Projets et candidats lauréats

La réplication rétrovirale se déroule grâce à une étape obligatoire, l’intégration, qui est essentielle pour une expression génique virale efficace et garantit une ségrégation égale du matériel génétique du virus aux cellules filles après la division cellulaire. Bien que l’intégration rétrovirale se produise dans tout le génome humain, elle n’est pas entièrement aléatoire. Les lentivirus tels que le VIH, par exemple, ciblent de préférence les gènes actifs. Des recherches effectuées au cours des dernières années ont révélé que le facteur cellulaire associé à la chromatine, LEDGF/p75, et, plus récemment, le facteur nucléaire CPSF6 jouent un rôle dominant dans l’intégration du VIH dans les gènes actifs. Comme le VIH ne nécessite pas de division cellulaire pour pénétrer dans le noyau, l’ADN viral pour accéder à la chromatine rentre dans le noyau à travers le complexe de pores nucléaires (NPC).

Les NPC jouent un rôle important dans l’organisation de la chromatine 3D, ainsi que dans la régulation de l’expression des gènes cellulaires et, probablement, des gènes viraux. De plus, des études récentes, dont la nôtre, ont montré l’implication de certains Nups dans l’infection par le VIH. Récemment, nous avons montré que l’environnement de la chromatine à proximité des NPC favorisait la réplication virale. Plus récemment, nous avons publié une étude montrant qu’un autre facteur nucléaire, le CPSF6, joue un rôle important dans la sélection des sites d’intégration dans la chromatine active et dans les régions à majeur densité génique. Cependant il est possible que Nups et CPSF6 coopèrent pour autoriser une réplication efficace du VIH.

Des études sur différents parasites qui s’intègrent en permanence dans le génome de l’hôte montrent qu’ils ont évolué pour cibler la chromatine de manière à optimiser leur coexistence avec les hôtes et à favoriser la libération de nouveaux descendants viraux. En revanche, les lymphocytes T infectés par le VIH-1 ne survivent généralement qu’un jour ou deux avant d’être tués par le système immunitaire cellulaire ou par la toxicité de l’infection. Ainsi, le VIH doit libérer des taux élevés de virus dans les quelques jours suivant l’infection. L’intégration virale dans les gènes actifs est généralement favorable à une transcription efficace expliquant potentiellement la préférence de ciblage. Cependant, le VIH peut également coexister pendant des périodes prolongées en tant que chimère dans le génome de patients infectés comme virus latent. Par conséquent, les mécanismes sous-jacents à ce phénomène sont encore à l’étude et il est fort possible que les facteurs de chromatine associés aux protéines d’entrée nucléaire puissent jouer un rôle critique sur la persistance du VIH dans les cellules infectées.

Dans notre laboratoire, nous avons récemment mis au point un nouvel outil d’imagerie qui peut permettre de visualiser en temps réel l’ADN viral une fois retrotranscrit jusqu’à son intégration dans la chromatine de la cellule hôte. Cette technologie révolutionnaire sera l’occasion d’élucider la dynamique de l’interaction entre le génome de l’ADN viral et les facteurs de l’hôte ou d’identifier les sites de la chromatine impliqués dans la transcription ou la latence virale.

Dans le projet proposé, nous explorerons le lien entre le NPC et les sites d’intégration du VIH pour caractériser le rôle intrigant et inconnu des nucléoporines, des facteurs nucléaires et des «topologically chromatin associating domains» ou des régions régulatrices comme les « super enhancers »  pour orchestrer la transcription virale.

Les thérapies antirétrovirales suppriment efficacement la virémie chez les personnes vivant avec le VIH (PVVIH), mais elles échouent à éliminer la population virale non réplicative cachée dans des cellules dites « réservoirs » dans un état qu’on appelle « latent ». Ces provirus latents représentent un obstacle significatif à l'éradication du VIH. Il est donc crucial de comprendre les mécanismes qui contrôlent activement et négativement l'expression du VIH-1 pour ouvrir la voie vers l'éradication du VIH. Nous avons récemment identifié un nouveau mécanisme de répression d’expression génique chez les mammifères qui inhibe l'expression du VIH-1 aux niveaux transcriptionnels et post-transcriptionnel : Le complexe HUSH, en collaboration avec CNOT1, peut induire une répression épigénétique du provirus intégré et promouvoir la dégradation de l'ARN dirigée par le LTR du VIH-1 au niveau post-transcriptionnel. Bien que le complexe HUSH réprime le VIH-1 dans certains modèles cellulaires de latence du VIH-1 et que sa fonction repose sur l'activité de l'ARN polymérase 2, nos résultats suggèrent que CNOT1 utilise un autre mécanisme que celui de HUSH. Empêcher l’expression de CNOT1 conduit à l’augmentation d’expression du provirus VIH-1 dans tous les modèles cellulaires de latence que nous avons examinés. Nos découvertes montrent que CNOT1 cible spécifiquement une région du LTR 5’ du VIH-1. Nous envisageons donc de décrire les mécanismes de mise en latence du VIH-1 par CNOT1. À travers des études protéomiques ciblées et des techniques génomiques avancées, nous identifierons le protéome associé à CNOT1 au site de répression du LTR du VIH-1 et éluciderons comment CNOT1 est recruté, avec quels cofacteurs il collabore pour la répression épigénétique/transcriptionnelle, et les mécanismes qu'il utilise pour induire la dégradation de l'ARN issu du LTR. Cette étude devrait fournir des informations cruciales sur la régulation du mécanisme de répression d’expression du LTR du VIH-1 et pourrait offrir une nouvelle stratégie pour cibler le réservoir du VIH-1 pour l'élimination par l’approche « Shock&Kill ».

Les cellules dendritiques (DC) sont des cibles de l’infection par le VIH-1 et considérées promouvoir sa dissémination dans l’organisme. Cependant, elles sont aussi indispensables à la détection du virus par l’hôte pour l’activation de réponses immunitaires protectrices. Les DC sont hétérogènes et on ne sait pas si ce sont ou non les même sous-types qui exercent des fonctions délétères ou bénéfiques. On ne connait pas encore bien les modalités d’interactions entre le VIH-1 et les sous-types de DC présents dans les organes lymphoïdes secondaires et considérés comme les chefs d’orchestre probables de l’immunité antivirale, les DC classiques de type 1 (cDC2) et de type 2 (cDC2) et les DC plasmacytoïdes (pDC). Cela s’explique parce que la diversité des DC humaines n’a été reconnue que récemment et parce que les DC sont rares, fragiles et difficiles à étudier, tout particulièrement les cDC1. Les équipes de Marc Dalod et Nicolas Manel ont développé des connaissances originales et des outils innovants, complémentaires, pour mieux comprendre comment le VIH interagit avec les DC. Les cDC2 peuvent être infectées ce qui est indispensable à leur activation par le VIH-1. Toutefois, ce processus est inhibé par un mécanisme lui-même contrecarré par la molécule Vpx du VIH-2. Au contraire, les cDC1 et les pDC résistent à l’entrée du VIH-1, tout en étant capable de capturer ce virus pour en présenter des antigènes et s’activer sans être directement affectées par les gènes viraux immunomodulateurs. Ce processus permet l’activation de lymphocytes T CD8 antiviraux in vitro. Notre projet consistera à approfondir ces observations pour en disséquer les mécanismes moléculaires sur la base de l’identification de gènes candidats et de leur possible mode d’action. Premièrement, nous étudierons si, et comment, les gènes candidats contribuent à la résistance des cDC1 et des pDC à l’infection. Deuxièmement, nous identifierons les mécanismes moléculaires promouvant la reconnaissance par les cDC1 ou les pDC de matériel dérivé du VIH-1 ou de cellules infectées. Cela inclura de caractériser les différents états d’activation induits dans les types de DC par leur exposition au virus dans différentes conditions expérimentales, en combinant des analyses phénotypiques, fonctionnelles et de séquençage de l’ARN sur cellules individuelles. Ces données devraient permettre de mieux comprendre les différentes modalités d’interaction entre le virus et les DC, leur contrôle moléculaire et leurs conséquences sur l’immunité antivirale. Troisièmement, nous générerons des lignées immortalisées des différents types de DC humaines afin de les utiliser comme outils pour permettre un niveau inégalé de dissection mécanistique des interactions entre le VIH-1 et ces cellules. Les connaissances ainsi générées éclaireront sous un jour nouveau la physiopathologie de l’infection par le VIH-1 et pourraient contribuer à des traitements immunothérapeutiques innovants complémentaires des chimiothérapies antirétrovirales pour moduler en faveur de l’hôte les interactions entre système immunitaire et VIH-1.

La protéine TRBP est impliquée dans divers mécanismes biologiques, notamment en tant que co-facteur de la protéine Dicer, une RNase impliquée dans l’une des étapes de maturation des pré-miARNs, dont TRBP garantit la spécificité de substrat. TRBP agit également au cours de l’infection cellulaire par le VIH, où elle favorise la propagation virale en bloquant le caractère inhibiteur de l’élément TAR en 5’ de l’ARN génomique viral sur la traduction des protéines situées en aval. TRBP permet également de détourner la méthylase cellulaire FTSJ3 au profit du virus, lui permettant d’échapper au système immunitaire. Récemment, nous avons mis en évidence une interaction directe entre, d’une part, la protéine TRBP, et d’autre part, la protéine RPAP3 du complexe d’aide à l’assemblage, R2TP. Nous avons en outre obtenu la structure cristalline à haute résolution de ce complexe, identifiant les résidus clés à l’interface des deux protéines indispensables à l’interaction. Le complexe R2TP associé à HSP90/70 joue le rôle de protéine chaperone pour l’assemblage de diverses particules ribonucléoprotéiques. Nous avons montré que les liaisons de TRBP à RPAP3 ou de TRBP à Dicer étaient mutuellement exclusives, tandis que RPAP3 peut simultanément lier TRBP et HSP90/70. Les rôles de RPAP3 au cours du cycle de réplication du VIH ou dans le processus de maturation des miARN n’ont jamais été décrits. La mise en évidence de cette nouvelle interaction entre TRBP et RPAP3 nous permet de proposer ce projet dans lequel nous tenterons de déterminer quels sont les fonctions possibles de RPAP3 dans la régulation des activités de TRBP au cours la réplication du VIH et dans le mécanisme de maturation des miARNs. Enfin, nous entreprendrons l’analyse structurale du complexe TRBP-FTSJ3 qui n’est pas décrite, ce qui permettra de mieux comprendre les mécanismes clés d’échappement du virus au système immunitaire et de développer à terme de nouvelles stratégies thérapeutiques antivirales.