Projets et candidats lauréats

De nouvelles stratégies sont nécessaires pour infléchir de manière significative la courbe d’incidence de la tuberculose humaine dans le monde. Il faut pour cela mieux comprendre comment l’agent pathogène évolue pour échapper et/ou survivre à l’intervention humaine (vaccination ou traitements antibiotiques). Une grande quantité de données génomiques sur les bacilles de la tuberculose a été obtenue grâce au développement du séquençage à haut débit. Ces données ont permis d’explorer l’évolution de ces pathogènes et d’identifier des gènes soumis à une sélection adaptative qui façonnent l’évolution récente de Mycobacterium tuberculosis (MTB), le principal agent de la tuberculose.  Parmi eux, le gène phoR subit une forte sélection positive. Ce gène code pour la protéine senseur du système de régulation à deux composants PhoPR, un acteur majeur de la pathogénicité de MTB. PhoPR contrôle l’expression de plus de 80 gènes en réponse à des stimuli intracellulaires, tels que le pH acide ou le zinc. Les pressions responsables de la sélection de mutations dans phoR et l’impact de ces mutations sur l’activité du système PhoPR et l’interaction avec l’hôte restent inconnus. Nous émettons l’hypothèse que l’acquisition de mutations dans PhoR permet d’affiner l’interaction hôte-pathogène afin d’augmenter les chances de survie et de transmission et/ou contribue à accroître la capacité de la bactérie à survivre à de nouvelles pressions sélectives telles que la vaccination BCG ou les traitements antibiotiques.

Nous proposons ici d’aborder ce problème et de répondre à plusieurs questions importantes : 1) Quel est le moteur de l’évolution de PhoR chez MTB ? 2) Quelle est l’activité des variants de PhoR sélectionnés ? 3) Quel est l’impact de ces variants de PhoR sur l’interaction avec l’hôte ?

Tout d’abord, nous allons créer une collection de souches recombinantes isogéniques à code-barres exprimant des variants de PhoR. Ces variants ont été sélectionnés parce qu’ils sont apparus indépendamment à plusieurs reprises dans des isolats cliniques de MTB. Nous ajouterons également des variants PhoR présentant de fortes différences dans leur capacité à reconnaître le signal et à activer le régulon PhoP (sur la base de nos résultats antérieurs). Nous réaliserons ensuite une série d’expériences de compétition in vitro et in vivo afin d’évaluer l’aptitude des souches recombinantes au cours du cycle infectieux, d’un traitement antibiotique ou chez un hôte vacciné. Ces expériences nous informeront sur l’impact de ces pressions sélectives sur les souches recombinantes exprimant ces variants PhoR. Deuxièmement, nous caractériserons l’effet des mutations trouvées dans ces variants sur l’expression du régulon PhoP et la réponse aux conditions inductrices. Enfin, nous étudierons l’impact de ces variants de PhoR sur la cinétique de croissance chez l’hôte et la capacité à induire des lésions pulmonaires dans un modèle murin pertinent.

Cette proposition est très innovante car elle aborde la question des adaptations fonctionnelles sélectionnées au cours de l’infection d’un hôte, qu’il soit naïf, vacciné ou traité avec des antibiotiques. Cette question est d’une importance majeure mais reste jusqu’à présent inexplorée. Ce projet s’appuie 1) sur l’expertise du groupe dirigé par C. Guilhot, 2) sur les plates-formes technologiques de pointe de l’Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale de Toulouse, 3) ainsi que sur des résultats préliminaires solides. Les résultats attendus devraient permettre de mieux comprendre l’évolution des bacilles de la tuberculose et l’impact de cette évolution sur l’interaction hôte-pathogène.

L’intégration du génome du VIH-1 se produit principalement dans les régions actives de la chromatine. Ceci est une condition favorable pour une réplication virale efficace, cependant, le VIH-1 coexiste avec l’hôte pendant des périodes prolongées à l’état latent. La régulation spatio-temporelle des premières étapes du cycle de vie du VIH-1 et l’environnement nucléaire de l’hôte sont des déterminants essentiels de l’issue de l’infection. Notre équipe est intéressée à l’étude fondamentale des premières étapes de la réplication du VIH-1, avec un accent particulier sur les mécanismes impliqués dans l’import nucléaire actif des complexes de réplication viraux et dans le remodelage du compartiment nucléaire au cours de l’infection. En particulier, nous pensons que le VIH crée des microenvironnements nucléaires qui entravent son éradication.

 Selon les vues actuellement admises, la transcription inverse (RT), le processus responsable de la synthèse de l’ADN viral, se produit exclusivement dans le cytoplasme. Des outils de microscopie de pointe combinés à la virologie moléculaire nous ont permis de revisiter ce « dogme ». Nous avons découvert que les génomes d’ARN du VIH peuvent pénétrer dans le noyau et former des amas dans des niches nucléaires où ils sont rétrotranscrits en ADN viral fonctionnel. Cinquante ans après la découverte de la RT, nous avons ainsi montré que cette étape cruciale de la réplication virale peut également se produire dans le noyau de la cellule hôte. Nos résultats récents montrent que le VIH lors de l’entrée nucléaire provoque un phénomène appelé séparation de phase (LLPS) générant des organelles sans membrane (MLO) dans le noyau hôte. Les MLOs non seulement augmentent les vitesses de réaction, mais agissent également comme un filtre pour sélectionner les molécules à retenir ou à exclure de la gouttelette liquide. Il est à noter que la LLPS est à l’origine de plusieurs processus biologiques et maladies. Nous avons récemment décrit les VIH-MLOs comme des centres où se déroulent la RT et la formation du complexe de pré-intégration (PIC), tandis que les provirus activement transcrits se localisent dans la chromatine des MLO voisins. Notre étude révèle la localisation des génomes viraux intranucléaires dans une cellule unique, mettant en évidence que les condensats biomoléculaires orchestrent les étapes d’entrée post-nucléaire du VIH-1.

Cependant, on ne sait pas si des facteurs clés du VIH-MLO régulent les étapes virales intranucléaires individuelles. Plusieurs spéculations peuvent être proposées pour expliquer la présence de ces structures nucléaires virus/hôte: (i) pour servir de microréacteurs nucléaires pour la RT et la coalescence des facteurs de l’hôte pour favoriser la synthèse de l’ADN virale; (ii) pour servir de microenvironnement qui inclut des facteurs viraux et hôtes requis pour la génération d’une nouvelle descendance virale et/ou pour cacher le virus des mécanismes de défense cellulaire ; (iii) servir de centre de la transcription virale active pour diffuser rapidement la nouvelle descendance virale.

L’hypothèse susmentionnée peut être étudiée en démêlant le mécanisme sous-jacent à la biogenèse des MLO du VIH-1 et leur rôle dans la transcription inverse et la réplication virale.

Notre proposition vise à élucider la biogenèse/fonction des MLO et leur contribution à la réplication virale.

Les objectifs de la proposition sont :

1. Décrypter le mécanisme sous-jacent à l’établissement/la persistance/la fonction des virus-hôte-MLO.
2. Composition structurelle des VIH-MLO et leur persistance en tant que centre de la réplication virale.
3. Fonction VIH-MLOs et leur remodelage pour réguler la transcription virale.

 Nous pensons que l’étude proposée à l’ANRS peut donner lieu à des résultats qui permettront d’améliorer nos connaissances sur le cycle de vie des rétrovirus, notamment pour le VIH.

La réplication du génome ARN du VIH-1 est un processus essentiel dans le cycle de vie du virus. La réverse transcriptase codée par le virus utilise l’ARNt3Lys de la cellule hôte pour amorcer la transcription inverse de son génome ARN en ADN proviral. Comme l’étape clé d’initiation de ce processus est réalisée en milieu clos, dans la capside, avant ou après infection des cellules cibles par les particules virales, une étape primordiale et incontournable de la transcription inverse de l’ARN du VIH-1 en ADN proviral est l’encapsidation de l’ARN amorce, l’ARNt3Lys de la cellule hôte, dans les particules virales au cours de l’assemblage des nouveaux virions. Les polyprotéines Gag et GagPol, ancrées à la membrane plasmique de la cellule hôte via la myristoylation de leur résidu Gly2, sont essentielles au recrutement des protéines et ARN viraux ou cellulaires qui seront encapsidés.

Nous avons montré que la lysyl-ARNt synthétase mitochondriale (mLysRS) de la cellule hôte est sélectivement encapsidée dans les particules du VIH-1 et sert de transporteur des ARNtLys au cours du processus d’encapsidation. Associée à l’ARNtLys , mLysRS interagit avec les domaines transframe (TF ou p6*) et surtout intégrase (IN) du domaine Pol de la polyprotéine GagPol. Ce complexe d’encapsidation a pu être reconstitué in vitro. L’association entre l’intégrase et la mLysRS est robuste (Kd de 13 nM) et des molécules inhibitrices de cette interaction ont été isolées in vitro. Dans un test ex vivo de développement viral, ces molécules inhibent la réplication virale sans effet toxique sur la viabilité cellulaire.

L’objectif de ce projet de recherche est de comprendre les modalités d’assemblage du complexe d’encapsidation, et plus particulièrement de l’interaction mLysRS:IN. La validation d’un modèle atomique de l’interface mLysRS:IN sera un support essentiel à la sélection et à l’évolution moléculaire d’inhibiteurs capables de bloquer l’association entre mLysRS et IN, et donc d’inhiber le cycle viral. Ce type de molécule constituerait une nouvelle cible thérapeutique.

Ce projet de recherche est basé sur deux axes principaux :

• La validation d’un modèle atomique de l’association mLysRS:IN, responsable de la capture de l’ARN amorce dans les particules virales ;

• La caractérisation du mode d’action sur le cycle viral de molécules capables de bloquer cette association in vitro.

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), la bactérie responsable de la tuberculose (TB), et le virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1), l’agent du syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA), accélèrent leurs progressions mutuelles chez les patients co-infectés. Alors que de nombreuses données cliniques rapportent une augmentation de la charge virale dans les sites anatomiques co-infectés, tels que les poumons, les mécanismes qui en sont responsables restent insuffisamment décrits. Nous avons fait l’hypothèse que les macrophages pourraient être importants puisqu’ils sont la cible commune de Mtb et du VIH-1, en particulier dans l’environnement pulmonaire. Nous avons montré que la formation des nanotubes membranaires (« Tunneling NanoTubes » en anglais, TNT) dans les macrophages infectés par le VIH-1 dans un environnement associé à la TB était fortement induite, ce qui favorise le transfert du VIH-1 entre les macrophages et ainsi la production virale (Souriant et al., Cell Reports, 2019). Ces mécanismes peuvent expliquer pourquoi la charge virale est augmentée chez les patients co-infectés. Tout récemment, nous avons réalisé un transcriptome de ces macrophages (qui forment des TNT) dans un environnement tuberculeux et révélé la surexpression de Siglec-1/CD169. Cette lectine, spécifique des cellules myéloïdes, est connues pour s’attacher de manière très forte au VIH-1 et être impliquée dans le transfert du virus en trans vers les lymphocytes T CD4. De plus, non seulement l’inhibition de Siglec-1 diminue l’exacerbation du VIH-1 induite par la TB dans les macrophages, mais aussi Siglec-1 est associée aux TNT qui contiennent du virus. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de Siglec-1 dans le transfert du VIH-1 entre les macrophages et en particulier dans le cadre du transfert dépendant des TNT.

Dans une première partie, nous utiliserons des modèles in vitro de transfert viral entre les macrophages pour évaluer la contribution de Siglec-1 induite par la TB dans (i) la capture du VIH-1, (ii) la formation des compartiments intracellulaires contenant le virus (VCC), (iii) les mécanismes de transfert viral et (iv) la fusion des macrophages en cellules géantes multinucléées. Dans le deuxième objectif, nous étudierons les interactions de Siglec-1 and son ligand principal, le ganglyoside GM3, dans les processus de transfert cellulaire, notamment ceux identifiés dans la première partie. De plus, nous rechercherons de nouveaux ligands de Siglec-1 par une approche de spectrométrie de masse. Dans la troisième partie du projet, nous nous focaliserons sur le rôle de Siglec-1 dans la biologie des TNT : nous étudierons la dynamique des TNT et leur fonction in vitro, ainsi que la localisation du complexe Siglec-1/GM3 par de la microscopie super-résolutive et la tomographie cryo-électronique. Enfin, la relevance physiologique des TNT positifs pour Siglec-1 et du transfert du VIH-1 dépendant des TNT sera analysée in vivo chez la souris, en utilisant la microscopie intravitale dans des souris wt et déficientes en Siglec-1, co-infectées ou non avec Mtb.

Les résultats qui découleront de ce projet apporteront des connaissances fondamentales sur la pathogénèse de la co-infection VIH-1/TB, notamment sur les mécanismes de transfert du VIH-1 dans un contexte tuberculeux, et potentiellement sur l’établissement des réservoirs viraux chez les patients co-infectés. A plus long terme, ce projet permettra de proposer de nouvelles cibles

Les anticorps neutralisants à large spectre (bNAbs) se développent chez des patients infectés par le VIH-1 (VIH) suivant un processus de co-évolution avec le virus se diversifiant. La génération des bNAbs par les cellules B nécessite plusieurs cycles de maturation d’affinité du récepteur des cellules B (BcR). Les cellules T CD4+ folliculaire (Tfh) contrôlent cette maturation du BcR. Les interactions entre les cellules B et les Tfh reposent sur la reconnaissance par les lymphocytes T de peptides présentés par les molécules du CMH-II exprimées par les lymphocytes B. Ainsi, la présentation de l’antigène par les cellules B est nécessaire pour qu’elles reçoivent de l’aide des Tfh spécifiques de l’antigène, et ainsi pour générer des bNAbs.

Nous proposons de caractériser les étapes limitantes de la présentation de l’antigène restreint par le CMH-II par les cellules B: de la capture de l’antigène par le BcR à l’activation des lymphocytes T. Nous étudierons l’impact de la spécificité et de l’affinité du BcR sur (i) la cinétique d’internalisation du virus entier et de Env, (ii) les voies de dégradation et la nature des compartiments de chargement des CMH-II et (iii) la qualité de l’activation des cellules T CD4 + spécifiques du VIH.

Pour cela, nous établirons deux modèles innovants pour étudier la présentation des antigènes par les lymphocytes B spécifiques du VIH aux cellules T CD4 + anti-VIH. Premièrement, nous créerons un panel de lignées de cellules B exprimant de manière stable des bNAbs recombinants ancrés à la membrane. Nous avons choisi des bNAbs ayant différentes spécificités et affinités pour Env. Afin de comprendre l’influence de la présentation de l’antigène par le BcR sur la sélection des cellules B par les cellules T, nous clonerons également sous forme de BcR des immunoglobulines de la lignée germinale. Deuxièmement, pour étendre les données obtenues avec des BcR recombinants, nous générerons une bibliothèque de clones de cellules B primaires spécifiques de Env. Ces cellules B spécifiques de Env seront triées à partir du sang de contrôleurs élites (ECs, de la cohorte Codex) et la spécificité et l’affinité de leurs BcR caractérisées. Sur la base de nos travaux antérieurs, nous sélectionnerons des ECs avec une fréquence élevée de cellules B mémoires spécifiques de Env et présentant un large potentiel de neutralisation croisée.

Plus spécifiquement, nous comparerons les cellules B exprimant des BcR ayant différentes affinités (y compris les BcR de la lignée germinale) dans leur capacité à activer des clones de lymphocytes T CD4 + spécifiques de Env et de Gag. Nous analyserons la capacité des BcRs reconnaissant différents domaines de Env à présenter des épitopes distincts aux clones T CD4 + spécifiques de Env. Nous étudierons si, en fonction de l’affinité et / ou de la spécificité, un seul BcR peut favoriser la présentation d’un épitope restreint au CMH-II tout en supprimant la présentation d’autres. Nous utiliserons des virus pseudotypés avec Env d’isolats primaires. En utilisant l’imagerie, la cytométrie de flux et des inhibiteurs spécifiques, nous définirons les mécanismes sous-jacents, notamment l’influence de l’affinité et / ou de la spécificité du BcR sur l’acheminement du complexe BcR-antigène dans différents compartiments de chargement (les endosomes précoces, tardifs ou autophagosomes). En fonction des compartiments de chargement de l’antigène, un répertoire différent d’épitope du CMH-II est probablement généré, avec un impact sur l’activation des cellules T.

Ces résultats permettront de concevoir de nouveaux immunogènes afin d’améliorer les interactions des cellules B et T, de soutenir l’aide des cellules T et in fine d’accélérer la génération de bNAbs. Les banques de clones de cellules B spécifiques au VIH offriront également la possibilité de sélectionner des vaccins candidats capables de fixer des BcR spécifiques du VIH et d’activer des réponses T auxiliaires CD4 + appropriées, fournissant de puissants moyens d’information pour concevoir des vaccins induisant des anticorps.

La glycoprotéine d’enveloppe (Env) est la protéine la plus diversifiée du VIH-1. Exposée à la surface du virus sous la forme d’un trimère de gp120/gp41 et jouant un rôle fondamental dans les premières étapes du cycle d’infection, elle est la cible privilégiée des anticorps neutralisants (AcN). Cependant, une fois l’infection établie, ces AcN favorisent l’apparition de variants d’échappement et ne permettent pas de contrôler la réplication virale. Plusieurs études récentes montrent que Env est également une cible importante des protéines de l’immunité innée. Différentes protéines antivirales dont l’expression est, pour la plupart d’entre elles, induite par les interférons de type I agissent sur Env en limitant sa synthèse, en dérégulant sa glycosylation, son clivage, son incorporation dans les virions ou encore en bloquant la processus de fusion lors de l’entrée du virus dans ses cellules cibles. Néanmoins, comme pour les AcN, nos récents travaux portant sur l’étude d’un de ces facteurs (IFITM3) ont montré que certains variants viraux sont capables d’y échapper.

Si l’activité antivirale de chaque facteur de restriction a été démontrée dans des modèles de culture cellulaire in vitro, la façon dont ces facteurs coopèrent in vivoentre eux et avec les AcN, une fois la réponse immune adaptative mise en place, n’a pas été explorée. Nous proposons d’aborder cette question grâce à 2 populations d’étude. La première est constituée de 5 sujets infectés par le VIH-1 chez lesquels nous suivrons l’évolution depuis la primo-infection jusqu’au stade d’infection chronique de la sensibilité/résistance des Env aux différents facteurs de restriction et aux AcN. Ce suivi longitudinal nous permettra de mieux comprendre quelle pression exerce chaque facteur de restriction sur Env, conjointement à celle exercée par les AcN, et quel est leur impact sur l’évolution de Env. La seconde population est constituée de 4 sujets appartenant à une chaîne de transmission identifiée par des analyses phylogénétiques au sein de la cohorte PRIMO 06 de l’ANRS. Grace à nos travaux antérieurs, nous disposons pour chacun de ces patients de virus pseudotypés exprimant les Env précoces (< 3 mois d’infection) et tardives (18 ou 24 mois d’infection) de la quasi-espèce virale les infectant. Cette population nous permettra d’étudier l’impact de la pression exercée par les facteurs de restriction et par les AcN sur Env dans la sélection des variants transmis et leur adaptation à un nouvel hôte. Enfin, la comparaison de séquences d’Env résistantes ou sensibles aux facteurs de restriction et la construction d’Env mutées ou chimères devraient également nous permettre d’identifier des déterminants moléculaires de Env qui modulent sa capacité d’échappement.