Projets et candidats lauréats

Le virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH-1) est un agent pathogène humain important qui persiste sous forme de réservoir et nécessite un traitement antirétroviral continu. L’incapacité du système immunitaire à éliminer l’infection par le VIH-1 est au moins en partie due à une activation immunitaire sous-optimale. Bien que le récepteur cGAS (cyclic GMP-AMP synthase) ait été proposé comme principal détecteur d’ADNs double brins (ADNdb) dérivés du VIH-1, ils sont de mauvais inducteurs de réponses antivirales car leur accessibilité est limitée. Les ADN simple brin (ADNsb) peuvent se former au cours du cycle de réplication du VIH-1, mais la manière dont ils induisent des réponses inflammatoires est très peu étudiée. Nous proposons ici d'explorer leur rôle dans la réponse immunitaire innée à l'infection par le VIH-1.

Nos données préliminaires montrent que la détection d’ADNsb est déclenchée dans les cellules immunitaires et non immunitaires, conduisant à l'activation des réponses d'interféron de type I (IFN) et associées au facteur nucléaire kappa B (NF-kB). Nous montrons que ces réponses à l’ADNsb peuvent être indépendantes du récepteur cGAS. Des analyses protéomiques réalisées dans des cellules humaines immunitaires et non immunitaires nous ont permis d'identifier et de valider des réseaux de protéines qui interagissent spécifiquement avec les ADNsb dans le cytosol. Nous souhaitons maintenant étudier le rôle joué par ce réseau de récepteurs et de modulateurs spécifiques des ADNsb dans la réponse intrinsèque des cellules dans le contexte de l'infection par le VIH-1. Pour cela, nous proposons un projet suivant deux axes :

1. Dissection du rôle des réseaux de protéines liant l'ADNsb dans la reconnaissance du VIH-1 dans ses cellules cibles.

2. Description du rôle de la détection des ADNsb au cours de l'infection par le VIH-1.

Nous utiliserons une approche de criblage ciblée basée sur la technologie CRISPR/Cas9 et des inhibiteurs spécifiques. Nous analyserons le rôle de la détection des ADNsb dans la régulation des réponses immunitaires innées à l'infection par le VIH-1 ainsi que dans sa réplication. Les travaux proposés apporteront une compréhension du rôle joué par les ADNsb dans l’immunité innée et dans la réponse à l’infection par le VIH-1. Ce travail ouvrira un nouveau champ de recherche et entraînera potentiellement des bénéfices pour les patients infectés par le VIH-1 en permettant d’envisager de nouvelles approches pour stimuler les réponses immunitaires antivirales.

– Contexte et objectifs

Le Burkina Faso après plusieurs semaines de décalage par rapport à l’Europe, fait face à la pandémie du COVID-19 avec 497 cas diagnostiqués au 13 Avril 2020 dont 27 décès. Ces épidémies cycliques de pathologies émergentes ou ré-émergentes ainsi que d’autres problèmes de santé de nature endémique fragilisent le système sanitaire du pays.

La recherche clinique sur le COVID-19 avance avec de nombreux essais cliniques lancés partout dans le monde. Au Burkina Faso deux essais thérapeutiques sont également en cours. En l’absence de vaccin préventif, de moyens biomédicaux de prévention ou de moyens thérapeutiques spécifiques, les mesures de contrôle du COVID-19 utilisées jusqu’à présent en Asie, Europe et Amérique, notamment les mesures barrières, la distanciation sociale, le port de masques, le confinement semblent difficiles à appliquer au Burkina Faso. Toutefois, le pays a mis en place un plan de riposte permettant d’identifier les cas suspects de malades atteints de COVID-19 afin de les prendre en charge mais fait face malheureusement à beaucoup de défis. D’abord le coût élevé des analyses actuelles du diagnostic par PCR limite le nombre d’analyses réalisées et rendent difficile voire impossible une estimation réelle du nombre de personnes infectées par le virus en population générale. De plus, la surveillance de la séropositivité des anticorps IgG et IgM au sein de la population, recommandée par l’OMS serait difficile à mettre en œuvre faute de moyens. Ensuite, au Burkina Faso, il n’existe pas de données sur les facteurs prédictifs de la survenue de complications sévères ainsi que sur les facteurs pronostiques du décès dus au COVID-19. La caractérisation des patients grâce à des modèles/scores prédictifs pour identifier ceux qui seraient à risque de développer des formes graves de COVID-19 permettrait pourtant de focaliser les mesures préventives ainsi que les moyens disponibles sur cette frange de la population en réduisant les moyens et coûts associés à la prise en charge. Enfin, peu d’études socio-anthropologiques sont faites sur le parcours thérapeutique des patients et leur vécu de la maladie, mais aussi l’acceptabilité, l’application et l’impact des mesures de prévention de la maladie sur le personnel soignant et la population.

Trois équipes de recherche internationales et multidisciplinaires travailleront sur différents volets du COVID-19 au Burkina Faso : séro-épidémiologique, épidémiologie clinique et Socio-anthropologique.

• Objectifs de la recherche

Cette recherche s’articulera autour de trois volets complémentaires ayant pour objectifs principaux de :

– Déterminer la séroprévalence de l’infection à SRAS-CoV-2 au sein de la population Burkinabè  (Volet 1 : Séro-épidémiologique).

– Déterminer les facteurs prédictifs de la survenue de complications sévères et décrire les facteurs pronostiques du décès chez les patients infectés par le SARS-CoV-2 (Volet 2 : Épidémiologie clinique).

– Analyser le parcours thérapeutique et le vécu des patients pris en charge dans les centres dédiés aux personnes infectées par le SARS-CoV-2 ainsi que les perceptions, l’acceptabilité et l’application des stratégies de prévention de l’infection par le personnel soignant et la population générale (Volet 3 : Socio-anthropologique).

• Retombées attendues

 Cette recherche permettra d’une part d’estimer la séroprévalence de l’infection à SRAS-CoV-2 dans la population générale Burkinabè. Ainsi, le développement de mesures de prévention déployées dans le cadre de la riposte contre le COVID-19 pourrait se focaliser sur la frange de la population qui ne serait pas immunisée en permettant ainsi de réduire les coûts de la riposte au COVID-19 dans un pays où les ressources sont limitées ; mais aussi de préparer des stratégies de ripostes à d’autres potentielles épidémies de COVID-19. D’autre part, elle permettra de générer des données épidémiologiques cliniques utiles pour la prise en charge efficiente des malades. Enfin les données socio-anthropologiques permettront de soutenir le Burkina Faso dans sa riposte contre la pandémie actuelle de COVID-19.

L’infection chronique par le VHB (CHB) est une maladie complexe entraînant une inflammation chronique du foie et compliquée par le développement d’une cirrhose et d’un carcinome hépatocellulaire (CHC). Différentes phases de la maladie ont été caractérisées en fonction du niveau de réplication virale, ainsi que des réponses immunitaires et inflammatoires de l’hôte. La prise en charge de l’infection chronique par le VHB repose sur un dépistage à l’échelle de la population et sur l’identification précise de la phase de la maladie et des patients nécessitant un traitement antiviral. La décision de traiter est aujourd’hui principalement basée, selon les principales recommandations internationales, sur le chrage viral VHB qui est aussi utilisé pour surveiller les traitements actuels basés sur les analogues nucléos (t) ide (NUC) ou l’interféron alpha pégylé (IFNa). Bien que la plupart des patients sous traitement avec NUCs atteignent des charges virales indétectables, avec un bénéfice clinique clair (risque plus faible de développer une cirrhose et un CHC), il n’y a actuellement aucun « cure » de l’infection VHB en raison de la persistance du mini chromosome viral, l’ADNccc, dans le foie des patients. Plusieurs nouveaux composés, visant à diminuer le pool de molécules d’ADNccc  et/ou bloquer l’activité transcriptionnelle de l’ADNccc pour obtenir avec une durée de traitement finie une guérison fonctionnelle (perte de l’AgHBs), sont en cours de développement.

Nouveaux et anciens biomarqueurs non invasifs sont actuellement évalués pour leur capacité à: a) refléter avec précision la taille et l’activité transcriptionnelle du pool d’ADNccc intrahépatique; b) mieux classer les patients non traités en fonction de leur histoire naturelle; c) prédire le succès d’une guérison fonctionnelle (perte de HBsAg) avec les thérapies antivirales actuelles ou nouvelles en cours de développement clinique; d) évaluer le risque de réactivation virale chez les patients qui arrêtent le traitement antiviral ou chez ceux qui suivent un traitement immunosuppresseur. Une étape critique pour la validation de ces nouveaux biomarqueurs et pour aider au développement de nouveaux médicaments pour la guérison du VHB est la disponibilité de méthodes fiables pour étudier le réservoir viral VHB dans le foie (taille du pool d’ADNcc, activité transcriptionnelle et statut épigénétique).

Dans ce projet, nous nous appuierons sur un certain nombre d’avancées technologiques ainsi que sur les résultats récents de notre laboratoire pour optimiser (dans des modèles d’infection VHB in vitro et in vivo) et valider (dans des échantillons cliniques) une nouvelle méthode basée sur le séquençage de nouvelle génération (NGS) de l’accessibilité à la chromatine du ADNccc (cccDNA-ATAC-sec) comme approche de référence pour définir l’état fonctionnel du mini-chromosome ADNccc dans le foie des patients CHB (non traités et traités) et pour aider a l’évaluation mécanistique de nouveaux médicaments ou nouvelles interventions immunitaires anti-VHB.

Les objectifs spécifiques du projet sont :

– la réduction du nombre de cellules infectées nécessaires pour un cccDNA-ATAC-seq;

– l’adaptation du protocole cccDNA-ATAC-seq afin de son utilisation dans des échantillons de biopsie hépatique ou d’aspiration à l’aiguille fine (FNA) du foie ;

– la validation du meilleur protocole cccDNA-ATAC-sec dans le contexte clinique en définissant davantage la relation entre les profils cccDNA-ATAC-seq, les modifications post-traductionelles des histones liées au a ADNccc (statut épigénétique du ADNccc) et la transcription du ADNccc dans 2 cohortes de patients CHB.

Le virus de l’hépatite E (HEV) infecte près de 20 millions de personnes chaque année dans le monde, entraînant environ 3,3 millions de cas symptomatiques et jusqu’à 70 000 décès. Bien qu’il ait un impact considérable sur les systèmes de santé, le cycle de vie du HEV est mal compris. L’absence de systèmes efficaces de culture de cellules infectieuses explique en grande partie la difficulté d’étudier le virus, aux niveaux cellulaire et moléculaire. En effet, il n’existe pas de médicament antiviral spécifique pour traiter une maladie liée au HEV. Seule la ribavirine est actuellement administrée aux patients, mais elle est peu spécifique et entraîne plusieurs effets secondaires. Il est donc urgent d’accroître les connaissances sur la réplication du HEV afin de concevoir des médicaments spécifiques. La polyprotéine de réplication du HEV, codée par l’ORF1, est une cible thérapeutique intéressante car elle est essentielle à la réplication virale. En effet, elle contient la polymérase qui réplique le génome viral et elle est supposée contenir les éléments structuraux qui permettent la formation du complexe de réplication virale construit à partir des membranes endocellulaires de l’hôte. Cependant, la structure et les nombreux rôles de la polyprotéine ORF1 ne sont pas décrits.

En raison de sa taille (186 kDa), de son architecture multi-domaines et de ses régions hydrophobes associées à la membrane, la polyprotéine ORF1 de réplication du HEV est très difficile à produire par les systèmes classiques d’expression hétérologue, empêchant tout projet structural. Grâce à un contrat d’initiation financé par l’ANRS, nous avons démontré qu’en utilisant un système d’expression acellulaire atypique dans le domaine de la biologie structurale, nous sommes capables d’exprimer la polyprotéine du HEV sous une forme soluble. De plus, nous avons obtenu des résultats structuraux préliminaires solides par une approche de microscopie électronique en coloration négative.

Dans la continuité de ces travaux préliminaires, nous souhaitons maintenant résoudre la structure tridimensionnelle de la polyprotéine de réplication ORF1 du HEV, ainsi que plusieurs de ses conformations. De plus, nous voulons identifier les modifications post-traductionnelles potentielles de la polyprotéine qui pourraient réguler ses fonctions.

Pour atteindre ces objectifs, nous utiliserons une approche intégrative de biologie structurale, combinant des méthodes biochimiques et structurales innovantes. En particulier, nous utiliserons la méthode de cryo-microscopie électronique pour résoudre la structure de la polyprotéine, une technique de pointe en biologie structurale, particulièrement adaptée aux protéines de grande taille et à domaines multiples. Cette approche sera combinée à des méthodes d’analyse d’image et de reconstruction 3D. Enfin, nous utiliserons une approche in silico pour explorer la dynamique de la polyprotéine et ses éventuelles interactions avec les membranes au niveau atomique.

Avec ce projet, nous fournirons des données concrètes pour répondre à de nombreuses questions sur la structure et les fonctions de la polyprotéine de réplication ORF1 du HEV : description des domaines de la polyprotéine (limites, repliement, résidus catalytiques, sites de liaison aux ligands), description de la flexibilité de la polyprotéine (différentes conformations ou oligomérisations, signaux pouvant réguler la plasticité de la protéine), identification des régions susceptibles d’interagir avec les endomembranes de l’hôte. L’ensemble de ces résultats représentera une avancée considérable quant aux connaissances sur la réplication du HEV et ouvrira la voie à de nombreuses études fonctionnelles.

Contexte

L’histoplasmose, la talaromycose et la cryptococcose sont des infections fongiques invasives (IFI) graves chez les patients vivants avec le VIH à un stade avancé. Bien que ces agents pathogènes soient probablement endémiques au Cambodge, peu ou pas de données sont disponibles, en particulier pour l’histoplasmose et la talaromycose. La méconnaissance de ces infections et la disponibilité insuffisante de méthodes diagnostiques fiables conduisent à un retard de diagnostic et donc de traitement spécifique, responsable d’une mobi-mortalité excessive. Ces dernières années, les méthodes antigéniques et moléculaires sont apparues comme des outils prometteurs pour le diagnostic rapide des infections fongiques invasives. Notre objectif principal est d’évaluer, à l’aide de ces nouvelles méthodes, la prévalence de ces infections chez les patients atteints d’une maladie VIH avancée au Cambodge. Ce travail de recherche sera associé à un renforcement des capacités cambodgiennes en termes de transfert de compétence d’outils diagnostic simple des IFI et de formations clinique des acteurs de soins locaux sur les IFI.

Méthodes

C’est une étude rétrospective avec analyses sur une biobanque. Nous utiliserons les échantillons de l’étude STATIS, une étude sur la prise en charge diagnostique de la tuberculose menée chez 199 patients cambodgiens vivants avec le VIH avec des avancé (lymphocytes T CD4+ <100/mm3). Nous réaliserons d’abord des tests antigéniques spécifiques pour chaque pathogène. Comme la réactivité croisée de ces tests entre l’histoplasmose et la talaromycose est inconnue, nous confirmerons les résultats positifs par une PCR quantitative spécifique. Nous organiserons un atelier de formation au laboratoire pour initier l’équipe à l’utilisation du test et pour mettre en place un programme de formation, ainsi qu’un atelier de formation clinique pour les cliniciens en charge de patients à risque de mycoses invasives dans les hôpitaux de Phnom Penh.

Résultats attendus et perspectives

Ce projet fournira les premières données sur la prévalence de l’histoplasmose et de la talaromycose chez les patients vivants avec le VIH à un stade avancé au Cambodge. Cette étude permettra également de sensibiliser les acteurs locaux à ces diagnostics différentiels de la tuberculose ainsi qu’à l’existence de coinfections. La formation des équipes locales aux nouvelles méthodes diagnostiques permettra de poursuivre les recherches sur ce problème de santé publique, notamment par des études prospectives sur les infections fongiques invasives au Cambodge.