Projets et candidats lauréats

L’hépatite B chronique (HBC) est un problème majeur de santé publique affectant 300 millions d’individus de par le monde et est la cause majeure de l’insuffisance hépatique, de la cirrhose et du carcinome hépatocellulaire. En raison de la persistance de l’ADN circulaire clos de façon covalente (ADNccc) du virus de l’hépatite B (VHB), une guérison complète par les traitements actuels n’est pas possible. De nouvelles stratégies sont requises pour le traitement du VHB, incluant l’identification de biomarqueurs sériques représentatifs de l’activité de la molécule d’ADNccc intrahépatique, afin d’améliorer la prise en charge des patients et le développement de nouveaux traitements antiviraux. De nombreuses données convergent vers l’idée que les ARN circulant du VHB (cirB-ARN) pourraient servir de biomarqueurs sériques de l’infection par le VHB, de son traitement et de son pronostic. En revanche, la nature de ces ARNs et des particules les contenant in vivo et in vitro font actuellement l’objet de débat.

            Ce projet, destiné à financer la thèse de doctorat associée, ambitionne de profiler les protéines associées aux vésicules extracellulaires sécrétées dans des hépatocytes infectés ou non par le VHB, dans des échantillons de patients chroniquement infectés, et d’évaluer l’effet de traitements par analogues de nucléot(s)ides sur le protéome sécrété. Cela permettra la génération d’un jeu de donnée sans précédent qui orientera le choix de protéines cibles pour une analyse mécanistique en profondeur. Une meilleure connaissance des mécanismes contrôlant la sécrétion des ARNs d’HBV selon les phases de l’hépatite B chronique aidera à comprendre la valeur diagnostique du biomarqueur et participera au développement d’outils de diagnostic dédiés.

L’absence d’un modèle animal pertinent pour étudier le virus de l’hépatite C (VHC) entrave les recherches sur la persistance et la pathogénèse de l’infection par ce virus. Les hepacivirus animaux homologues pourraient fournir chez leur hôte naturel des modèles de substitution utiles, dans la mesure où ce sont des modèles immunocompétents présentant une infection virale robuste. Récemment, l’équipe du Dr Ian Lipkin a isolé un hepacivirus chez des rats sauvages (Rattus norvegicus), nommé RHV-rn1. Le RHV-rn1 partage avec le VHC plusieurs caractéristiques clés : hépatotropisme, forte propension à persister sous la forme d’une infection chronique à long terme et capacité à induire des lésions hépatiques progressives, telle que la stéatose.

Nous développons actuellement des travaux sur l’induction d’une stéatose hépatique non alcoolique (NASH) chez le rat, basée sur l’utilisation de régimes riches en graisses et sucres chez les animaux. Ce modèle de NASH chez le rat pourra ainsi être mis à profit à terme pour étudier les rôles cumulés de l’infection chronique du foie par cet hepacivirus et de régimes riches en graisses et sucres dans le développement d’une stéatose hépatique et de perturbations multiples du métabolisme lipidique. L’efficacité sur ce modèle de rat d’antiviraux à action directe (AAD), actuellement prescrits chez les patients infectés par le VHC, sera testée. Ceci permettra de proposer un modèle in vivo de foie infecté, puis débarrassé du virus, modèle très utile pour étudier les altérations potentielles induites par l’hepacivirus sur son organe hôte et particulièrement sur le métabolisme lipidique. Une telle étude de ces aspects physiopathologiques de l’infection virale par le virus de l’hépatite C n’a jamais été réalisée jusqu’alors à l’aide d’un modèle animal, et le projet est donc très original.

Ce nouveau modèle animal a suscité l’attention des groupes de travail « HCV et métabolisme lipidique » et « Interactions virus/cellules » de l’AC42 de l’ANRS, autour de l’intérêt de ce modèle pour développer des travaux de recherche originaux sur la perturbation du métabolisme lipidique induit par le VHC, et tout particulièrement la stéatose hépatique.

L’objectif de ce contrat d’initiation est donc de mettre en place le modèle de l’hepacivirus de rat en France et de mettre en évidence l’intérêt de ce modèle animal de substitution pour une meilleure compréhension de la pathogenèse de l’hépatite C chronique.

Les hypothèses de travail reposent sur le fait que ce modèle animal original pourrait constituer à terme un excellent modèle de substitution pour étudier les perturbations du métabolisme lipidique induites par le virus de l’hépatite C, et encore plus particulièrement des perturbations engendrées par l’association du virus avec des co-facteurs tels que des régimes alimentaires riches en graisse et en sucres, et/ou la consommation d’alcool.

Le modèle sera développé dans des rats Spague Dawley males inoculés par injection intrahépatique d’ARN synthétique de RHV rétrotranscrit à partir du clone moléculaire RHC-rn1. Les animaux seront suivis pour leur charge virale sérique et hépatique et des analyses histologiques et biochimiques seront effectuées sur tissus hépatiques, avec une attention particulière pour les perturbations du métabolisme lipidique. Une partie des rats inoculés sera traitée par des antiviraux à action directe.

A terme, ce modèle sera mis à disposition de la communauté ANRS et pourra être utilisé pour développer des travaux de recherche collaboratifs originaux.

Les anticorps neutralisants à large spectre (bNAbs) se développent chez des patients infectés par le VIH-1 (VIH) suivant un processus de co-évolution avec le virus se diversifiant. La génération des bNAbs par les cellules B nécessite plusieurs cycles de maturation d’affinité du récepteur des cellules B (BcR). Les cellules T CD4+ folliculaire (Tfh) contrôlent cette maturation du BcR. Les interactions entre les cellules B et les Tfh reposent sur la reconnaissance par les lymphocytes T de peptides présentés par les molécules du CMH-II exprimées par les lymphocytes B. Ainsi, la présentation de l’antigène par les cellules B est nécessaire pour qu’elles reçoivent de l’aide des Tfh spécifiques de l’antigène, et ainsi pour générer des bNAbs.

Nous proposons de caractériser les étapes limitantes de la présentation de l’antigène restreint par le CMH-II par les cellules B: de la capture de l’antigène par le BcR à l’activation des lymphocytes T. Nous étudierons l’impact de la spécificité et de l’affinité du BcR sur (i) la cinétique d’internalisation du virus entier et de Env, (ii) les voies de dégradation et la nature des compartiments de chargement des CMH-II et (iii) la qualité de l’activation des cellules T CD4 + spécifiques du VIH.

Pour cela, nous établirons deux modèles innovants pour étudier la présentation des antigènes par les lymphocytes B spécifiques du VIH aux cellules T CD4 + anti-VIH. Premièrement, nous créerons un panel de lignées de cellules B exprimant de manière stable des bNAbs recombinants ancrés à la membrane. Nous avons choisi des bNAbs ayant différentes spécificités et affinités pour Env. Afin de comprendre l’influence de la présentation de l’antigène par le BcR sur la sélection des cellules B par les cellules T, nous clonerons également sous forme de BcR des immunoglobulines de la lignée germinale. Deuxièmement, pour étendre les données obtenues avec des BcR recombinants, nous générerons une bibliothèque de clones de cellules B primaires spécifiques de Env. Ces cellules B spécifiques de Env seront triées à partir du sang de contrôleurs élites (ECs, de la cohorte Codex) et la spécificité et l’affinité de leurs BcR caractérisées. Sur la base de nos travaux antérieurs, nous sélectionnerons des ECs avec une fréquence élevée de cellules B mémoires spécifiques de Env et présentant un large potentiel de neutralisation croisée.

Plus spécifiquement, nous comparerons les cellules B exprimant des BcR ayant différentes affinités (y compris les BcR de la lignée germinale) dans leur capacité à activer des clones de lymphocytes T CD4 + spécifiques de Env et de Gag. Nous analyserons la capacité des BcRs reconnaissant différents domaines de Env à présenter des épitopes distincts aux clones T CD4 + spécifiques de Env. Nous étudierons si, en fonction de l’affinité et / ou de la spécificité, un seul BcR peut favoriser la présentation d’un épitope restreint au CMH-II tout en supprimant la présentation d’autres. Nous utiliserons des virus pseudotypés avec Env d’isolats primaires. En utilisant l’imagerie, la cytométrie de flux et des inhibiteurs spécifiques, nous définirons les mécanismes sous-jacents, notamment l’influence de l’affinité et / ou de la spécificité du BcR sur l’acheminement du complexe BcR-antigène dans différents compartiments de chargement (les endosomes précoces, tardifs ou autophagosomes). En fonction des compartiments de chargement de l’antigène, un répertoire différent d’épitope du CMH-II est probablement généré, avec un impact sur l’activation des cellules T.

Ces résultats permettront de concevoir de nouveaux immunogènes afin d’améliorer les interactions des cellules B et T, de soutenir l’aide des cellules T et in fine d’accélérer la génération de bNAbs. Les banques de clones de cellules B spécifiques au VIH offriront également la possibilité de sélectionner des vaccins candidats capables de fixer des BcR spécifiques du VIH et d’activer des réponses T auxiliaires CD4 + appropriées, fournissant de puissants moyens d’information pour concevoir des vaccins induisant des anticorps.

En plus des lymphocytes T CD4+, les macrophages sont des cellules cibles essentielles du VIH-1 impliquées dans toutes les étapes de la pathogenèse du VIH-1 et dans l’établissement de réservoirs viraux persistants, représentant ainsi une source de rebond de la virémie après l’arrêt des traitements. Il est donc crucial de mieux comprendre comment les macrophages, en particulier les macrophages tissulaires qui sont fortement résistants à l’infection par du virus libre, peuvent être infectés par le VIH-1. Contrairement à l’infection par du virus libre, la transmission du virus intercellulaire représente le mode dominant d’infection in vivo. Nos équipes de l’IPBS, Toulouse (dirigées par C. Vérollet et R. Poincloux, et O. Neyrolles) ont récemment démontré que le VIH-1 peut être efficacement transféré in vitro 1/ entre les macrophages par des nanotubes membranaires et 2/ des lymphocytes T infectés vers les macrophages par un processus de fusion cellulaire hétérotypique. Ces deux processus conduisent à la formation de macrophages géants multinucléés hautement productrices de virus. En réponse à l’environnement local en cytokines et en fonction de leur localisation tissulaire, les macrophages présentent une grande hétérogénéité et ils peuvent être dérivés vers un large spectre de polarisation et de profils métaboliques. L’activation des macrophages étant un aspect clé de la pathogenèse du VIH-1, il est très intéressant d’étudier comment le profil d’activation des macrophages dicte leur capacité à être infectés par le VIH-1 par transfert interellulaire. Nous émettons l’hypothèse que l’environnement des macrophages module la manière dont ces cellules sont infectées par le transfert de virus à partir de macrophages infectés ou de lymphocytes T CD4+ infectés. Comme la tuberculose (TB) est une condition aggravante de la pathogenèse du VIH-1 et une cause de décès liés au SIDA, nous souhaitons mieux caractériser comment le microenvironnement associé à la TB pulmonaire augmente la susceptibilité des macrophages au VIH-1, conduisant à une synergie mortelle entre ces deux pathogènes. Ainsi, l’objectif général de ce projet est de comprendre comment les profils d’activation des macrophages modifient leur infection par le VIH-1 par transfert, en particulier pour les macrophages tissulaires et dans le contexte d’une co-infection avec Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agent de la TB. L’objectif 1 consistera à étudier l’impact de la polarisation des macrophages sur le transfert du VIH-1 par fusion cellulaire en utilisant des modèles in vitro de macrophages dérivés de monocytes polarisés avec des cocktails de cytokines ainsi qu’un modèle de macrophages tissulaires (amygdales humaines). L’objectif 2 consistera à étudier les mécanismes moléculaires nécessaires au transfert viral et à la dissémination dans les macrophages dans différents contextes d’activation, en se concentrant sur l’implication du métabolisme des macrophages et sur le rôle de récepteurs cellulaires spécifiques impliqués dans le transfert du VIH-1 ou la fusion cellulaire. Enfin, l’objectif 3 examinera comment la TB module le transfert du VIH-1 vers les macrophages. Ici, nous aurons l’opportunité d’étendre notre étude aux macrophages alvéolaires humains qui sont la cible principale de Mtb et du VIH-1 dans le poumon.

Ce projet de recherche permettra d’acquérir de nouvelles connaissances fondamentales sur le rôle des macrophages dans la pathogenèse du VIH-1 en décryptant le(s) mécanisme(s) cellulaire(s) et moléculaire(s) qui contribuent à l’infection de ces cellules réservoirs, en particulier dans le contexte de la co-infection VIH/Mtb.

La tuberculose est la 1ère cause de mortalité par maladies infectieuses dans le monde. En 2018, 10 millions de personnes ont contracté cette maladie et 1,5 millions en sont mortes. Cette même année, l’OMS a estimé à 484 000 le nombre de nouveaux cas présentant une résistance à la rifampicine. En République Démocratique du Congo (RDC), les données OMS de 2018 indiquaient une incidence de la tuberculose de 321/100000 habitants avec près de 6000 cas de résistance à la rifampicine. On estime que dans ce pays, seulement 63% des patients infectés de tuberculose ont pu bénéficier d’un traitement grâce au plan national de lutte contre la tuberculose (PNLT).

En Europe, l’approche plus globale de son dépistage intégrant les potentiels réservoirs d’animaux sauvages ou domestiques, a permis de mieux appréhender cette maladie zoonotique. Cette pathologie fait partie dans certains pays africains, des zoonoses prioritaires puisqu’elle représente une menace pour la santé publique humaine et animale. En effet, la tuberculose liée à Mycobacterium tuberculosis a pu être isolée chez des singes en Afrique équatoriale ou à Mycobacterium bovis chez les bovins comme en Afrique du Sud ou au Nigéria. La cohabitation entre population humaine et animaux d’élevage ou sauvages peut ainsi représenter des évènements de transmissions inter espèces de certaines souches responsables de la tuberculose. L’approche « One Health » est particulièrement pertinente dans cette pathologie et reste peu étudiée.

Dans la province du Sud Kivu à l’Est de la RDC, le Parc National Kahuzi Biega (PNKB) est le refuge de nombreuses espèces de primates. Aux abords de ce parc, le village de Lwiro regroupe trois structures : le Centre de Recherche en Sciences Naturelles (CRSN), un hôpital rural (CHL), et le Centre de Réhabilitation des Primates de Lwiro (CRPL). Le CRSN possède un laboratoire de biologie où sont réalisés les examens bactériologiques du CHL et du CRPL. Le CRPL a pour mission de soigner, de protéger et de réhabiliter des primates d’Afrique centrale, victimes de braconnage. Enfin le CHL est la seule structure de soin primaire disponible dans cette zone rurale. De nombreux habitants du village de Lwiro travaillent ainsi dans l’une de ces trois structures ou dans l’élevage bovin. Les interactions humaines et animales y sont donc très importantes. Alors que cette maladie a été diagnostiquée fin 2010 chez deux chimpanzés hébergés au CRPL, aucun programme de surveillance de cette maladie n’a encore été mis en place dans cette région.

Ce projet a pour but d’étudier l’épidémiologie de la tuberculose au niveau zoonotique («One Health») dans cette région de Lwiro. La prévalence de la tuberculose dans cette zone rurale sera évaluée sur la population humaine ainsi que sur différentes populations d’animaux sauvages et domestiques. L’analyse des liens éventuels de contaminations inter-espèces, par analyses génétiques des souches de mycobactéries retrouvées, sera réalisée. Cette étude s’appuyera sur les structures multidisciplinaires du CRSN, du CRPL, du CHL et du PNKB (Equipe B). Le CRSN effectuera la recherche des mycobactéries sur divers prélèvements en fonction des populations (crachats, LBA, selles, lait) par examen direct sur lame après coloration à l’auramine et par PCR. Tous les prélèvements retrouvés positifs à l’un des 2 examens seront envoyés au laboratoire NSB3 de l’hôpital Avicenne (Equipe A) pour une mise en culture des échantillons afin de réaliser le séquençage du génome complet des souches par technique NGS. Ce séquençage permettra de mettre en évidence par analyses phylogénétiques des liens éventuels de transmissions de la maladie entre les différentes espèces étudiées ainsi que la mise en évidence des mutations de résistance aux antituberculeux. Ce projet permettra également d’améliorer et de pérenniser le diagnostic de la tuberculose dans cette région avec le soutien du PNLT. Toutes les données qui seront recueillies au cours de ce projet répondront au besoin urgent d’établir le périmètre de présence de la tuberculose au sein des différentes populations et d’influencer les politiques de lutte et prévention contre la maladie sur un modèle de « One Health ».