Projets et candidats lauréats

activateurs de l’immunité innée. Une fois reconnus par des récepteurs cytosoliques, ils déclenchent la production de cytokines pro-inflammatoires et d’interférons. La voie de signalisation reposant sur les protéines cGAS et STING a été identifiée comme essentielle pour la détection des acides nucléiques cytosoliques. Néanmoins, nous avons pu montrer que, dans des cellules dépourvues de cGAS, la présence d’ADN double brin cytosolique peut induire la production d’interférons. Cela indique la présence de voies de détection des acides nucléiques qui opèrent en l’absence de cGAS. Nous avons identifié qu’en l’absence d’une voie cGAS-STING active, des protéines appartenant à la voie de réparation de l’ADN par jointure d’extrémités non-homologues (ou « non-homologous end-joining » (NHEJ)), en particulier PRKDC et PAXX, jouent un rôle majeur dans la détection des ADNs double brins cytosoliques. En effet, des analyses biochimiques et fonctionnelles montrent que l’activité catalytique de la protéine PRKDC est nécessaire pour les réponses inflammatoires indépendantes de cGAS et que PAXX est un régulateur négatif de ces réponses. Nous proposons d’étudier la contribution de la voie du NHEJ, et en particulier de PAXX, aux réponses inflammatoires associées au VIH-1.

Sur la base de nos données préliminaires, j’émets l’hypothèse qu’en absence de cGAS, l’ADN double brin dérivé du VIH-1 peut être détecté par la voie du NHEJ et que PAXX régule négativement  cette voie de signalisation. Pour tester cette hypothèse, nous poursuivrons 3 objectifs:

1. Caractériser les déterminants du recrutement du NHEJ sur l’ADN double brin cytosolique en absence de cGAS.
2. Évaluer la contribution du NHEJ et en particulier de PAXX sur la détection immunitaire innée dans les cellules qui n’expriment pas cGAS.
3. Étudier l’impact des composantes du NHEJ sur la réponse inflammatoire associée au VIH-1.

La réalisation de ces objectifs me permettra de démontrer que les protéines du NHEJ, en particulier PAXX, sont des régulateurs clés des réponses inflammatoires associées au VIH-1. Ceci est d’autant plus intéressant car les traitements actuels qui visent à réduire l’inflammation associée aux acides nucléiques ciblent principalement la voie de signalisation associée à cGAS. Cependant, nos données montrent que lorsque cGAS est absent, la voie du NHEJ déclenche des réactions inflammatoires qui peuvent avoir des effets délétères supplémentaires. L’inhibition de l’activité catalytique de PRKDC peut bloquer cette réponse inflammatoire indépendante de cGAS. En conséquence, ce projet permettra de mettre en lumière de nouvelles voies pour moduler ou prévenir l’inflammation associée au VIH-1.

Le tissu adipeux (TA) est un tissu largement affecté lors de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) puisqu’il est ciblé simultanément par le virus et les molécules antirétrovirales (ARV). Les perturbations des fonctions métaboliques et sécrétoires du TA ont des répercussions sur l’ensemble de l‘organisme en particulier sur les aspects métaboliques et inflammatoires qui participent au risque cardio-métabolique. Par ailleurs, des données récentes de la littérature suggèrent que le TA pourrait également jouer un rôle anti-infectieux majeur, de par la présence de lymphocytes T (LT) mémoires résidents en son sein. Les perturbations du TA pourraient contribuer à trois aspects majeurs de la physiopathologie de l’infection par le VIH : le risque cardiovasculaire et dysmétabolique, la persistance virale et les perturbations immunitaires.

Nous posons l’hypothèse que les dysfonctions du TA, observées au cours de l’infection par le VIH, conduisent à des atteintes métaboliques, qui seraient responsables de la mise en place des perturbations immunitaires. L’objectif de ce projet est de mieux caractériser la biologie du TA, en étudiant simultanément les versants immunologique et métabolique de ce tissu, et d’identifier les nœuds d’interaction entre les perturbations métaboliques et immunitaires observées chez les patients. Nous avons défini trois objectifs :

(1) Evaluer l’impact synergique de l’infection chronique par le VIH/SIV et des ARV sur les composantes métabolique et sécrétoire du TA. L’originalité de ce travail est de caractériser le contexte de l’infection chronique par le VIH/VIS, en intégrant la toxicité des nouveaux ARV (en particulier les inhibiteurs d’intégrase (dolutégravir et raltégravir)) et la persistance virale au sein du TA. Nous étudierons les modifications morphologiques (fibrose, vascularisation, taille adipocytaire) et fonctionnelles du TA (adipogenèse, insulino-résistance, lipolyse). L’implication de différentes voies, telles que la sénescence, l’inflammation, ou le stress oxydant, sera étudiée.

(2) Evaluer l’impact synergique de l’infection chronique par le VIH/SIV et des ARV sur les capacités immunitaires du TA. L’étude des propriétés fonctionnelles comprendra une analyse des capacités effectrices, des profils d’épuisement et de sénescence des LT mais aussi du potentiel de migration de ces derniers, notamment vers les sites lymphoïdes. Des études de mobilité seront réalisées par microscopie dynamique in vivo et ex vivo sur explants.

(3) Identifier les mécanismes impliqués dans ces interactions entre métabolisme et immunité dans le contexte de l’infection par le VIH. Plusieurs mécanismes peuvent être impliqués dans ce dialogue. Un de nos axes d’étude sera la caractérisation du double rôle des ASC qui, en complément de leur activité pro-adipogénique, présentent des activités immunosuppressives. Un deuxième aspect sera aussi d’évaluer l’impact de la fibrose du TA sur la mobilité des cellules immunitaires. A l’inverse, les modifications immunitaires du TA peuvent impacter sur sa fonction métabolique et jouer un rôle dans l’insulinorésistance et le profil dysmétabolique. Les associations entre ces différents paramètres seront étudiées dans les modèles animaux VIS et confirmées chez les patients.

Ce travail collaboratif vise à démontrer l’impact direct des perturbations métaboliques sur la qualité des réponses immunitaires, non seulement au sein du TA, mais aussi aux sites lymphoïdes de proximité dans le contexte de l’infection par le VIH. Si tel est le cas, nos résultats identifieraient le TA comme un organe central, non seulement pour les équilibres métaboliques, mais aussi pour la qualité des réponses anti-infectieuses. Cette problématique pourrait être d’autant plus importante chez les patients vivant avec le VIH que la population des patients infectés vieillit progressivement et est plus sensibles aux déséquilibres métaboliques et infectieux. Ce travail pourrait permettre de mieux cibler les actions thérapeutiques de restauration de l’homéostasie du TA, et ainsi réduire le risque cardio-métabolique et les perturbations immunitaires chez les patients.

Contexte et rationnel

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), bactérie causale de la tuberculose (TB), est l'agent bactérien le plus mortel au monde et associé à l'émergence de la multirésistance. Le granulome est central dans l'immuno-pathogénie de la TB, jouant le rôle d’incubateur de mycobactéries. Sa composition cellulaire et son microenvironnement déterminent sa trajectoire. Des données récentes indiquent que les cellules Natural Killer (NK) NK sont indispensables au contrôle de la TB, au carrefour de l'immunité innée et de l'immunité adaptative. En contexte hyper-endémique, il a été suggéré que les individus "résistants innés" ne développent pas la TB grâce à l'activité protectrice des cellules NK. Dans le contexte de TB active, le contrôle des mycobactéries dans les granulomes est associé à une réponse adaptative Th1-Th17 cytotoxique et une proportion in situ plus élevée de cellules T/NK. Les cellules NK sont donc des candidates intéressantes comme biothérapie adjuvante.

Objectifs

L'objectif du projet NaKiTi est d'utiliser un modèle organoïde humain pour étudier la composition cellulaire et le microenvironnement immunorégulateur du granulome infecté par Mtb chez les individus naïfs et présentant une infection tuberculeuse latente (LTBI). De plus, en tirant parti du cadre conceptuel de l'immunothérapie du cancer, nous testerons une intervention adjuvante basée sur le transfert adoptif dans le modèle de cellules NK activées. Les signaux produits par le microenvironnement du granulome Mtb qui régulent l'activité des cellules NK seront étudiés. Plus spécifiquement, l'infection par Mtb de PBMCs naïfs renseignera sur l'interaction primaire entre les agrégats de macrophages infectés et les cellules NK et permettra de déterminer si une biothérapie de cellules NK activées peut induire l'éradication de Mtb. L'infection par Mtb des PBMCs d’individus LTBI permettra de comprendre l'interaction dynamique entre les cellules NK et les cellules T, et de déterminer si une biothérapie de cellules NK activées stimule l'activité des cellules T en aval.

Methodes

Nous utiliserons un modèle optimisé de granulome spatio-temporel in vitro 2.5 dimensionnel basé sur les cellules mononuclées sanguine humaines (PBMC) formant une monocouche sur une matrice extracellulaire s’organisant en agrégats granulomateux microscopiques en réponse à la souche virulente de Mtb H37Rv et avirulente H37Ra. La charge mycobactérienne et la composition du microenvironnement des granulomes seront étudiées à différents temps par l’étude : (i) du morphotype des granulomes par un score microscopique. (ii) Du microenvironnement immunitaire par la mesure des cytokines Th1, Th17, Th2 et de chimiokines clés dans les surnageants, ainsi que de l'enzyme indoleamine 2-3 dioxygénase. (iii) Immunophénotypique des cellules NK et T par analyse en cytométrie spectrale des principaux marqueurs d'expression. (iv) Du contrôle de l'infection à Mtb par comptage des unités formant colonies après rupture du granulome et lyse cellulaire, ainsi que de la dormance de Mtb en cultivant des bactéries du même micro-puits avec ou sans surnageant de culture filtré de la phase logarithmique tardive pour ressusciter les mycobactéries dormantes.

Calendrier

Le projet NaKiTi durera 36 mois, comprenant une première phase d'optimisation du modèle (T0 à mois 12). Puis une deuxième phase consacrée à la collecte des résultats caractérisant l'immuno-régulation et la trajectoire des granulomes (mois 12 à 24), suivie d’une troisième phase consacrée aux expériences de transfert adoptif (mois 18 à 30). La dernière phase consistera à analyser, valoriser et diffuser les résultats de NaKiTi (mois 30 à 36).

Retombées

Ce modèle préclinique in vitro de granulome humain infecté par Mtb permettra de disséquer les voies immuno-régulatrices de l’activité des cellules NK dans le granulome et son micro-environnement. Le modèle permettra de valider si une biothérapie adjuvante par cellules NK activées augmente la clairance bactérienne et restreint la trajectoire des granulomes infectés par Mtb. Il s'agit de la première étape d'une stratégie de recherche visant à tester l'utilité d'une telle biothérapie dans la TB.

La protéine TRBP est une protéine impliquée dans divers mécanismes biologiques, tels que la réplication du virus HIV, ou en tant que co-facteur de la protéine Dicer, une RNase cytoplasmique de type III impliquée dans l’une des étapes de maturation des miARNs. Au cours de l’infection cellulaire par le virus HIV, TRBP favorise notamment la propagation virale en bloquant le caractère inhibiteur de l’ARN TAR viral sur la traduction des protéines virales, ou encore en interagissant directement avec les protéines PACT ou PKR, deux facteurs favorisant la multiplication du virus. Récemment, nous avons mis en évidence au laboratoire une interaction inédite entre la protéine TRBP d’une part, et la protéine RPAP3 d’autre part, qui appartient au complexe d’assemblage R2TP. Ce complexe multiprotéique joue le rôle de chaperon pour l’assemblage de diverses particules ribonucléoprotéiques, telles que les petites particules nucléolaires ou l’ARN polymérase II. Son implication et son rôle au cours du cycle viral du HIV ou de la maturation des miARNs n’a toutefois jamais été décrite. Notre mise en évidence d’une interaction directe entre la protéine TRBP et la protéine RPAP3 nous permet de proposer ce projet dans lequel nous tenterons de déterminer quels sont les fonctions possibles de la protéine RPAP3 et du complexe R2TP, en connexion avec TRBP, dans la réplication du virus.

Le traitement antirétroviral (ARV) permet de normaliser l’espérance de vie des personnes vivant avec le VIH, mais ce traitement n’est pas curatif en raison de la persistance d’un pool de cellules infectées de manière latente et nécessite une prise à vie. Une toxicité à long terme des ARV, les problèmes d’observance, de résistance, de coût et d’accès ainsi que la stigmatisation sont autant d’arguments en faveur de la recherche d’un traitement curatif. Les stratégies curatives testées jusqu’alors chez des personnes sous ARV depuis plusieurs années n’ont montré aucun succès. A l’inverse, une étude récente a montré qu’un traitement à visée curative administré à l’initiation des ARV, c’est-à-dire lors de l’infection productive, pouvait induire un contrôle virologique à l’arrêt du traitement. Bien que la demi-vie des cellules productivement infectées soit courte, de l’ordre de deux jours, elles sont le support de la réplication virale et responsables de la dissémination du virus à l’échelle de l’organisme. Cependant, ces cellules productivement infectées sont incomplètement caractérisées.

Notamment, leur spécificité antigénique est peu connue alors qu’elle pourrait jouer un rôle central dans la physiopathologie de l’infection à VIH à la fois lors de l’établissement initial et de la persistance sous ARV. D’anciennes études ont montré de manière indirecte l’infection préférentielle, sans différencier l’infection latente de l’infection productive, de cellules d’une spécificité antigénique donnée. Globalement, les cellules spécifiques du VIH et de M. tuberculosis seraient préférentiellement infectées, alors que d’autres sembleraient épargnées (CMV). Cette infection préférentielle pourrait être expliquée par le profil fonctionnel et phénotypique de ces cellules. En effet, l’expression variable de certains facteurs ayant trait à l’entrée du VIH, la restriction et l’immunosénescence selon la spécificité antigénique expliqueraient une infection préférentielle ou une résistance à l’infection. Cependant, (1) les spécificités antigéniques des cellules productivement infectées restent peu documentées, (2) ces spécificités ont été indirectement caractérisées, et (3) les facteurs liés à une infection préférentielle ne sont pas clairement définis.

Objectifs: Le but est de déterminer la spécificité antigénique des cellules productivement infectées et d’identifier les facteurs favorisant/défavorisant l’infection de cellules spécifiques de certains antigènes.

Hypothèses: Les cellules productivement infectées par le VIH sont spécifiques du VIH lui-même, et cette infection préférentielle est liée à l’expression de facteurs favorisant l’infection.

Méthodologie: D’abord, afin d’identifier la spécificité antigénique des cellules productivement infectées, nous avons récemment développé une approche combinant AIM assay (expression de marqueurs d’activation) et HIV-Flow (expression de la protéine de capside p24) par cytométrie en flux. Cette technique sera appliquée à des échantillons de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de personnes non traitées. Les spécificités antigéniques testées vont inclure : CMV, VIH, grippe, M. tuberculosis et SARS-CoV-2. Ensuite, le phénotype des cellules spécifiques d’un antigène donné enrichies en infection productive ainsi que celui des cellules productivement infectées sera analysé pour l’expression de facteurs jouant un rôle dans l’entrée du virus (IL-2, CD25, CCR5 et MIP-1β), la restriction (SAMHD1, APOBEC3G et BST-2) et l’immunosénescence (PD-1, PD-L1 et TIGIT).

Éthique: Ce projet requiert le recueil de PBMC de personnes vivant avec le VIH (étude APRIL, autorisation CPP Est I 2022-A02567-36 le 15/1/2023).

Résultats attendus: Ce contrat d’initiation a pour but de montrer la faisabilité de l’approche et son intérêt dans la détermination de la spécificité antigénique de cellules infectées, avant la réalisation d’une étude plus large focalisée cette fois-ci sur les cellules infectées de manière latente chez des personnes sous ARV. En fonction du(des) pathogène(s) identifié(s) et des facteurs associés, des stratégies thérapeutiques pourraient être envisagées pour cibler ces cellules dans un but curatif.