Projets et candidats lauréats

Le rôle du microbiote intestinal dans la réplication, la transmission et la pathogénèse des virus est de plus en plus reconnu. Des études montrent que le microbiote facilite la prolifération et la propagation des virus par divers mécanismes. Par exemple, le norovirus humain se lie aux bactéries via les glycannes des antigènes des groupes sanguins, tandis que le poliovirus s'attache à des composants comme le lipopolysaccharide et le peptidoglycane. Ces interactions ne se limitent pas aux virus entériques. Des rétrovirus tels que le MMTV dépendent du microbiote intestinal pour leur dissémination, et des recherches récentes suggèrent que le microbiote influence l'initiation de l'infection par le virus Epstein-Barr (EBV), la progression des tumeurs induites par l'EBV, et renforce l'acquisition et la réplication du VIH dans les tissus mucosaux. Ces découvertes soulignent comment les bactéries aident les virus à échapper à la détection immunitaire et à maintenir leur persistance dans l'hôte.

Les surfaces muqueuses sont des sites clés pour l'acquisition du VIH, car elles servent de zones primaires de réplication virale, de déplétion des cellules T CD4+ et d'inflammation. Ces surfaces abritent une population bactérienne dense qui influence le succès des infections virales. Les bactéries peuvent exister librement ou au sein de biofilms, qui sont des communautés encapsulées dans une matrice extracellulaire composée de polysaccharides, de protéines, d'ADN, d'ARN et parfois de lipides.

Notre équipe de recherche se concentre sur les dynamiques entre le VIH-1 et les bactéries. Un axe majeur de notre étude est d'explorer comment le VIH interagit avec les bactéries dès la phase de transmission. La transmission du VIH-1 se produit à travers les surfaces muqueuses, notamment lors des rapports sexuels, où le virus rencontre diverses bactéries dans les régions intestinales et vaginales. Inspirés par des recherches sur les virus entériques, nous proposons que le VIH-1 pourrait utiliser des mécanismes similaires pour améliorer sa transmission. Cette hypothèse constitue la base de notre projet, qui vise à déterminer si le VIH et les bactéries mettent en place des stratégies mutualistes pour favoriser la transmission du VIH.

Nos données préliminaires suggèrent que le VIH-1 interagit avec les bactéries, notamment par la liaison des particules virales infectieuses à la matrice extracellulaire bactérienne. Nous avons pour objectif de caractériser plus en détail cette interaction, d’identifier les composants viraux et bactériens responsables de cette liaison, et de comprendre comment cela pourrait favoriser la transmission du virus. Pour répondre à ces questions, nous utiliserons différentes approches et validerons nos résultats dans un modèle expérimental pertinent, le modèle de culture d'agrégats de la lamina propria (LPAC), grâce à notre collaboration avec les laboratoires de C.C. Wilson et M. Santiago à l'Université du Colorado.

Ce projet vise à approfondir notre compréhension des interactions entre le VIH et les bactéries, et à révéler de nouvelles voies potentielles de transmission du VIH. À long terme, ces connaissances pourraient ouvrir la voie à de nouvelles cibles thérapeutiques pour perturber ces interactions et possiblement réduire la transmission du VIH.

Le complexe ribonucléoprotéique 7SK (7SKsnRNP) composé du petit ARN nucléaire non-codant 7SK et de protéines nucléaires, régule l’activité du facteur positif d’élongation de la transcription (P-TEFb), hétérodimère constitué d’une cycline T et de la kinase cycline-dépendante CDK9. P-TEFb est essentiel pour la transcription des ARN messagers par l’ARN polymérase chez les eucaryotes. L’assemblage 7SKsnRNP capture P-TEFb, inhibant ainsi son activité kinase indispensable à la levée des pauses de la transcription par l’ARN polymérase II (ARNpol II). Lorsque P-TEFb est libéré du complexe 7SKsnRNP, CDK9 phosphoryle le domaine C-terminal de l’ARNpol II ainsi que les répresseurs de transcription NELF et DSIF, restaurant ainsi la transcription par l’ARNpol II.

P-TEFb est un facteur cellulaire indispensable pour la régulation de la réplication du virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Il joue un rôle essentiel dans l’initiation de la transcription chez le VIH-1. P-TEFb est recruté par la protéine virale Tat qui interagit avec la cycline T1 via son domaine d’activation, tandis que son domaine de liaison à l’ARN s’associe à l’ARN TAR (« trans-activating responsive ») localisé dans la région 5’ non traduite du génome viral. Des études biochimiques révèlent également que P-TEFb peut être présent dans trois complexes distincts. Le premier complexe est composé de P-TEFb et de la protéine Brd4 qui contient deux bromo-domaines se liant aux résidus lysines acétylés dans la chromatine. P-TEFb a également été trouvé associé au « Super Complexe d’Elongation » (SEC). Le troisième complexe contient P-TEFb et l’assemblage 7SKsnRNP. Tat peut capturer P-TEFb dans chacun de ces complexes.

Le complexe 7SKsnRNP contient trois protéines nucléaires dont HEXIM1 avec laquelle P-TEFb interagit de manière réversible. Tat est capable de déplacer la protéine HEXIM1 de l’ARN 7SK, provoquant ainsi la libération de P-TEFb. L’ARN 7SK régule ainsi indirectement la transcription de l’ARN du VIH en contrôlant la disponibilité de P-TEFb.

Dans le cadre du projet présenté, nous nous intéressons tout particulièrement au mécanisme fin d’interaction de l’ARN non codant 7SK avec Tat et HEXIM1. Ces deux protéines contiennent des motifs de liaison à l’ARN similaires (ARM : « Arginine Rich Motif »). Elles ciblent la même région de l’ARN 7SK mais avec des mécanismes d’interaction différents. Ceci est particulièrement intrigant : comment deux protéines comportant des domaines de liaison à l’ARN aussi similaires, peuvent-elles cibler le même ARN de manières distinctes ?

Afin de mieux comprendre les facteurs régissant ces interactions, nous proposons d’étudier les interactions HEXIM1/7SK et Tat/7SK en combinant des méthodes biophysiques et biochimiques. Nos objectifs sont de: (i) mesurer des données cinétiques et thermodynamiques pour comparer les interactions de 7SK avec Tat et HEXIM1 ; (ii) mesurer des données cinétiques et thermodynamiques du déplacement de HEXIM1 par Tat, (iii) analyser les changements conformationnels globaux de 7SK sous l’effet de l’interaction avec ses deux partenaires protéiques et (iv) élucider les structures des complexes par Cristallographie. Pour réaliser les mesures cinétiques et thermodynamiques, nous utiliserons la technologie « switchSENSE », ainsi que la titration calorimétrique isotherme (ITC). L’ITC est une technique utilisée pour mesurer les paramètres d’affinité (KD), et thermodynamiques d’interaction entre biomolécules (enthalpie et entropie), ainsi que la stoechiométrie (n). La technique « switchSENSE », nouvelle en France, permet l’analyse d’interactions entre molécules en temps réel et d’accéder à la mesure de constantes cinétiques d’association (kon), de dissociation (koff) et de la constante d’affinité KD, donc complémentaire de l’ITC. L’utilisation combinée de ces méthodes peut fournir une vue détaillée du mécanisme d’interaction entre biomolécules et ainsi, des données fondamentales sur la régulation l’activité de P-TEFb par l’ARN 7SK.

Une meilleure compréhension des facteurs régissant les interactions entre l’ARN 7SK et ses partenaires pourrait contribuer à obtenir des informations supplémentaires sur la réplication du VIH.

En 2021, la tuberculose demeure la principale cause de décès, d’origine bactérienne, à l’échelle mondiale. La difficulté à éradiquer la maladie est liée à trois facteurs principaux : la faible efficacité du vaccin BCG, la co-infection avec le virus de l’immunodéficience humaine et l’apparition croissante de souches multi-résistantes aux antibiotiques. En outre, la pandémie de Covid-19 a fortement aggravé la situation en déstabilisant les efforts de lutte contre la tuberculose. Par conséquent, le développement de thérapies innovantes, notamment celles dirigées par l’hôte, reste une priorité majeure. Avant tout, de telles avancées exigent une meilleure compréhension des interactions moléculaires entre l’agent étiologique, Mycobacterium tuberculosis (Mtb), et son hôte.

Mtb est un pathogène intracellulaire qui se multiplie dans l’environnement hostile des macrophages. Au départ, présent dans une vacuole appelée phagosome, Mtb peut ensuite accéder au cytosol du macrophage après avoir endommagé la membrane phagosomale. L’entrée de Mtb, ou ses facteurs, dans le cytosol entraîne la modulation de plusieurs réponses immunitaires innées, notamment la production de cytokines, l’autophagie et la mort cellulaire. A ce jour, les facteurs connus sont essentiellement des protéines et des acides nucléiques qui interagissent avec des protéines cytosoliques afin de moduler les fonctions du macrophage. Etonnamment, le rôle des lipides de Mtb dans ce processus a été largement inexploré. Pourtant, Mtb produit de nombreux lipides, de structure diverses, ayant d’importantes propriétés immunomodulatrices. Pour ce faire, ils interagissent avec des protéines présentes à la surface ou dans la voie endocytique des cellules de l’hôte. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que les lipides de Mtb pourraient aussi se lier à des protéines cytosoliques afin de déclencher ou de détourner les réponses du macrophage.

L’objectif de ce projet « Contrat d’Initiation » est d’identifier les protéines cytosoliques des macrophages qui interagissent avec deux glycolipides majeurs, présents à la surface de Mtb, le tréhalose dimycolate (TDM) et le lipoarabinomannane mannosylé (ManLAM). Les objectifs spécifiques sont les suivants :

1. Identifier les protéines cytosoliques qui se lient, in vitro, au TDM et au ManLAM purifiés (Mois 1-2). Dans un premier temps, nous réaliserons des expériences de « pull-down » avec des billes recouvertes de ces lipides et un extrait cytosolique de macrophage. Les protéines associées aux billes seront identifiées grâce à une analyse protéomique. Un maximum de six protéines avec un domaine liant les lipides ou les sucres seront sélectionnées pour les objectifs 2 et 3.
2. Valider la liaison directe avec des protéines recombinantes (Mois 2-5). Dans un second temps, nous mesurerons la liaison de la protéine recombinante, étiquetée, avec le lipide purifié en utilisant un essai de type ELISA, et ensuite la liaison avec Mtb par Westernblot.
3. Evaluer le recrutement des protéines candidates dans les macrophages (Mois 5-12). Enfin, nous quantifierons la colocalisation de la protéine d’intérêt avec les phagosomes endommagés contenant soit une bille recouverte du lipide de Mtb, soit la bactérie entière, dans les macrophages, par microscopie de fluorescence confocale.

Dans son ensemble, le projet CyTuLip permettra de faire la preuve de concept que les lipides immunomodulateurs de Mtb peuvent aussi interagir avec des protéines cytosoliques, in vitro et dans les macrophages. Ces résultats seront le point de départ d’un projet de recherche beaucoup plus vaste dédié à l’étude de ces nouvelles interactions, à la fois leurs bases moléculaires et leurs rôles dans l’infection à Mtb. In fine, ces travaux pourraient aboutir à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour la lutte contre la tuberculose.

La tuberculose (TB) est un problème de santé mondial majeur, avec environ 10 millions de nouveaux cas signalés chaque année. Bien que la TB soit largement reconnue pour son impact sur les poumons, de nouvelles preuves suggèrent que la TB pulmonaire peut également avoir des effets significatifs sur le cerveau, même en l'absence d'infection directe du système nerveux central. Ce phénomène a été associé à des déficits cognitifs persistants chez les patients atteints de TB, et des données récentes indiquent un risque accru de démence chez les survivants de la tuberculose.

En combinant des techniques expérimentales avancées et une approche interdisciplinaire intégrant l'analyse neurocomportementale et l'immunologie, le projet TB-BRAIN vise à étudier les impacts neurologiques à long terme de la TB. Plus précisément, dans un modèle murin de TB pulmonaire, il s'agira de (1) déchiffrer l'étendue et la nature de la neuroinflammation au cours de la maladie; (2) évaluer l'intégrité et la fonction de la barrière hémato-encéphalique ; (3) étudier l'impact de la TB pulmonaire sur le vieillissement du cerveau ; et (4) examiner la fonction cognitive des souris infectées par Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

 Le projet TB-BRAIN vise à combler les lacunes dans la compréhension des conséquences neurologiques à long terme de la TB pulmonaire. En élucidant les relations entre l'inflammation systémique, la perturbation de la barrière hémato-encéphalique et le déclin cognitif, cette étude cherchera à faire progresser les connaissances sur les impacts plus larges de la TB et les stratégies potentielles pour atténuer ses effets sur la santé du cerveau. Elle contribuera également à une meilleure compréhension de la manière dont les infections peuvent influencer les maladies neurodégénératives.