Projets et candidats lauréats

Contexte

Aucun traitement spécifique n’existe pour l’infection à COVID-19. De nombreux essais cliniques sont en cours dans le monde mais aucun en Afrique. Tous les essais, sauf quelques uns, évaluent des monothérapies comme l’hydroxychloroquine (HCQ), le lopinavir/ritonavir (LPV/r), le remdesivir et d’autres composés. L’infection à SRARS-CoV 2 est associée à une charge virale atteignant 5 à 8 log, suggerant qu’une monothérapie n’entraînera pas une diminution rapide pour améliorer l’évolution du patient et réduire la transmission.
Ce projet vise à évaluer l’innocuité et l’efficacité des thérapies combinées dans l’infection à COVID-19 avec des molécules disponibles en Afrique.

 Objectifs

– Améliorer le taux de suppression virale du SRAS-CoV-2 (objectif principal)

– Améliorer l’évolution cliniques des patients hospitalisés

– Diminuer le risque de transmission de COVID-19

– Réduire le délai de sortie de l’hôpital

– Diminuer la mortalité toutes causes confondues

– Evaluer la sécurité des différentes stratégies de traitement.

– Examiner les facteurs pronostiques de décès et de SDRA

Hypothèse

Nous émettons l’hypothèse que des combinaisons de médicaments parmi HCQ, LPV/r, darunavir/r (DRV/r), telmisartan (TMS), atorvastatine (ATS) pourraient avoir un effet synergique sur l’activité antivirale sur le SRAS-CoV2 en permettant l’immunomodulation empêchant la libération cytokinique des formes graves de la maladie, amélierant le pronostic de l’infection et limitant la propagation du virus.

Méthode

Étude de phase IIb randomisée, non comparative, chez des patients atteints d’une infection sévère au COVID-19

Les patients seront randomisés et recevront en parallèle :

Bras 1: HCQ + LPV/r

Bras 2: HCQ + DRV/r

Bras 3: LPV/r + TMS

Bras 4: LPV/r + ATS

Critères d’inclusion

– Patients de plus de 18 ans

– Infecté par une infection à COVID-19 confirmé par une PCR spécifique

– Hospitalisé

– Fièvre ou toux ou difficultés respiratoires

– Naïf de traitement spécifique pour COVID-19

– Consentement éclairé signé par le patient

Critères de non-inclusion

– Enquête pharmacologique contre-indiquant l’introduction d’un inhibiteur du CYP450

– Insuffisance rénale (eGFR <30 ml/min, formule CKD-EPI)

 – Cirrhose (stade ≥ Child-Pugh B)

– Grossesse ou allaitement

– Hypersensibilité à HCQ, DRV, ritonavir, TMS, ATV

– Électrocardiogramme montrant QTc> 500 ms

– Démence ou toute autre condition qui ne permet pas d’obtenir un consentement éclairé

– Curatelle ou tutelle

– Exposition antérieure au HCQ

– Exposition antérieure aux sartans

Critères de jugement

– Proportion de patients présentant une suppression confirmée de SRAS-Cov-2 par PCR à J8 (critère principal)

– Proportion de patients présentant une amélioration clinique selon l’échelle ordinale à 7 points à J8

– Hospitalisation

– Décès et SDRA à J28

– Prévalence des événements indésirables

– Nombre de parents infectés par COVID-19 à J28

Calendrier de l’étude

Les patients seront sélectionnés puis inclus et randomisés à J1. Ils commenceront le traitement attribué de J1 à J7 et seront évalués à J1, J3, J5, J8, J10, J14, J28.
L’évaluation comprendra les paramètres cliniques, les échantillons biologiques à l’inclusion, D3, D7. La PCR du SRAS-CoV-2 sera évaluée à J3, J5, J8, J10, J14, J28.

Taille de l’échantillon

Des travaux ont montré que dans la forme sévère des maladies, près de 100% des patients étaient toujours positifs pour la PCR SARS-CoV-2 à J10 tandis que dans les formes légères, 90% des patients étaient négatifs sans traitement. Si nous faisons l’hypothèse que, sans traitement, dans notre population, 60% seraient positifs à J8, nous aurons besoin de 70 patients par groupe pour montrer une réduction de 50% de la positivité de la PCR à J8 (de 60% à 30% en risque absolu) avec une valeur α de 5%, une puissance 1-β de 80%. L’échantillon total de patients sera donc de 280 patients.

 Chronologie de l’étude

Date de début de mise en œuvre : 1er juin 2020

Date de première inclusion : 15 juin 2020

Durée des inclusions : 2 mois

Durée de la participation par sujet : 28 j

Date de la dernière visite du patient : 15 septembre 2020

Rapport scientifique : 15 décembre 2020

Vingt millions de nouvelles infections par le virus de l’hépatite E (VHE) se produisent chaque année dans le monde et s’illustrent par trois millions de cas symptomatiques et 60 000 décès. Les génotypes 1 et 2 du VHE sont rencontrés dans les pays en voie de développement et le mode de transmission principal est la voie oro-fécale. Les génotypes 3 et 4 sont présents dans les pays industrialisés et la transmission à l’homme est essentiellement zoonotique. Le VHE se réplique majoritairement dans les hépatocytes mais la stratégie lui permettant de traverser la barrière gastro-intestinale afin d’accéder aux cellules hépatiques reste inconnue. Les études qui ont été réalisés sur modèles cellulaires intestinaux s’appuient sur la lignée cellulaire Caco-2, mais dans des conditions où l’expression des fonctions différenciées des entérocytes ne sont pas optimales. De plus, les études réalisées n’ont pas pris en compte la nature particulière du milieu présent dans la lumière intestinale. Ce milieu est capable d’hydrolyser les matières exogènes ingérées en vue de leur absorption (présence d’enzymes digestives et de sels biliaires), ainsi que les microorganismes. Cet environnement est donc susceptible d’influencer significativement un potentiel cycle viral (entrée, réplication) associé aux cellules intestinales. Par ailleurs, à notre connaissance, aucune publication n’a encore décrit si la nature et la quantité des acides biliaires sécrétés par le foie sont perturbés chez les patients souffrant d’hépatite E aigue ou chronique.

 Dans cette demande de contrat d’initiation, nous proposons de mettre en place un modèle de cellules Caco-2 cultivées sur filtre semi perméable, délimitant ainsi un compartiment apical et un compartiment basolatéral. En les plaçant dans ces conditions appropriées, ces cellules se différencient et se polarisent de sorte que leur phénotype ressemble morphologiquement et fonctionnellement à celui des entérocytes tapissant l’intestin grêle. Ces cellules seront traitées ou non par des micelles lipidiques apportées au pôle apical, reproduisant le milieu présent dans le jéjunum pendant la digestion. En effet, c’est au niveau du jéjunum que le mucus qui protège l’épithélium des agressions chimiques et biologiques est le plus mince et que la majeure partie de l’absorption des nutriments se déroule. Dans tous les cas, nous testerons l’infectabilité des cellules par le VHE, le niveau de réplication viral dans celles-ci ainsi que la production de nouvelles particules infectieuses. Ces expériences permettront ainsi de déterminer les facteurs de digestion de l’hôte qui peuvent favoriser une infection ou le passage du virus au niveau de l’épithélium intestinal vers le milieu intérieur. 
Nous allons également caractériser le profil d’acides biliaires présents dans les selles et les sérums de patients infectés par le virus de l’hépatite E, par l’utilisation de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem. Une comparaison par rapport à des sujets sains permettra de déterminer si la production d’acides biliaires est modifiée chez les patients infectés par l’hépatite E. L’altération du profil peut bien sûr impacter la digestion et l’absorption des nutriments, le fonctionnement hépatique mais aussi celui d’autres organes, si l’on prend en compte leur fonction émergente comme molécule de signalisation. 

Ce projet impliquant une interaction entre deux groupes de recherche (Centre de recherche Saint Antoine, INSERM U938, Paris, et INSERM U1259, Tours) a été initiées en Avril 2019 lors de la réunion de l’AC42 ANRS « métabolisme lipidique et VHC ». L’ensemble des travaux accomplis grâce à ce contrat d’initiation constitueront les résultats préliminaires nécessaires pour présenter une demande de contrat de recherche et d’allocation de recherche à l’ANRS visant à poursuivre et compléter les travaux permettant de découvrir  la stratégie empruntée par le VHE qui lui permet de traverser la barrière gastro-intestinale afin d’accéder aux cellules hépatiques.

Le but de ce projet est d’étudier le rôle joué par une population de phagocytes mononucléaires intestinaux (MP) exprimant le récepteur de la fractalkine CX3CR1 lors d’une infection par le VIH-1 / SIV. Ces cellules sont essentielles pour le maintien de l’homéostasie intestinale et nous émettons l’hypothèse qu’elles jouent un rôle crucial dans les événements immunologiques complexes entraînant une altération de la barrière épithéliale, une translocation microbienne, une inflammation et une activation immunitaire qui caractérisent le patient infecté par le VIH-1, même lorsqu’il est mis sous traitement antirétroviral.

Sur la base de nos résultats non publiés, l’hypothèse est que la population de MP de la lamina propria intestinale CX3CR1 + est affectée très tôt pendant l’infection par le VIH-1 / SIV, contribuant à la perte de l’intégrité de la barrière intestinale. La réduction significative en nombre de cette sous population pourrait prédisposer l’hôte à une translocation bactérienne et à une inflammation intestinale exacerbée. De plus, une série d’études ont prouvé le rôle déterminant des MP CX3CR1 + dans les réponses du système immunitaire au microbiote. En effet, la composition du microbiote peut moduler la réponse des MP CX3CR1 +. Nous supposons que dans des conditions normales, des membres spécifiques du microbiote activent les voies cellulaires dans les MP CX3CR1 + chargés de limiter l’inflammation intestinale en limitant les réponses des cellules T inflammatoires et en favorisant la fonction de barrière muqueuse intestinale. Inversement, la composition modifiée du microbiote fréquemment associée à l’infection par le VIH-1 fournit des signaux alternatifs aux MP CX3CR1 +, les conduisant à une élimination des bactéries et favorisant l’inflammation intestinale. L’infection par le VIH-1 est caractérisée par l’établissement d’une dysbiose intestinale, qui se caractérise par une perte de bactéries productrices d’acides gras à chaîne courte (AGCC). Ce projet se focalisera sur l’étude de comment les changements dans la composition du microbiote intestinal et / ou les métabolites produits par ces bactéries affectent la façon dont les cellules cibles intestinales du VIH-1, y compris les MP CX3CR1 +, réagissent à l’infection.

En utilisant l’infection par le SIV de Cynomolgus macaques et des approches in vitro, ex vivo et in vivo, le projet se concentrera sur deux objectifs:

_ Déterminer l’impact de l’infection SIV sur les MP intestinaux CX3CR1 + et leur contribution à la perte d’intégrité de la barrière épithéliale et à l’activation immunitaire,

_ Analyser le comportement des cellules mononucléaires intestinales en cas de dysbiose.

À long terme, nous avons donc l’intention d’évaluer si la restauration du microbiote intestinal et / ou la préservation de la population de MP intestinales CX3CR1 + pourrait améliorer considérablement l’intégrité intestinale et réduire l’inflammation chronique. Cette recherche pourrait contribuer à une meilleure compréhension de l’infection par le VIH et permettre d’identifier, évaluer et développer de nouveaux agents ou stratégies pour traiter les patients infectés par le VIH.

Le génome du VIH subit des modifications épitranscriptomiques telles que la 2’O-méthylation de certains nucléotides de son ARN génomique. Une des conséquences de ces méthylations est que le VIH est mal reconnu par MDA5, un senseur de l’immunité innée, ce qui conduit à un défaut de l’induction de l’interféron de type I. Notre hypothèse, est que les méthylations internes observées sur le génome ont d’autres conséquences pro- & anti-virales. L’objectif de ce projet est de documenter les effets liés à ces méthylations internes du génome induites, entre autres, par FTSJ3, sur la réplication virale. En ce qui concerne les effets pro-viraux, nous tenterons de déterminer si les méthylations internes du génome confèrent la résistance du virus à la nucléase ISG20, induite par l’interféron. En ce qui concerne les effets anti-viraux, nous déterminerons si les méthylations du génome altèrent le processus de rétrotranscription, notamment dans les cellules ayant un faible pool de dNTP. Enfin, nous rechercherons des 2’O-Méthyltransférases cellulaires induites par l’interféron induisant éventuellement des hyper-méthylations du génome et agissant comme anti-viraux ou comme facteur de restriction. Nous pensons que ce travail de recherche permettra de comprendre au niveau moléculaire l’impact des modifications épitranscriptomiques sur le génome du VIH, sur la réplication du virus VIH-1 et sur sa pathogenèse.

Ces dernières années d’immenses progrès ont été réalisés dans notre compréhension de l’assemblage intracellulaire et du bourgeonnement du VIH-1 grâce aux avancées de la microscopie. Cependant, l’étape cruciale de libération des virions reste peu étudiée car elle ne peut être caractérisée par la seule microscopie. En conséquence, les données disponibles dans la littérature sur la libération des virions restent très approximatives car réalisées avec des populations de cellules dont les cinétiques de réplication du VIH-1 sont très hétérogènes. Notre objectif est d’apporter à la virologie conventionnelle la puissance des stratégies de nano/micro-fluidique (« viro-fluidique ») pour étudier la dynamique du relargage du VIH-1 à l’échelle de la cellule unique. Ce projet technologiquement ambitieux est porté par un consortium interdisciplinaire, composé de 4 équipes aux compétences reconnues et complémentaires en microfluidique, nanotechnologies, rétrovirologie et microscopie de molécules uniques.

Nous développerons un système microfluidique original qui permettra de mesurer en temps réel la libération des virus par des cellules individuelles. Cette puce microfluidique va devoir opérer plusieurs fonctions:

– Piégeage : Le circuit microfluidique thermostaté à 37°c va comporter une cale pour piéger une cellule unique dans un flux continu de milieu de culture, sans l’endommager. Le piège cellulaire doit immobiliser la cellule dans un écoulement mais permettre le relargage des virions. Plusieurs géométries ont d’ores et déjà été validées pour différents types cellulaires.

– Unicité : le circuit doit garantir par son design qu’une seule cellule soit piégée et perfusée, alors que l’ensemencement est opéré à partir d’une solution diluée de cellules. Un système à plusieurs entrées/sorties contrôlé par des valves pneumatiques sera utilisé pour garantir que le milieu collecté ne provienne que de la perfusion d’une cellule unique.

– Détection : En aval du piège, le circuit recevra des systèmes de quantification des virions fluorescents utilisant soit un comptage optique par caméra rapide soit par spectroscopie de corrélation de fluorescence (détection ponctuelle dans un faisceau laser). Pour les virions non-fluorescents nous utiliserons une technique de comptage par nanopore unique de type « track etched » intégré dans le système microfluidique.

            La puce sera installée sur le statif d’un microscope inversé à fluorescence pendant toute la durée de l’expérience. Cette dernière sera stoppée à la mort cellulaire observée par coloration au DAPI présent dans le milieu de perfusion. Nous étudierons les cellules modèles HeLa exprimant un VIH-1-GFP non-infectieux (∆env) et déterminerons pour la première fois la fréquence, la cinétique, la durée de la libération des virions et la quantité de virions produits par cellule. Cette étude permettra d’appréhender l’hétérogénéité de production entre cellules issues d’une même population. Puis, nous étendrons cette étude à plusieurs types cellulaires afin de faire état du degré de variation d’un type cellulaire à l’autre. Cette étude de la vitesse de libération des virus en fonction du temps de viabilité cellulaire nous permettra de mieux comprendre les stratégies adaptatives de production du VIH-1 à son hôte. Par ailleurs, nous ferons varier plusieurs paramètres physiques comme la vitesse du flux microfluidique, la tension membranaire, ou encore biochimiques en induisant l’activation des cellules (TNFalpha, LPS) afin d’appréhender la mécanistique de la libération des virions. A ce jour, toutes ces données ne sont pas connues car inaccessibles par l’utilisation d’approches conventionnelles.

            Les applications de la viro-fluidique sont nombreuses. Elle pourra être utilisée pour étudier ou découvrir des facteurs cellulaires ou viraux impliqués dans la libération des virus. Elle pourra également faciliter l’étude des mécanismes de réactivation de la production virale dans les cas de latence. De manière plus générale, les outils de viro-fluidique développés ici, aussi bien pour la capture cellulaire que pour la quantification des virus en flux, seront transposables à d’autres pathogènes.