de l’ARN peuvent avoir de effets sur la réplication virale. C’est notamment le cas du nonsense mediated mRNA decay (NMD) qui dégrade les ARN messagers présentant un codon stop dans un contexte atypique. Récemment, la caractérisation des ARN retroviraux comme des cibles potentielles du NMD nous a amené à nous demander comment ces retrovirus arrivent à contourner cette menace et comment cela peut modifier l’expression des genes cellualires : une cis-inhibition du NMD qui n’impacte que l’ARN viral et/ou une trans-inhibition du NMD qui modifie également la stabilité des ARN cellulaires. Dans le cas du VIH, l’ARN viral semble globalement protégé mais nous ne savons pas encore ce qui empeche le NMD de cibler cer ARN. De plus, il n’a jamais été demontré si l’expression du VIH peut moduler l’efficacité du NMD en trans, affectant alors les ARN cellulaires et comment cela se traduit sur les voies associées que sont le splicing alternatif et la traduction.  

Dans ce programme de recherche nous prévoyons de démontrer tout d’abord que le NMD est sensible à l’expression du virus VIH en mesurant la stabilité des ARN et les niveaux de protéines traduites dans des cellules. Pour ce faire, nous utiliserons des ARN rapporteurs sensibles au NMD que nous avons déjà largement utilisés dans le passé. Dans un second temps, nous décrirons le mécanisme d’inhibition après avoir identifié son effecteur viral.Chaque protéine d’VIH sera testée seul ou en combinaison. Des résultats préliminaires ont déjà montré que Rev peut inhiber le NMD. Sur la base de ce travail et notre connaissance de l’autre rétrovirus humain HTLV  (notamment de l’homologie entre Rev et HTLV-1 Rex), nous suspectons que l’inhibition dependante de Rev soit liée à son activité de transfert nucléo-cytoplasmique à travers son interaction avec CRM1. La caractérisation de l’effet de Rev sera aussi analysé du point de vue des facteurs du NMD : en utilisant des protéines mutantes et des drogues déjà décrites, nous pourrons definirà quelle(s) etape(s) du nmd VIH manipule. dans la troiseme partie du projet, nous voulons cribler  les arn dont la dérégulation est liée 0 l’inhibition du NMD. La caractérisation des ½ vies des ARN cellulaires srea réalisée par RNAseq dans des cellules exprimant Rev. Nous avons déjà mis au point cette procédure pour des analyses similaires avec des portéines d’HTLV-1 au laboratoire.  De ces résultats de RNAseq et en utilisant des outils de bioinformatique developpées par d’autres équipe du LBMC, nous analyserons l’impact de cette inhibition du NMD sur le splicing alternatif. Finallement nous réaliserons des ribosomes footprintings afin de corréler la dérégulation du NMD à une possible modification de l’éfficacité traductionnelle.

Des résultats préliminaires ont déjà validé Rev comme inhibiteur du NMD. Ainsi, dès le début du projet, nous pourrons commencer à travailler sur 2 axes en parallèle : la description du mécanisme d’inhibition et l’identification des cibles NMD cellulaires en RNAseq.

activateurs de l’immunité innée. Une fois reconnus par des récepteurs cytosoliques, ils déclenchent la production de cytokines pro-inflammatoires et d’interférons. La voie de signalisation reposant sur les protéines cGAS et STING a été identifiée comme essentielle pour la détection des acides nucléiques cytosoliques. Néanmoins, nous avons pu montrer que, dans des cellules dépourvues de cGAS, la présence d’ADN double brin cytosolique peut induire la production d’interférons. Cela indique la présence de voies de détection des acides nucléiques qui opèrent en l’absence de cGAS. Nous avons identifié qu’en l’absence d’une voie cGAS-STING active, des protéines appartenant à la voie de réparation de l’ADN par jointure d’extrémités non-homologues (ou « non-homologous end-joining » (NHEJ)), en particulier PRKDC et PAXX, jouent un rôle majeur dans la détection des ADNs double brins cytosoliques. En effet, des analyses biochimiques et fonctionnelles montrent que l’activité catalytique de la protéine PRKDC est nécessaire pour les réponses inflammatoires indépendantes de cGAS et que PAXX est un régulateur négatif de ces réponses. Nous proposons d’étudier la contribution de la voie du NHEJ, et en particulier de PAXX, aux réponses inflammatoires associées au VIH-1.

Sur la base de nos données préliminaires, j’émets l’hypothèse qu’en absence de cGAS, l’ADN double brin dérivé du VIH-1 peut être détecté par la voie du NHEJ et que PAXX régule négativement  cette voie de signalisation. Pour tester cette hypothèse, nous poursuivrons 3 objectifs:

1. Caractériser les déterminants du recrutement du NHEJ sur l’ADN double brin cytosolique en absence de cGAS.
2. Évaluer la contribution du NHEJ et en particulier de PAXX sur la détection immunitaire innée dans les cellules qui n’expriment pas cGAS.
3. Étudier l’impact des composantes du NHEJ sur la réponse inflammatoire associée au VIH-1.

La réalisation de ces objectifs me permettra de démontrer que les protéines du NHEJ, en particulier PAXX, sont des régulateurs clés des réponses inflammatoires associées au VIH-1. Ceci est d’autant plus intéressant car les traitements actuels qui visent à réduire l’inflammation associée aux acides nucléiques ciblent principalement la voie de signalisation associée à cGAS. Cependant, nos données montrent que lorsque cGAS est absent, la voie du NHEJ déclenche des réactions inflammatoires qui peuvent avoir des effets délétères supplémentaires. L’inhibition de l’activité catalytique de PRKDC peut bloquer cette réponse inflammatoire indépendante de cGAS. En conséquence, ce projet permettra de mettre en lumière de nouvelles voies pour moduler ou prévenir l’inflammation associée au VIH-1.