Projets et candidats lauréats

Le virus de l’hépatite E est la principale cause d’hépatite aiguë et touche 20 millions de personnes dans le monde par an. Souvent spontanément résolutive, l’hépatite E peut devenir fulminante chez les femmes enceintes, ou chronique chez les patients immunodéprimés.

Quatre génotypes affectent l’Homme. Les génotypes 1 et 2 se transmettent par voie féco-orale, généralement par l’eau contaminée. Les génotypes 3 et 4 ont une transmission zoonotique via la consommation de viande de porc ou de gibier crue ou peu cuite. En Europe, où circule principalement le HEV de génotype 3, l’hépatite E est considérée comme une maladie émergente.

De nombreux aspects du cycle viral sont à élucider car le HEV est longtemps resté difficile à amplifier in vitro. Récemment, un système efficace de culture utilisant la souche infectieuse p6 de génotype 3 a été mis au point dans notre équipe (Montpellier et al., 2018). Celui-ci permet de produire des particules virales infectieuses in vitro et in vivo ainsi que des protéines virales en grande quantité. Le génome du HEV est un ARN de polarité (+) composé de 3 cadres ouverts de lecture (ORF). Les protéines structurales sont l’ORF2p qui correspond à la capside virale et l’ORF3p, une phosphoprotéine impliquée dans la sécrétion des particules. L’ORF1 code une polyprotéine non structurale, l’ORF1p ou réplicase virale. La maturation de l’ORF1p, l’identification des compartiments cellulaires associés à la réplication du HEV ainsi que sa capacité à induire une réorganisation de l’architecture membranaire constituent des aspects de la réplication virale peu ou pas explorés. Dans ce projet de recherche, nous proposons donc de les étudier en caractérisant la réplicase ORF1p.

Nous avons déjà obtenu des résultats préliminaires très intéressants. Aucun anticorps anti-ORF1p n’étant fonctionnel dans des systèmes cellulaires réplicatifs, nous avons inséré des épitopes dans la région hypervariable et à l’extrémité C-terminale de la réplicase virale. Ces insertions permettaient de préserver la capacité réplicative de la souche HEV p6 de génotype 3. Pour la première fois, nous avons pu détecter l’ORF1p étiquetée dans un système cellulaire réplicatif. De façon surprenante, la protéine détectée migrait à plus de 180kDa, une taille correspondant à l’ORF1p non maturée. Des analyses par microscopie confocale ont révélé une localisation nucléaire et cytoplasmique de l’ORF1p étiquetée ce qui a été confirmé en Western blot. Enfin, nos premières analyses par microscopie électronique à transmission de cellules infectées par la souche HEV p6 indiquent la présence de structures vésiculaires en cluster avec une membrane dense aux électrons. Ceci suggère que le HEV pourrait induire des réarrangements membranaires dans la cellule hôte.

Dans ce projet, la maturation de l’ORF1p sera étudiée en détails par différentes approches biochimiques sensibles telles que des marquages métaboliques et des immunoprécipitations, afin de tenter de détecter des formes potentiellement clivées et peu abondantes. Puis, nous étudierons la localisation subcellulaire de l’ORF1p. Pour cela, des co-immunofluorescences utilisant des marqueurs de compartiments cellulaires seront réalisées et analysées en microscopie confocale. L’ORF1p produisant un ARN intermédiaire double brin (dsRNA), nous projetons également de comparer la distribution de ORF1p avec celle des dsRNA. Enfin, en utilisant des analyses par immuno-microscopie électronique, nous caractériserons les réarrangements membranaires potentiels dans la cellule hôte à l’aide d’un réplicon stable du HEV ou de la souche p6 infectieuse exprimant l’ORF1p étiquetée. En complément, ces 3 aspects seront explorés dans le contexte de la souche Sar55 de génotype 1 dont nous disposons également au laboratoire.

Le développement de notre projet de recherche devrait donc apporter une connaissance pointue sur les interactions entre le HEV et la cellule pendant la réplication. Au delà d’avancées majeures dans le domaine de la recherche fondamentale sur ce virus, nos travaux pourraient également conduire à l’identification de cibles thérapeutiques conduisant au développement de nouveaux antiviraux.

La tuberculose (TB), provoquée par la bactérie Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) a été responsable de plus d’un million de décès dans le monde en 2021. Par conséquent, déchiffrer les mécanismes moléculaires permettant au bacille de la tuberculose, M. tuberculosis, de prospérer à l’intérieur de son l’hôte a pour objectif de  permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. A cet égard, les cytokines de la famille de l’IL-1 produites par les macrophages alvéolaires sont des effecteurs cruciaux de la réponse immunitaire contre M. tuberculosis. Ainsi, la production des cytokines de la famille de l’IL-1 nécessite la détection microbienne par les recepteurs intracellulaires et pro inflammatoires inflammasomes, un processus que M.tuberculosis évite efficacement grâce à ses facteurs de virulence. Cela soulève la question de savoir si d’autres recepteurs intracellulaires ont le potentiel de surmonter l’evitement de la détection immunitaire provoquée par M. tuberculosis. Ici, nous avons isolé un recepteur immunitaire spécifique, le complexe inflammasome NLRP1, fortement exprimé dans les macrophages alvéolaires humains et capable de détecter un facteur clé de la virulence de M. tuberculosis, PknG. Par conséquent, ce projet vise à déterminer les mécanismes moléculaires qui favorisent l’activation de l’inflammasome NLRP1 et son implication dans la modulation de la réponse immunitaire à M. tuberculosis.

Ce projet étudie les déterminants de la transmission du CoViD-19 au Burkina Faso en s’intéressant plus particulièrement aux facteurs comportementaux et environnementaux qui favorisent la propagation de la maladie. Nous exploitions une enquête initiale conduite parmi 800 ménages de la région Centre Sud quelques mois avant l’épidémie pour identifier l’effet de l’accès à l’information au sujet des gestes préventifs, de la contrainte budgétaire des ménages et de l’exposition à la pollution de l’air (PM2.5) sur le risque de contracter la maladie. Une expérimentation aléatoire sera conduite au sein de l’échantillon afin d’éclairer ces relations. Elle croisera d’une part un traitement informationnel visant à complémenter les campagnes d’information publiques et d’autre part un traitement économique consistant en des transferts de liquidités non-conditionnels dont l’objectif sera de stimuler l’adoption de gestes barrières par les ménages (lavage de mains, port de masques, etc). Tous les ménages de l’échantillon seront ré-interviewés avant et après l’assignation aux traitements afin de documenter les processus d’apprentissage liés à la maladie ainsi que l’évolution des pratiques préventives. Des données sur l’exposition aux particules fines collectées pour 550 individus de l’échantillon à la fin de l’année 2019 seront mobilisées pour analyser la relation entre pollution de l’air et incidence de cas sévères de CoViD-19. La base de données de panel qui sera disponible à la fin de l’étude contribuera significativement à améliorer notre compréhension de l’épidémie actuelle de CoViD-19 au Burkina-Faso et livrera des enseignements précieux pour les politiques de santé publique et environnementale visant à contenir de futures épidémies de coronavirus.

En 2019, la population d’enfants non infectés exposés au VIH (HEU) a atteint 15,2 millions. Cette population continuera de s’accroître, avec près d’un million d’enfants nés de mères infectées par le VIH (HEU) chaque année. Les données récentes montrent que les HEU sont en moins bonne santé que les enfants non infectés et non exposés au VIH (HUU), sans que les mécanismes sous-jacents qui expliquent cette différence essentielle ne soient clairement établis. La plupart des femmes vivant avec le VIH tombent enceintes alors qu’elles suivent déjà un traitement antirétroviral, exposant ainsi les HEU aux antirétroviraux maternels (ARV) et au VIH, de la conception à la naissance. Ces HEU peuvent par la suite continuer d’être exposés à la fois aux ARV maternels et au VIH par le biais du lait maternel, et à leur propre régime ARV prophylactique, le cas échéant. Cette situation a d’ailleurs incité Powis et Siberry à plaider en faveur d’un suivi à long terme des HEU, indépendamment de leur exposition au VIH/ARV.

De nombreuses déficiences chez les HEU pourraient être liées à des dysfonctionnements mitochondriaux. Les signes cliniques des mitochondriopathies pédiatriques, principalement associés à des troubles neuromusculaires, neurologiques et du développement neurologique, pourraient recouper les dysfonctionnements observés chez ces enfants. Par ailleurs, l’exposition au VIH est connue pour modifier l’activité mitochondriale et les ARV induisent une instabilité de l’ADN mitochondrial (ADNmt).

La génotoxicité mitochondriale a été étudiée depuis de nombreuses années chez les HEU, les études se concentrant principalement sur le nombre de copies d’ADNmt par cellule (MCN). La plupart de ces études ont fait état d’un MCN inférieur chez les HEU par rapport aux HUU. Outre ce résultat, l’intégrité de la molécule d’ADNmt, c’est-à-dire les mutations ponctuelles et les grandes délétions (délétome), peut également être altérée dans le contexte de l’infection par le VIH, bien que les données pédiatriques soient rares et obtenues à partir de techniques non quantitatives. 

Avec le Centre national de référence des maladies mitochondriales (Angers), nous avons eu accès à un outil de diagnostic robuste combinant une approche de séquençage de nouvelle génération et un algorithme original d’analyse des séquences. Dans une étude préliminaire, nous avons établi les profils du délétome et de mutations ponctuelles de l’ADNmt dans le sang total de 32 HEU âgés de 7 jours. Nous avons observé que 24 des 32 enfants (75%) avaient des molécules d’ADNmt délétées, avec un taux d’hétéroplasmie, c’est-à-dire la coexistence de molécules d’ADNmt de type sauvage et de molécules d’ADNmt délétées au sein d’une cellule, allant de 0,01% à 84%. Étant donné que ces molécules ne peuvent pas être réparées et continuent de s’accumuler tout au long de la vie, il est nécessaire de procéder à une caractérisation complète de la génotoxicité mitochondriale chez les enfants HEU, qui tienne compte des expositions actuelles au VIH et aux ARV.

Nous profiterons du projet PROMISE-EPI en cours, de phase II/III, qui recrute des paires mère-enfant pour évaluer une intervention de secours de prévention de la transmission mère-enfant du VIH. Nos objectifs spécifiques visent à décrire la toxicité mitochondriale chez des HEU, des enfants non infectés non exposées et des enfants séropositifs au cours de la première année de vie, à évaluer l’innocuité des différents régimes de PrEP et à déterminer si les délétions de l’ADN mitochondrial sont héritées verticalement ou acquises de novo après l’exposition.

La génotoxicité mitochondriale sera évaluée en mesurant le MCN, le délétome de l’ADNmt, le pourcentage d’hétéroplasmie et la présence de mutations ponctuelles.

La sécurité est la priorité absolue pour les interventions de prévention visant un grand nombre de personnes. Bien que les effets néfastes à long terme de l’exposition aux ARV pour la PTME restent mal identifiés, ce projet contribuera à l’étude des mécanismes potentiels qui expliqueraient la santé des HEU, c’est-à-dire l’association entre la génotoxicité mitochondriale et l’exposition au VIH/ARV.

Titre du projet en français : Perte de suivi dans le soin de sujets infectés par le VIH, croisement des cohortes ANRS PRIMO, COPANA et CODEX avec la base hospitalière ANRS-CO4 FHDH

Mots clés en français : (5)

Perdus de vue, conditions de vie, facteurs socio-économiques, VIH, cohorte

Résumé :

Contexte : La rétention dans le soin des personnes vivant avec le VIH (PVVIH) est un enjeu majeur. Les études sur les perdus de vue sont surtout issues de données d’études menées en Afrique sub-Saharienne et en Amérique du Nord.

Alors que le contexte social et de prise en charge est très différent en Europe de l’Ouest avec dans la plupart des pays un accès gratuit et universel aux soins et aux traitements, les études sur le sujet y sont moins nombreuses, et la recherche des transferts silencieux dans d’autres centres de soins potentiellement en cause dans les pertes de suivi dans les cohortes et d’une sur-estimation des pertes de vue du soin, est rarement mise en œuvre.

L’objectif général de ce contrat d’initiation est d’évaluer la faisabilité du croisement des cohortes ANRS VIH PRIMO, COPANA et CODEX avec les données de suivi dans la base des données hospitalières ANRS-CO4 FHDH afin d’évaluer la perte de suivi du soin des personnes infectés par le VIH en France, et d’analyser les facteurs associés à cette perte de suivi dont notamment les facteurs socioéconomiques, l’existence d’un syndrome dépressif, le mode de vie.

Identification des sujets des cohortes PRIMO, COPANA et CODEX dans la base ANRS-CO4 FHDH : un appariement direct sera réalisé sur le numéro Thirion de pseudonymisation, déjà généré et présent dans les bases des différentes cohortes et de la FHDH. Pour les sujets pour lesquels il n’y a pas eu de correspondance sur le numéro Thirion, un appariement indirect sur un ensemble de plusieurs variables sera effectué.

Caractère innovant de la recherche : Les données des sujets recueillies dans les cohortes et leurs données de suivi dans la base hospitalière FHDH, seront réunies dans une seule base. L’intérêt est la richesse des données recueillies dans les cohortes PRIMO, COPANA, CODEX (caractéristiques socio-économiques, mode de vie, stigmatisation, dépression), couplée à la possibilité d’accès à des données complémentaires de suivi de la base ANRS-CO4 FHDH sur un nombre plus large de centres, permettant de récupérer le suivi des patients perdus de vue des cohortes PRIMO, COPANA, CODEX en raison de transferts silencieux vers des centres ne participant à ses cohortes, ou après la fin de suivi de la cohorte elle-même (i.e en 2016 pour COPANA).

Il s’agira d’étudier à terme, sur cette base issue du croisement des données des cohortes PRIMO, COPANA, CODEX, avec celles de la FHDH :

– les facteurs associés à la perte de suivi, à court, moyen et long terme dans le soin, avec le bénéfice de l’apport des variables collectées dans les cohortes, permettant ainsi la prise en compte d’un grand nombre de facteurs, dont certains ont été rarement pris en compte jusqu’à ce jour dans la littérature tels que les facteurs socio-économiques et les conditions de vie ;

– l’évolution du contrôle virologique sur tout le temps de suivi, par l’analyse de la proportion de personnes-mois passés avec une perte du contrôle virologique (i.e. une charge virale détectable, à court, moyen et long terme, après l’initiation du traitement), et les facteurs associés, en tenant compte des facteurs socio-économiques, d’un suivi irrégulier ou non dans les soins ;

– le statut clinico-immuno-virologique, des sujets, au dernier suivi, à long terme après l’initiation du traitement, et les facteurs associés, en tenant compte des facteurs socio-économiques, d’un suivi irrégulier ou non dans les soins.

Les lymphocytes T CD4 + sont les principales cibles de l’infection par le VIH-1. Le virus est reconnu par les senseurs du système immunitaire inné dès son entrée dans les cellules cibles, conduisant à la production de cytokines antivirales et pro-inflammatoires. Cependant, l’infection des lymphocytes T CD4 + par le VIH-1 conduit à une production extrêmement faible d’IFN qui ne permet pas une activation suffisante de la réponse antivirale, suggérant que le virus est capable de bloquer cette réponse qui serait délétère pour sa réplication.

L’autophagie est une voie catabolique majeure impliquée dans plusieurs fonctions cellulaires importantes. Notamment, c’est un mécanisme d’immunité intrinsèque car il permet la dégradation des agents pathogènes après leur entrée dans les cellules cibles. De plus, l’autophagie permet la dégradation de plusieurs médiateurs de l’immunité innée permettant un retour à un état basal du système immunitaire après son activation suite à une infection. Par conséquent, les agents pathogènes ont développé des mécanismes leur permettant de bloquer l’autophagie ou de l’utiliser à leur propre profit afin de favoriser leur réplication. En particulier, de plus en plus d’études montrent que les virus utilisent l’autophagie pour bloquer la réponse IFN. Dans ce contexte, les mitochondries et les peroxisomes sont deux organelles cellulaires impliquées dans la réponse immunitaire innée et qui sont ciblées par l’autophagie au cours d’infections virales.

Nous avons montré que les protéines d’enveloppe du VIH-1 (Env) induisent l’autophagie dès la phase d’entrée du VIH-1 dans les LT CD4+ mais ce processus est rapidement bloqué et inhibé dans ces cellules lorsque l’infection devient productive, suggérant que le VIH-1 a développé des stratégies pour le contrôler. De façon intéressante, nos résultats préliminaires indiquent que l’autophagie, induite transitoirement à l’entrée du virus dans les LT CD4+, favorise sa réplication. Récemment, nous avons montré que les peroxysomes sont des cibles de l’autophagie induite par Env (mécanisme appelé « pexophagie »). De plus, nos résultats (non publiés) suggèrent que les mitochondries pourraient être ciblées par l’autophagie induite dans les phases précoces de l’infection des LT CD4+ par le VIH-1 (processus appelé « mitophagie »). Ces deux organelles, mitochondries et peroxysomes, sont d’important médiateurs de la réponse au stress oxydatif.

Notre projet a pour objectif de caractériser plus en avant les processus de mitophagie et de pexophagie induits dans les étapes précoces de l’infection par le VIH-1 et de définir leurs conséquences sur la réponse immunitaire contre ce virus. Il se décline en 3 grandes étapes :

– Etude de la dynamique de dégradation des mitochondries et des peroxysomes dans les premières étapes de l’infection par le VIH-1.

– Recherche des mécanismes d’autophagie sélective impliqués dans la dégradation des mitochondries et des peroxysomes.

– Effet de la dégradation des mitochondries et des peroxysomes sur l’état oxydatif de la cellule infectée et conséquences sur l’homéostasie cellulaire, la réponse immunitaire innée et l’inflammasome.

Plusieurs travaux font état du rôle de l’autophagie au cours de l’infection par le VIH-1 dans différents contextes cellulaires mais aucune étude n’a mis en évidence son rôle dans les 1ères étapes du cycle de réplication du virus dans les LT CD4+. Il est donc important de progresser dans cette compréhension afin de pouvoir proposer, à plus long terme, de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur la réponse cellulaire.