Projets et candidats lauréats

Les virus influenza A (IAV) sont responsables d’épidémies saisonnières et, plus rarement, de pandémies aux conséquences sanitaires et économiques majeures. Leur génome segmenté en huit ARN viraux (ARNv), formant des ribonucléoprotéines (vRNPs), permet le brassage de gènes par réassortiment lors de co-infections, ce qui produit de nouveaux génotypes potentiellement pandémiques.

Le réassortiment génétique est étroitement lié à l’incorporation sélective du génome dans les virions, guidée par des interactions ARNv-ARNv spécifiques entre segments, donnant lieu à une organisation structurée et flexible des vRNPs au sein des virions. Toutefois, la nature et l’importance fonctionnelle de ces interactions est sous-documentée et les règles de compatibilité entre segments restent largement inconnues, ce qui rend la prédiction des événements de réassortiment quasi impossible. Alors qu’en théorie le réassortiment entre deux IAV peut donner lieu à 256 génotypes, seuls certains sont effectivement détectés, suggérant que des incompatibilités entre segments contraignent le réassortiment. Comprendre ces mécanismes est essentiel, dans un contexte de propagation des virus aviaires H5N1 de clade 2.3.4.4b susceptibles de réassortir avec des IAV humains ou porcins et de générer des souches pandémiques.

Décrypter les règles qui sous-tendent les interactions ARNv-ARNv permettrait d’anticiper le risque pandémique. Le projet Flu-PREDICT vise à identifier les déterminants de la compatibilité entre segments à partir de données expérimentales à haut-débit couplées à des approches de machine learning (ML). Il s’articule autour de quatre objectifs : 

1. Développer et affiner des modèles de ML pour les interactions ARNv-ARNv, entraînés sur la base de la variabilité naturelle des séquences virales et de données expérimentales;
2. Analyser à haut débit le réassortiment, la structure des ARNv in situ ainsi que leur (co)-localisation à l’échelle de la cellule infectée, afin de documenter le réassortiment entre un virus H5N1 et un virus humain H1N1, et d’alimenter et affiner les modèles d’apprentissage automatique;
3. Identifier les déterminants nucléotidiques gouvernant la co-ségrégation des segments HA et M des virus H5N1, par modélisation générative et validation expérimentale;
4. Exploiter cette approche hybride ML-validation expérimentale pour prédire et valider les interactions clés entre ARNv de virus IAV aviaires et mammifères pertinents au regard du risque pandémique.

Le projet est innovant de par l’usage combiné de modèles statistico-physiques et de stratégies d’apprentissage actif pour prédire les séquences impliquées dans l’incorporation spécifique du génome et l’effet de mutations sur ce processus. Les modèles seront alimentés par des données expérimentales générées par des technologies de pointe développées au sein du consortium, notamment (i) une plateforme de microfluidique en gouttes pour le séquençage de virus individuels, (ii) la recherche des séquences impliquées dans les interactions ARNv-ARNv via une cartographie comparative des huit segments dans les particules virales ou les cellules infectées, et (iii) une quantification des fréquences et compositions des intermédiaires d’assemblage du génome dans les cellules.

Flu-PREDICT fera progresser notre compréhension des règles qui gouvernent l’incorporation et le réassortiment du génome des IAVs, notamment entre virus aviaires et mammifères. Il permettra de prédire les compatibilités entre ARNv et les probabilités de réassortiment, y compris pour de nouvelles souches virales, renforçant ainsi les outils d’évaluation du risque pandémique de l’OMS et du CDC. Les technologies développées permettront également d’envisager une surveillance exhaustive des IAVs, sans connaissance préalable des séquences recherchées. Ceci s’inscrit pleinement dans la stratégie du PEPR MIE pour accélérer les connaissances sur les maladies infectieuses émergentes et renforcer la préparation proactive aux futures pandémies.

Les virus influenza A (IAV) sont responsables d’épidémies annuelles entraînant de 3 à 5 millions de cas de maladies respiratoires aiguës et 250 à 500 000 décès. Du fait de l’existence d’un réservoir animal, ils présentent aussi un potentiel zoonotique et pandémique. Les virus H5N1 aviaires sont particulièrement menaçants, en raison de leur taux de létalité élevé chez l’homme (> 50%), et de leur capacité à infecter plusieurs espèces de mammifères, tant dans des environnements naturels qu'agricoles. Une meilleure connaissance des mutations d’adaptation à l’homme est nécessaire pour améliorer la surveillance des virus circulants, prévenir l’émergence de virus pandémiques, et développer de nouvelles stratégies antivirales.

Les IAV présentent un génome segmenté, constitué de huit brins d'ARN de polarité négative, chacun complexé avec des nucléoprotéines (NP) et une polymérase virale (FluPol, un hétérotrimère PB1-PB2-PA). La FluPol et la NP assurent la transcription/réplication du génome viral dans le noyau des cellules infectées. De nombreuses mutations adaptatives se concentrent à la surface de PB2, en particulier la mutation E627K qui, chez un virus aviaire, permet d’augmenter l'activité de la FluPol dans le contexte de cellules humaines. Ces mutations confèrent une adaptation à une famille de protéines cellulaires détournée par le virus, les protéines ANP32, qui comportent un long domaine intrinsèquement désordonné (IDR) à leur extrémité C-terminale, dont la longueur et la séquence diffèrent d’une espèce à l’autre.

Au cours de l'infection virale, l'IDR d'ANP32, interagit avec FluPol et NP, en développant des interactions physiquement distinctes en fonction de l'espèce. Alors que l'ANP32 aviaire lie les deux protéines sur des sites de liaison adjacents, dans l'ANP32 humaine cette interaction est multivalente, ce qui signifie que plusieurs motifs échangent rapidement leur liaison entre FluPol et NP, maintenant les protéines virales à proximité comme une colle moléculaire. Les différences entre les domaines désordonnés des différentes ANP32 déterminent donc leur capacité à promouvoir la réplication virale dans la présence de différents mutations adaptatives de PB2. Les mécanismes déterminant pour cette spécificité seront étudiés dans ce projet.

Le désordre intrinsèque des protéines joue une fonction essentielle dans les mécanismes de réplication virale. Or, il peut s’avérer difficile, voire impossible, de caractériser cette fonction à l'aide des méthodes classiques de la biologie structurale, et ce malgré les progrès récents de la microscopie électronique (ME), car les IDR sont trop dynamiques pour être visualisées. En revanche, la spectroscopie RMN, combinée à d'autres technologies d'étude des protéines en solution, permet de suivre la structure, la dynamique et la fonction moléculaire des IDR à une résolution atomique, d'identifier des interactions faibles mais fonctionnelles.

Nous utiliserons les méthodes d'étude des protéines en solution, notamment la RMN, en combinaison avec la ME et des approches cellulaires, pour fournir une description approfondie du rôle du désordre des protéines virales et cellulaires dans le cycle de transcription-réplication de l'ARN des IAV, avec un accent particulier sur le rôle des IDR de la famille des protéines ANP32 d’origine humaine et animale. De plus, nous exploiterons une banque d’IDR du protéome humain pour identifier de nouveaux IDR cellulaires interagissant avec la FluPol et/ou la NP. Certains d’entre eux seront étudiés en détail par des approches biophysiques, biochimiques et cellulaires.

Nous nous appuierons sur les données obtenues pour développer de nouvelles approches antivirales. A cette fin, la technologie du phage display sera utilisée pour optimiser l’affinité de l’IDR de la protéine ANP32A humaine, et de l'IDR d'une ou deux autres protéines humaines nouvellement identifiées, vis-à-vis des protéines virales FluPol et NP. Des ARNm-LNP (nanoparticules lipidiques) seront développées pour administrer les IDR optimisées dans des cellules en culture et tester leur efficacité. 

La pandémie de COVID-19 a rappelé les conséquences d’une émergence de nouveaux pathogènes et de la difficulté à contrôler leur propagation, en particulier dans le cas des maladies respiratoires. En peu de temps, un nouveau virus respiratoire a eu des conséquences sociétales, économiques et sanitaires majeures dans le monde. De plus, le manque de préparation révélé par cette pandémie peut avoir augmenter le risque d’attaque bioterroriste.

Pour accélérer la réponse face à l'émergence d'un nouveau pathogène, un des principaux défis consiste en sa détection rapide dans l'environnement et notamment dans l’air en ce qui concerne les virus respiratoires, afin de prendre les mesures sanitaires adéquates. Dans ce contexte, le projet CATMOS propose le développement d'une technologie de rupture qui permettra de surveiller la présence de pathogènes dans l’air, pour contrôler plus efficacement les maladies infectieuses respiratoires émergentes et ré-émergentes, tant au niveau individuel que collectif.

À l'heure actuelle, il n'existe presque aucun système permettant la collecte et la détection concomitantes de pathogènes dans l'air. Le CEA a développé une telle technologie, mais la cartouche microfluidique dédiée, capable de collecter les aérosols et de détecter la présence de virus par amplification isotherme, n'est pas réutilisable. Le principal défi pour la surveillance continue des bioaérosols est d'éviter la consommation de réactifs coûteux tout en maintenant un haut niveau de sensibilité. CATMOS propose le développement d'un capteur multiplexe innovant, réutilisable, fondé sur des sondes aptamères et une lecture par ElectroChimiLuminescence (ECL). Son intégration dans une cartouche microfluidique, précédemment développée dans l'ANR Flash Covid-19 pour automatiser le prélèvement et l'analyse, permettrait le suivi en continu des bioaérosols.

Une double stratégie est proposée. Dans un premier temps, s'appuyant sur des briques technologiques matures développées et brevetées par le CEA-Leti en matière d'aérocollecte et de récupération microfluidique de l'échantillon, le projet portera sur le développement d'un capteur utilisant un test de type sandwich fondé sur des aptamères et un marquage ECL pour permettre un suivi en continu des bioaérosols. Dans un second temps, le développement et la mise en œuvre de stratégies plus risquées seront abordés en ciblant 1) une nouvelle surface de collecte pour permettre un cycle de collecte amélioré et 2) une détection ECL sans marquage des virus pour réduire l'utilisation des aptamères impliquées dans le test sandwich.

Avec l’équipe VirPath (CIRI), laboratoire associé à l’OMS, les équipes MIRCen (CEA), CBAN (Pasteur) et NSYSA (Univ. Bordeaux) vont développer des aptamères permettant la capture du virus respiratoire syncytial, d’un virus influenza A/H3N2 et du variant SARS-CoV-2 Xbb1.5; ces réactifs seront marqués pour une détection ultra-sensible fondée sur l’ECL. Ils seront immobilisés dans une puce microfluidique conçue et produite par le CEA-Leti pour être réutilisable. Après sa validation, ce capteur sera intégré dans une version adaptée de la cartouche microfluidique du Leti capable de collecter et d'éluer des aérosols. Le but ultime du projet est de valider une telle balise en banc d’essais de grand volume (30m3, VirPath), dans lequel sont générées des atmosphères calibrées contaminées par les virus respiratoires infectieux d’intérêt.

Considérant le continuum de la (ré)-émergence des pathogènes zoonotiques à leur propagation dans les populations, la technologie proposée sera développée pour la surveillance environnementale. Elle sera déployable dans toute zone à risque pour contrôler la propagation entre les animaux et la transmission à l'homme selon l’approche « One Health ». Cette stratégie doit permettre de détecter au plus tôt les émergences, de les circonscrire, de réduire leur nombre, avec des mesures barrières adaptées pour protéger les populations. De telles balises amélioreront la gestion du risque d'épidémie et de pandémie, y compris face aux agents de la menace. Un tel développement contribuera en outre à acquérir une capacité souveraine pour faire face aux menaces biologiques

Le virus du chikungunya (CHIKV) est un arbovirus qui pose un problème majeur de santé publique. Depuis sa réémergence en 2004 dans l'océan Indien, il s'est propagé sur plusieurs continents et continue de provoquer des épidémies, comme récemment à l’Ile de la Réunion. Il entraîne des douleurs articulaires et musculaires invalidantes pouvant persister plusieurs mois, voire des années après l’infection. À ce jour, aucun vaccin efficace ni traitement antiviral spécifique n’est disponible. Cette situation reflète des lacunes majeures dans notre compréhension des mécanismes de réplication et de pathogénèse du CHIKV.

La réplication du virus est assurée par le complexe de réplication (CR), constitué des protéines non structurales nsP1 à nsP4. Celles-ci s’assemblent et recrutent des facteurs cellulaires pour former des invaginations membranaires spécialisées, appelées sphérules, où se déroule la synthèse de l’ARN viral. Les mécanismes d’assemblage du CR et de coordination de la réplication de l’ARN, ainsi que le couplage moléculaire entre la synthèse de l’ARN et la formation des nucléocapsides, restent mal compris.

Parmi les protéines nsP, nsP3 est la moins bien caractérisée. Elle se localise à la face cytosolique des sphérules, où elle recrute plusieurs protéines de l’ hôte essentielles à la réplication virale. Nos travaux ont montré que nsP3 détourne le facteur musculaire FHL1 pour amplifier la réplication du génome viral et induire une pathologie musculaire, bien que les mécanismes restent à élucider.

nsP3 forme également des organites cytoplasmiques sans membrane appelés alphagranules. Nous avons découvert que ces structures sont constituées d’échafaudages hélicoïdaux de nsP3 organisés en réseaux de type nid d’abeille. Les alphagranules concentrent des cofacteurs cellulaires clés (FHL1, G3BP), l’ARN viral et la protéine de capside, suggérant un rôle dans l’assemblage des nucléocapsides virales. nsP3 module aussi la spécificité vectorielle chez les moustiques, un facteur déterminant dans la propagation du CHIKV. Bien que nsP3 joue un rôle central dans plusieurs fonctions virales, ses mécanismes d’action restent mal compris. Leur élucidation pourrait révéler de nouvelles cibles pour des stratégies antivirales innovantes.

Le projet CHICAGO vise à décrypter les mécanismes moléculaires et cellulaires de la réplication et de la pathogénèse du CHIKV, en se concentrant sur la protéine multifonctionnelle nsP3. S’appuyant sur des découvertes majeures du consortium, il repose sur la conviction que des avancées fondamentales sont essentielles pour développer de nouvelles stratégies antivirales et vaccinales.

D’une durée de 36 mois, CHICAGO est structuré en cinq partie complémentaires (WP) :

WP1 : Définir l’architecture et la dynamique du CR par cryo-microscopie électronique.

WP2 : Caractériser la composition et la fonction des alphagranules par imagerie haute résolution, protéomique et transcriptomique.

WP3 : Étudier leur architecture par cryo-tomographie in situ et leur rôle dans l’assemblage des nucléocapsides virales.

WP4 : Déchiffrer le rôle de FHL1 dans l’infection CHIKV et la pathogénèse musculaire via des modèles murins.

WP5 : Explorer les interactions entre nsP3 et les facteurs de l’hôte moustique modulant la compétence vectorielle.

CHICAGO apportera des connaissances majeures sur la biologie du CHIKV, en établissant les bases structurales et fonctionnelles du CR et en explorant le rôle central de nsP3. Le projet posera ainsi les fondations conceptuelles et moléculaires pour des thérapies antivirales nouvelles et des interventions ciblées sur les vecteurs. En cohérence avec la feuille de route scientifique de l’ANRS-MIE, CHICAGO réunit un consortium d’excellence à l’expertise complémentaire et au solide historique collaboratif.

Le Virus Respiratoire Syncytial (VRS) est le principal agent responsable de bronchiolites chez les très jeunes enfants. Ce virus est également reconnu comme pathogène majeur des personnes âgées et immunodéprimées, responsable d’infections respiratoires aigües comme les pneumonies. Des vaccins dédiés aux personnes âgées et aux femmes enceintes ont récemment été mis sur le marché, améliorant la protection de ces populations à risque. Toutefois, cette protection est de courte durée, et aucun traitement curatif n’est disponible. La plupart des stratégies antivirales visent à inhiber l’entrée du virus dans la cellule cible, en bloquant la protéine de fusion. Le développement d’inhibiteurs ciblant les activités enzymatiques de la polymérase virale L est la seconde stratégie privilégiée. Toutefois, l’émergence de mutations d’échappement lors du développement de ces traitements met en évidence la nécessité d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Comme pour l’ensemble des virus appartenant à l’ordre des Mononegavirales, le génome du VRS est un ARN simple brin de polarité négative, encapsidé par la nucléoprotéine virale N sous forme de la nucléocapside hélicoïdale N-ARN qui sert de matrice à la polymérase L et son cofacteur, la phosphoprotéine P. Il en résulte la particule ribonucléoprotéique RNP, responsable de la réplication et de la transcription des ARN viraux au sein d’usines virales cytoplasmiques, organelles viro-induits dépourvus de membranes et formés par séparation de phase. Une particularité de la famille des Pneumoviridae à laquelle appartient le VRS est la présence du facteur de transcription M2-1. Cette protéine, recrutée au sein des usines virales par une interaction avec la protéine P, est retrouvée associée aux ARNm viraux produits au sein de sous-compartiments des usines virales, avant leur libération dans le cytoplasme. Différents facteurs cellulaires d’initiation de la traduction sont également associés aux ARNm viraux et à M2-1 dans ses sous-compartiments. Toutefois, les mécanismes régulant la transcription, le trafic, les modifications et la traduction des ARNm viraux restent mal caractérisés.

Dans le cadre du projet MuST-RSV, nous proposons d'aborder la multiplication du VRS sous un nouvel angle, en nous concentrant non seulement sur les RNPs mais également, et surtout, sur les ARNm viraux et l’exploration des mécanismes impliqués dans leur régulation, de la transcription à la traduction. Ce projet s'appuie sur l'expertise complémentaire de quatre partenaires apportant leurs compétences spécifiques sur l’étude des ARN, des protéines, et la mise au point de techniques de microscopie dédiées à leur étude. Plus spécifiquement, ce projet vise à i/ caractériser les ARNm produits et traduits en protéines au cours du cycle viral ; ii/ identifier les partenaires cellulaires interagissant avec la protéine M2-1 et régulant le cycle de ces ARNm ; iii/ développer des approches d’imagerie par fluorescence afin de suivre le trafic de ces ARN et protéines au cours de l’infection ; et iv/ obtenir des données structurales sur les RNPs et plus globalement sur les usines virales ainsi que leurs sous-compartiments et leur environnement dans le cytoplasme, dans les cellules et les tissus infectés. L’ensemble des données devrait permettre de mieux comprendre au niveau moléculaire et cellulaire ces mécanismes clé de l’infection, et d’identifier des nouvelles cibles thérapeutiques d’intérêt.

Les paramyxovirus représentent une menace majeure pour la santé mondiale, responsables d’infections graves et se classant parmi les trois principales causes de mortalité dans le monde. Parmi eux, les virus Nipah (NiV) et Hendra (HeV) sont particulièrement dangereux, avec des taux de mortalité allant de 40 à 100 %. Il n’existe actuellement aucun vaccin ou traitement contre ces épidémies aéroportées, transmissibles entre humains.

Ces virus partagent un génome similaire à ARN négatif non segmenté, avec d’autres paramyxovirus importants comme la rougeole (MeV) et le paramyxovirus du saumon atlantique (ASPV).

Un aspect clé, mais encore sous-exploré, de la biologie des paramyxovirus est la présence d’adénosine méthylée N6 (m6A) sur leurs ARN génomique. Cette modification épitranscriptomique semble contribuer à l'échappement immunitaire du virus vis-à-vis de son hôte, bien que son rôle précis soit encore largement incompris.

Notre projet vise à cibler ces modifications m6A de l’ARN comme nouvelle stratégie thérapeutique. Nous émettons l’hypothèse que certains motifs d’ARN, lorsqu’ils sont méthylés, agissent comme des interrupteurs structuraux favorisant la réplication virale ou empêchant la détection immunitaire.

Notre approche repose sur trois objectifs principaux :

• Cartographier précisément les sites m6A dans les ARN génomiques du NiV, MeV et ASPV
• Identifier les sites m6A qui ont un impact sur la fonction virale et l’évasion immunitaire
• Concevoir et synthétiser de nouveaux antiviraux ciblant la méthylation virale (En se concentrant sur le virus NiV et utilisant les virus MeV et ASPV comme modèles BSL2).

Notre consortium multidisciplinaire adopte une approche « One Health », basée sur l’interconnexion entre santé humaine et animale. L’innovation dans ce projet réside dans le fait qu’il se concentre sur l’impact de la méthylation sur la structure de l’ARN, ce qui représente la première évaluation approfondie de la méthylation du génome du paramyxovirus. Cette approche pourrait conduire à des traitements antiviraux innovants intégrant l'échappement à la réponse immune.

Les objectifs de notre projet sont de :

• Cartographier des sites m6A sur l’ARN viral de NiV, MeV et ASPV par séquençage nanopores, en observant également les changements dans l’ARN cellulaire.
• Comprendre le rôle des modifications m6A : Modéliser comment elles influencent les structures de l’ARN viral à l’aide de la technologie SHAPE pour identifier les « commutateurs structuraux » et de techniques de machine learning pour identifier les motifs m6A critiques pour le développement de médicaments. Nous testerons comment les motifs d’ARN viraux modifiés par m6A interagissent avec les récepteurs de l’immunité innée (TLR et RLR) dans les cellules immunitaires et épithéliales pour comprendre l’évasion immunitaire.
• Développer des composés ciblant les modifications m6A : Des inhibiteurs bisubstrat de méthyltransférases de l’hôte comme METTL3/14 et des inhibiteurs covalents. Nous concevrons également des composés se liant directement aux sites m6A de l’ARN viral, interagissant avec l'étape de méthylation ou modifiant leur "lecture » par des protéines de l’hôte.
• Tester et valider des composés antiviraux : Après une sélection basée sur des tests in vitro et enzymatiques, les composés prometteurs seront testés contre la réplication cellulaire de MeV, puis validés avec contre NiV dans le laboratoire P4. Nous utiliserons des cultures pulmonaires organotypiques pour faire le lien entre les études in vitro et in vivo. Enfin, les molécules sélectionnées seront testées in vivo dans un modèle de paramyxovirus de saumon, évaluant la survie et la réduction virale.

En combinant des stratégies de ciblage de l'hôte et du pathogène, nous visons à surmonter les limites des antiviraux traditionnels et à ouvrir la voie à une nouvelle génération de thérapies efficaces contre ces agents pathogènes mortels.

Le projet METEOR est axé sur l'exploration de l'exométabolome de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) afin de comprendre son rôle dans l'adaptation et la virulence de cette bactérie pathogène. Bien que l'exométabolome joue un rôle crucial à l'interface hôte-pathogène, aucune analyse approfondie et systématique de l'exométabolome de Mtb n'a été réalisée jusqu'à présent. Les données préliminaires indiquent que Mtb sécrète une large variété d'intermédiaires métaboliques dans son environnement, ce qui pourrait être crucial pour influencer les interactions hôte-pathogène.

Le projet a trois principaux objectifs. Premièrement, il vise à réaliser la première caractérisation sans a priori de l'exométabolome de Mtb sous diverses conditions de stress. Cela impliquera l'identification des exométabolites libérés lors des différentes réponses au stress, révélant ainsi des mécanismes d'adaptation de Mtb. Deuxièmement, le projet se concentrera sur l’élucidation des voies de biosynthèse de ces exométabolites clés, qui sont essentielles pour l'adaptation de Mtb aux stress. Troisièmement, le projet examinera comment ces métabolites affectent la virulence de Mtb en utilisant des modèles in vitro (macrophages) et in vivo(modèle murins). Cela impliquera le ciblage d'enzymes spécifiques au sein de ces voies pour comprendre leur impact sur la virulence de Mtb.

Pour atteindre ces objectifs, le projet METEOR utilise une combinaison d’approches de métabolomique basée sur la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la spectrométrie de masse (SM). Cette approche bénéficie de la facilité expérimentale d'accès à l'exométabolome par rapport aux métabolites intracellulaires et, de la capacité à identifier les métabolites abondants dans l’exométabolome grâce aux techniques de RMN et de SM.

Le projet est divisé en trois workpackages (WPs). Dans le WP1, l’étude se concentre sur une analyse approfondie de l'exométabolome de Mtb, incluant l'identification et la quantification des métabolites libérés sous diverses conditions de stress. Dans le WP3, l’étude vise à moduler la production et l'excrétion des métabolites en modifiant génétiquement les réseaux métaboliques de Mtb, en créant des mutants pour tester les effets sur les profils métaboliques et l'activité métabolique. Enfin, dans le WP3, le rôle de ces métabolites dans la virulence de Mtb est exploré en testant leur impact sur des macrophages infectés et des modèles murins. Cela inclut l'évaluation de la fitness des souches de Mtb et de la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection.

Le projet METEOR fournira donc une vision unique sur le fonctionnement du réseau métabolique de Mtb et les interactions hôte-pathogène, offrant l’opportunité d'identifier de nouvelles cibles pour des thérapies anti-TB innovantes.

Le projet de recherche fondamentale DYNABUD se concentre sur le bourgeonnement du Virus de l’Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1). Une étape clé de son cycle de réplication est le clivage de la membrane plasmique pour libérer les particules virales. Pour cela, le VIH-1 détourne la machinerie ESCRT-III de la cellule hôte pour assurer la scission membranaire, un mécanisme également essentiel dans d’autres processus cellulaires comme la cytokinèse.

Les protéines ESCRT-III ont la capacité de passer d'un état monomérique inactif à une forme ouverte, compétente pour la polymérisation et la liaison membranaire. In vitro, les protéines CHMP4B s'assemblent en filaments spiralés, tandis que les protéines CHMP2A et CHMP3 forment des copolymères hélicoïdaux sous forme de tubes. Néanmoins, la cinétique et l'architecture moléculaire des filaments de CHMP2A, CHMP3 et CHMP4B au niveau du col de bourgeonnement du VIH-1 in situ sont encore inconnues. Définir l'organisation spatiale de ces filaments, leur mode d'assemblage et de remodelage, ainsi que la contribution de chaque composant à la déformation et à la fission membranaire, constitue une question centrale.

Le projet aborde ces questions à travers trois objectifs principaux :

1. Analyser la dynamique temporelle de la polymérisation des filaments ESCRT-III aux sites de bourgeonnement du VIH-1.

1. 1. La stratégie d'édition génomique CRISPR-Cas9 a permis de marquer endogènement CHMP2A avec la protéine fluorescente mNeonGreen. Cette approche sera étendue à CHMP3 et CHMP4B en utilisant des fluorophores spectralement distincts.
   2. La microscopie de fluorescence à réflexion totale interne (TIRF) à haute vitesse sera employée pour la visualisation en temps réel du recrutement, de l'échange et de la disparition des protéines CHMP2A, CHMP3 et CHMP4B aux sites de bourgeonnement natifs du VIH-1 dans des cellules vivantes. Cela permettra une quantification précise de la cinétique de renouvellement des filaments.

1. Déterminer l'architecture nanométrique des filaments ESCRT-III aux sites de bourgeonnement natifs.

1. 1. Le projet s'appuiera sur la mise en œuvre réussie de la microscopie de super-résolution DNA-PAINT, qui a fourni les premières images à haute résolution de filaments CHMP2A aux sites de bourgeonnement du VIH-1 in vivo.
   2. La capacité de multiplexage de DNA-PAINT sera exploitée pour résoudre les transitions structurelles et l'organisation spatiale des filaments individuels de CHMP2A, CHMP3 et CHMP4B le long du col de bourgeonnement.
   3. Une sonde spécifique des lipides sera utilisée pour visualiser la membrane plasmique, permettant de définir l'organisation des ESCRT-III par rapport à la morphologie membranaire.
   4. Le 3D-PAINT sera également déployé pour visualiser l'architecture des filaments en trois dimensions.

1. Etude des mécanismes de l'activité antivirale de rétroCHMP3 pendant le bourgeonnement du VIH-1.

1. 1. La protéine rétroCHMP3 est une variante naturelle mutée et tronquée de CHMP3 qui inhibe sélectivement le bourgeonnement viral sans compromettre les processus cellulaires hôtes. Ses mécanismes précis d'interférence avec les filaments ESCRT-III restent indéfinis.
   2. Le projet caractérisera in vitro la capacité des protéines rétroCHMP3 à co-assembler avec CHMP2A en tubes hélicoïdaux et leur compétence pour le clivage membranaire.
   3. In vivo, la vidéo-microscopie TIRF et DNA-PAINT définira la distribution nanométrique et la dynamique de recrutement de rétroCHMP3 par rapport aux ESCRT-III endogènes. La structure des filaments de rétroCHMP3 sera déterminée pour fournir des informations structurelles sur son intégration au sein des assemblages ESCRT-III.

En intégrant le profilage cinétique avec l'architecture nanométrique, le projet révélera comment chacune des sous-unités ESCRT-III coopère pour la scission membranaire. L'étude de rétroCHMP3 permettra de démêler les mécanismes spécifiques par lesquels cet inhibiteur endogène bloque le bourgeonnement viral sans altérer les fonctions cellulaires essentielles. Ces résultats devraient faire progresser considérablement la compréhension des interactions virus-hôte.