Projets et candidats lauréats

Contexte : Les unités de sang AgHBs positives représentent encore plus de 50 % des poches jetées dans la plupart des banques de sang africaines. Plusieurs études ont montré que les tests infectieux de détermination rapide (TDR) sont efficaces pour réduire le risque d’infections transmissibles par la transfusion (ITT), en particulier lorsqu’ils sont utilisés selon des normes de qualité. Ces tests sont parfois considérés comme une mesure d’économie, en particulier dans les milieux à forte prévalence d’ITT tels que les services de sang africains. Nous n’avons pas trouvé de preuve que le processus de dépistage des infections avant le don (PDS) effectué dans les services de sang africains et utilisant le TDR soit une mesure pratique et économique dans les milieux à forte prévalence d’hépatite virale B comparé au test post-don (PDT). Objectifs : L’étude vise à évaluer le bénéfice clinique et économique du PDS de l’AgHBs en déterminant son acceptabilité opérationnelle, en comparant les prévalences de l’AgHBs dans les unités sanguines pendant le PDS et le PDT, et en calculant le coût du PDS par rapport au PDT. Méthodes : Un essai randomisé de 12 mois dans un service de sang hospitalier au Cameroun sera mené sur 3 000 donneurs de sang consentants qui seront sélectionnés au hasard pour le test de l’AgHBs avant le don ou après le don selon la procédure standard de selection médicale utilisée dans la banque de sang. Les participants seront recrutés parmi les donneurs de sang du Service du Sang du Centre Hospitalier et Universitaire de Yaoundé, lors de leur interview médical. Tous les donneurs de sang seront inclus dans l’étude après avoir fourni un consentement éclairé écrit.  Nous prévoyons d’enregistrer la satisfaction du donneur lors du conseil prédon et/ou de la notification post-don. Un questionnaire sera conçu pour inclure le niveau de satisfaction pendant le test, le conseil et la notification. La durée du processus (en minutes) et l’inconfort du donneur seront mesurés et comparés. La satisfaction du donneur sera notée sur une échelle de type Likert en 4 points : 4 (100 %) pour « entièrement satisfait », 3 (75 %) pour « modérément satisfait », 2 (50 %) pour « peu satisfait », 1 (25 %) pour « pas du tout satisfait». Un réactif préqualifié par l’OMS pour l’AgHBs sera utilisé pour le dépistage avant le don. Pour chaque donneur et don correspondant, le coût de traitement (si transformé en composants), d’incinération (si incinéré) et de stockage (durée de stockage) sera calculé à l’aide du modèle de tarification cumulative, en ajoutant le coût de chacune des variables citées ci-dessus. La charge de travail du personnel sera mesurée en nombre d’heures consacrées à l’accueil et au dépistage d’un participant. Pour chaque donneur de sang réactif au PDS ou au PDT, 5 ml de sang total seront collectés dans un tube EDTA pour des tests de confirmation. La confirmation de l’infection à VHB sur les échantillons réactifs PDS et PDT sera effectuée par l’équipe Nord, selon un algorithme qui integrera le test EIA AgHBs, le AcHBC, le dépistage génomique virale. La prévalence d’AgHBs et la performance de chaque stratégie seront calculés sur la base des résultats de tests de confirmation. Résultats attendus : Sur la base de ce qui a été décrit précédemment, nous nous attendons à ce que le risque infectieux des deux stratégies soit similaire, que le coût du PDS soit inférieur à celui du PDT,  que le score de satisfaction des donneurs de sang et du personnel soit similaire pour les  deux approches. Cette étude peut démontrer que le PDS aide à réduire les dons de sang inutiles et les déchets sanguins tout en améliorant le confort des donneurs de sang lors de la selection médicale. Les résultats seront publiés dans des revues scientifiques, partagés avec le ministère de la santé publique et les associations communautaires impliquées dans la prise en charge des patients ou le don de sang.

La protéine core d’HBV orchestre la formation du virus en s’auto-assemblant en capside et en recrutant l’ARN prégénomique et la polymérase. Nos résultats préliminaires montrent que la co-expression de la protéine core avec différentes protéines core chimériques s’auto assemble dans les cellules et forment des capsides. Nous avons pu déterminer que la partie basique C terminale de la protéine est indispensable à cet assemblage suggérant que les acides nucléiques seraient impliqués dans la formation de la capside virale.

L’objet de ce projet de recherche est de détailler les mécanismes d’auto-assemblage de la protéine core en capside et de déterminer le rôle de cet assemblage dans la reconnaissance du complexe nucléoprotéique Pol-ARN pré-génomique abritant la réplication virale.

Nous proposons, sur la base de travaux de structures publiées et obtenues par RX, de suivre l’effet de mutations de différents domaines de core sur son assemblage en capside virale. L’utilisation de ces mutants et de cellules compétentes pour la réplication d’HBV nous permettra d’observer des modifications structurales lors de la maturation de la capside. Nous avons confirmé que la protéine core interagit avec la protéine Pol. Nous allons donc cartographier cette interaction et déterminer si ce complexe core-pol dépend de l’assemblage de la capside virale. Enfin, nous tenterons de suivre et de localiser la formation du complexe nucléoprotéique core-Pol-ARN pré-génomique.

Ces travaux seront menés par deux laboratoires à Tours et à Rennes reconnus dans leur domaine respectif de virologie et de microscopie. Techniquement, des approches bien rodées seront utilisées (biologie moléculaire, biochimie…) ainsi que des approches plus innovantes. En effet, l’utilisation combinée de l’imagerie optique quantitative et de la résolution de la microscopie électronique sera indispensable pour détailler les étapes initiant la morphogénèse d’HBV. Enfin, nous proposons d’utiliser cette étude pour caractériser le mécanisme d’action des molécules dirigées contre la capside et qui possèdent un fort potentiel antivirale.

L’Organisation mondiale de la santé a appelé à l’élimination de l’hépatite B d’ici 2030. La vaccination universelle à la naissance, lorsqu’elle est mise en œuvre, a montré une grande efficacité pour réduire la prévalence de l’hépatite B chronique. Cependant, des infections par le VHB en absence de symptômes cliniques ont été observées chez des personnes vaccinées et présentant des niveaux détectables d’anticorps dirigés contre l’antigène de surface (anti-HBs) du virus de l’hépatite B (VHB), et pouvant éventuellement conduire à une infection occulte par le VHB caractérisée par la persistance d’un ADNccc viral fonctionnel dans le foie. La prévalence, la physiopathologie, l’évolution à long terme et les facteurs viraux et hôtes associés à ce type d’infections restent largement inconnus. Néanmoins, cet échec immunoprophylactique semble fréquemment associé à des souches de VHB de génotypes/sérotypes différents de celui utilisé dans le vaccin. Cela suggère que la capacité des anticorps induits par le vaccin à neutraliser l’infection peut être réduite par des variations antigéniques spécifiques associées à différents génotypes/sérotypes du VHB. Une étude collaborative internationale sera menée pour estimer la prévalence et les facteurs viraux et immunologiques associés aux infections B chez les donneurs de sang vaccinés. Les donneurs de sang seront utilisés en tant que population sentinelle systématiquement testée pour le VHB en dehors du domaine clinique. Cette étude collaborative impliquera des laboratoires en Europe, Chine, Afrique du Sud et Amérique du Sud afin d’étudier un large éventail de génotypes/sérotypes du VHB dans différents contextes épidémiologiques. Des échantillons de plasma de donneurs vaccinés, anti-HBs positifs, et présentant une infection VHB aiguë ou occulte seront sélectionnés. La diversité génétique du gène S des souches de VHB associées à un échec vaccinal sera étudiée en utilisant un séquençage profond de troisième génération. Les séquences obtenues seront comparées à des séquences contrôles de génotypes équivalents afin d’identifier des mutations susceptibles d’entraîner des modifications structurelles et fonctionnelles des protéines S et un éventuel échappement immunitaire. Les anti-HBs présents dans les plasmas de sujets vaccinés et infectés et de sujets contrôles non-infectés seront purifiés. L’activité neutralisante des anti-HBs contre des variants viraux autologues et hétérologues sera testée dans un essai de neutralisation in vitro en utilisant le virus de l’hépatite D (VHD) portant à sa surface des mutants d’intérêt de la protéine S du VHB. Ces pseudotypes HDV seront produits en culture de lignées cellulaires hépatocytaires. Un test de liaison anticorps-virions sera développé comme substitut pour évaluer la capacité des anticorps présents chez les sujets infectés à se lier à différents variants S autologues et hétérologues. Le suivi des donneurs vaccinés infectés par le VHB permettra de documenter la progression à court et moyen terme de l’infection (autolimitée, chronique ou abortive) en suivant les marqueurs viraux sérologiques et moléculaires dans le plasma et l’évolution génétique du virus. La détermination de la prévalence de l’infection par le VHB chez les donneurs de sang vaccinés en tant que population sentinelle fournira des informations importantes sur l’efficacité à long terme des programmes de vaccination universelle en fonction des génotypes et des variants viraux en circulation. La caractérisation génétique et fonctionnelle de ces variants d’échappement sera utile pour améliorer la conception des vaccins contre le VHB, les protocoles d’immunisation et les futures stratégies immuno-thérapeutiques.

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), la bactérie responsable de la tuberculose (TB), et le virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1), l’agent du syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA), accélèrent leurs progressions mutuelles chez les patients co-infectés. Alors que de nombreuses données cliniques rapportent une augmentation de la charge virale dans les sites anatomiques co-infectés, tels que les poumons, les mécanismes qui en sont responsables restent insuffisamment décrits. Nous avons fait l’hypothèse que les macrophages pourraient être importants puisqu’ils sont la cible commune de Mtb et du VIH-1, en particulier dans l’environnement pulmonaire. Nous avons montré que la formation des nanotubes membranaires (« Tunneling NanoTubes » en anglais, TNT) dans les macrophages infectés par le VIH-1 dans un environnement associé à la TB était fortement induite, ce qui favorise le transfert du VIH-1 entre les macrophages et ainsi la production virale (Souriant et al., Cell Reports, 2019). Ces mécanismes peuvent expliquer pourquoi la charge virale est augmentée chez les patients co-infectés. Tout récemment, nous avons réalisé un transcriptome de ces macrophages (qui forment des TNT) dans un environnement tuberculeux et révélé la surexpression de Siglec-1/CD169. Cette lectine, spécifique des cellules myéloïdes, est connues pour s’attacher de manière très forte au VIH-1 et être impliquée dans le transfert du virus en trans vers les lymphocytes T CD4. De plus, non seulement l’inhibition de Siglec-1 diminue l’exacerbation du VIH-1 induite par la TB dans les macrophages, mais aussi Siglec-1 est associée aux TNT qui contiennent du virus. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de Siglec-1 dans le transfert du VIH-1 entre les macrophages et en particulier dans le cadre du transfert dépendant des TNT.

Dans une première partie, nous utiliserons des modèles in vitro de transfert viral entre les macrophages pour évaluer la contribution de Siglec-1 induite par la TB dans (i) la capture du VIH-1, (ii) la formation des compartiments intracellulaires contenant le virus (VCC), (iii) les mécanismes de transfert viral et (iv) la fusion des macrophages en cellules géantes multinucléées. Dans le deuxième objectif, nous étudierons les interactions de Siglec-1 and son ligand principal, le ganglyoside GM3, dans les processus de transfert cellulaire, notamment ceux identifiés dans la première partie. De plus, nous rechercherons de nouveaux ligands de Siglec-1 par une approche de spectrométrie de masse. Dans la troisième partie du projet, nous nous focaliserons sur le rôle de Siglec-1 dans la biologie des TNT : nous étudierons la dynamique des TNT et leur fonction in vitro, ainsi que la localisation du complexe Siglec-1/GM3 par de la microscopie super-résolutive et la tomographie cryo-électronique. Enfin, la relevance physiologique des TNT positifs pour Siglec-1 et du transfert du VIH-1 dépendant des TNT sera analysée in vivo chez la souris, en utilisant la microscopie intravitale dans des souris wt et déficientes en Siglec-1, co-infectées ou non avec Mtb.

Les résultats qui découleront de ce projet apporteront des connaissances fondamentales sur la pathogénèse de la co-infection VIH-1/TB, notamment sur les mécanismes de transfert du VIH-1 dans un contexte tuberculeux, et potentiellement sur l’établissement des réservoirs viraux chez les patients co-infectés. A plus long terme, ce projet permettra de proposer de nouvelles cibles

TLR7 et TLR8 sont des récepteurs Toll dont les gènes sont codés sur le chromosome X. Ils sont présents dans les endosomes et sont activés par des séquences d’ARN simple brin provenant de virus comme le VIH-1. Ils sont exprimés simultanément par les lymphocytes T  (LT) CD4+ et les monocytes, et l’interaction entre VIH-1 et TLR7 ou TLR8 peut avoir des impacts fonctionnels distincts sur les LT CD4+ humains ou les monocytes. En particulier, il a été récemment montré que la stimulation des LT CD4+ humains avec des ligands de TLR8 amplifie l’activation via le TCR, la production de cytokines pro-inflammatoires et promeut leur différenciation en cellules effectrices Th1/Th17. L’activation de TLR8 favorise la réplication du VIH-1 et induit la réversion de la latence dans les LT CD4+ de patients VIH+ avirémique. Nous avons établi que TLR8, comme TLR7, sous leur forme clivée active, sont bien exprimés dans les LT CD4+ d’hommes et de femmes. En visualisant les transcrits primaires en RNA FISH, nous avons démontré que le gène TLR8, comme TLR7, échappe à l’inactivation du chromosome X dans les LT CD4+ et les monocytes, et présentent également un profil d’expression distinct sur le chromosome X actif, co-dépendant chez les femmes, et mutuellement exclusif sur l’X des hommes. Par conséquent, à l’échelle unicellulaire les cellules exprimant les deux gènes simultanément sont 7-fois moins fréquentes chez les hommes comparées aux femmes. Ces résultats indiquent que les gènes TLR7 et TLR8 forment un cluster de gènes corégulés que nous avons appelé « X-linked Toll-like receptor locus » (Youness et al., soumis). La prise en compte du sexe dans l’analyse des interactions VIH-1/LT CD4 nous apparait donc essentiel, ce qui curieusement n’a jamais été pris en considération jusqu’à présent.

            Nos objectifs seront d’étudier 1) s’il existe un biais du sexe dans l’infection par le VIH-1 dans les cellules T CD4+ et 2) si l’expression bi-allélique de TLR8 dans les LT CD4+ de femmes leur donne un avantage dans l’infection et/ou la réversion de la latence des LT CD4+ infectées.

            Ce projet s’articulera autour de 3 objectifs spécifiques :

1) Impact de l’activation de TLR8 sur la permissivité à l’infection par le VIH-1 des LT CD4+ activés en fonction du sexe

2) Rôle de TLR8 dans l’infection VIH-1 dans les LT CD4+ provenant d’un tissu lymphoïde, les amygdales, en fonction du sexe

3) Impact de l’activation de TLR8 sur la réversion du VIH-1 latent dans les LT CD4+ en fonction du sexe.

            Notre hypothèse de travail est que le bais de sexe dans l’infection VIH-1 pourrait être lié à un biais de sexe dans la susceptibilité à l’infection productive des LT CD4+ et/ou à un biais de sexe dans l’établissement du réservoir latent. Cette différence liée au sexe pourrait être intrinsèque aux LT et dû à l’expression différentielle du récepteur TLR8 codée par l’X entre les cellules T CD4+ d’hommes et de femmes. Une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les facteurs biologiques liés au sexe impactent l’inversion de la latence et la persistance du VIH-1 pourrait promouvoir le développement d’approche thérapeutique spécifique à chaque sexe.