Projets et candidats lauréats

Les macrophages sont l’une des cibles de l’infection du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Ces cellules jouent à ce titre un rôle majeur dans la physiopathologie de l’infection en favorisant la dissémination du virus lors de contacts cellule à cellule ainsi qu’en constituant l’un des réservoirs viraux chez l’individu infecté même sous traitement antirétroviral hautement actif. Les macrophages infectés produisent également des particules virales sur une période de temps élevée et les séquestrent dans des compartiments intracellulaires spécifiques appelés VCC, issus de l’invagination de la membrane plasmique. Dans ces compartiments, les virus restent pleinement infectieux et sont libérés ultérieurement lors des contacts cellules à cellules. Ces particules virales séquestrées échappent ainsi à la surveillance du système immunitaire des patients infectés et aux traitements antirétroviraux. Bien que la présence de ces compartiments chargés de virus ait été rapportée dès 1988 , les mécanismes moléculaires participant à l’établissement de ces sanctuaires viraux sont encore peu décrits. Comprendre comment les particules virales sont séquestrées et persistent dans les macrophages est donc un enjeu majeur pour progresser dans l’éradication de ces sanctuaires viraux.

Nos données récemment publiées montrent que le facteur de restriction BST2/Tetherin est présent dans les VCC et le volume des VCC au cours de l’infection dépend de l’expression de BST2 (Leymarie, J. Virol 2020). Acteur de l’immunité innée, BST2 restreint la dissémination de virus enveloppés et notamment du VIH-1. La protéine Vpu du VIH-1 est l’un des acteurs viraux capable de contrer cette restriction. De manière intéressante, nos études révèlent que, dans les cellules HeLa, le VIH-1 est capable d’engager un mécanisme de d’autophagie non canonique, semblable à la LC3-associated phagocytosis (LAP-like) pour contrer la restriction BST2. Ce mécanisme favorise la dissémination du virus. Au cours de ce processus, Vpu recrute la protéine d’autophagie LC3C et engage un mécanisme de LAP-like accélérant la phagocytose des molécules de BST2 associées aux virus, présentes au site de bourgeonnement (Madjo et al. Cell report 2016).

Dans ce projet, nous émettons l’hypothèse que les VCC seraient le résultat d’une LAP abortive en réponse à la restriction imposée par BST2 sur la production de particules virales. A la différence de ce que nous avons pu décrire dans les cellules HeLa, dans les macrophages, ce processus débuterait mais n’aboutirait pas/ou moins efficacement à la dégradation du contenu des LAPosomes, ces LAPosomes devant alors des VCC. Les virions persisteraient intracellulairement dans les VCC, faute d’une fusion efficace ou plus lente entre VCC et lysosomes.
L’objectif de ce projet est donc de définir les mécanismes moléculaires qui conduisent à la séquestration et à la persistance du VIH-1 dans les macrophages, et plus particulièrement la contribution de la LAP dans ce processus.

Aussi, proposons-nous dans ce projet de définir, lors d’une infection de macrophages primaires par le VIH-1,

• Si les VCC sont des LAPosomes induits par l’infection VIH-1 par des approches d’imagerie et biochimiques.
• La contribution de la LAP dans la séquestration des virions dans les VCC, en utilisant dans nos essais virologiques des approches d’ARN interférence et Crispr/Cas9.
• Les mécanismes cellulaires empêchant la fusion des VCC avec les lysosomes, en analysant notamment la phosphorylation des protéines autophagiques LC3. 

Ce programme de recherche permettra de déterminer les acteurs de la LAP indispensables au développement et au maintien des VCC dans le macrophage , mais aussi d’identifier les protéines virales qui contrôlent ces processus. Ce travail apportera également des connaissances nouvelles quant à la régulation de la production du VIH-1 dans le macrophage, ouvrant le champ à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contrôler la réplication du virus et l’éradiquer.

L’existence de réservoirs viraux est un obstacle à l’éradication de l’infection par VIH (virus de l’immunodéficience humaine). Les cellules T CD4 et les macrophages sont le principal réservoir cellulaire, tandis que les tissus lymphoïdes sont les réservoirs tissulaires. Le tissu adipeux représente un site remarquable pour la réplication et la persistance virale parce que sa fraction stromale contient des cellules activées du système immunitaire inné et adaptatif qui augmentent en nombre durant l’infection, l’obésité et l’inflammation chronique. Il s’avère que de nombreux pathogènes (parasites, bactéries, virus) peuvent établir des réservoirs dans le tissu adipeux. Une dysfonction de ce tissu est communément observée chez les individus infectés par le VIH. Ces derniers présentent des pathologies allant de la dyslipidémie à la lipodystrophie et la redistribution des masses graisseuses. Le tissu adipeux est par ailleurs sensible aux traitements antiviraux.

Les adipocytes et les cellules résidentes du tissu adipeux interagissent avec les lymphocytes T CD4+ et les macrophages, ce qui a d’importantes implications pour la pathogénicité du VIH. Cette interaction complexe est importante durant l’infection puisque les adipocytes sont une source majeure de métabolites et de signaux de survie pour les cellules immunitaires.

Puisque les adipocytes sont des cellules endocrines qui interagissent extensivement et régulent l’immunité, cela justifie de préciser l’effet de l’infection virale sur physiopathologie du tissu adipeux (obésité), mais aussi le rôle du tissu adipeux sur la réplication du VIH et sur sa persistance, en fonction de sa nature et de sa localisation.

Ce projet rassemblera l’expertise complémentaire de deux équipes de recherche qui ont pour thématique respective la régulation du destin cellulaire au cours de la différenciation cellulaire (l’adipogenèse et l’hématopoïèse par exemple), l’identification et l’étude du réservoir VIH dans le tissu adipeux humain, et simien et l’utilisation du modèle simien dans l’infection par le VIH.

Notre stratégie minimise l’utilisation de modèles animaux qui permettent notamment l’obtention facile et répétée de matériel biologique (sang), ou difficilement accessible chez l’homme (tissu graisseux brun). Des échantillons de tissu graisseux blanc ou brun seront prélevés sur des macaques sains pour l’isolement de progéniteurs adipeux et l’établissement des co-cultures in vitro.

Pour étudier de manière relevante la physiologie de l’interaction entre les cellules immunitaires et les adipocytes, nous développerons une co-culture paracrine 3D. Des conditions de culture obésogéniques seront aussi reproduites. Ce modèle sera composé d’adiposphères obtenues à partir de préadipocytes primaires simien ou issus de lignées humaines établies de tissu adipeux blanc ou brun, ainsi que cellules primaires issues de tissu adipeux blanc, associées à des inserts de cellules immunitaires normales. Une analyse phénotypique et transcriptomique du devenir des populations adipeuses et immunitaires sera réalisée. Elle sera complétée par un dosage de cytokines inflammatoires, adipokines et métabolites potentiellement impliqués dans l’inflammation et l’infection par VIH. Des molécules affectants le métabolisme et le transport du lactate, métabolite sécrété par les adipocytes et modulant les fonctions du tissu adipeux et des cellules immunitaires, seront analysées dans ces modèles cellulaires 3D.

Le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) reste un problème de santé publique dans le monde entier malgré le développement d’antirétroviraux efficaces. Il est toujours mal compris comment l’infection par le VIH persiste toute la vie de son hôte. Plusieurs réservoirs viraux ont pu être identifiés mais les atteindre reste un challenge. Les macrophages représentent l’un des réservoirs principaux du VIH car ce sont des cellules cibles du virus qui résident dans tous les tissues (cerveau, poumons, foie, …). Comment s’établit ce réservoir n’est pas bien connu et il est donc essentiel d’intensifier les recherches afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires régissant leur mise en place au cours de l’infection. Il est supposé que le VIH utilise la stratégie du « cheval de Troie » afin d’être transporté dans les tissues via les monocytes circulants, passant la barrière endothéliale par transmigration avant de se différentier en macrophages. Cette migration trans-endothéliale requière que les monocytes traversent les jonctions serrées (TJs), structures qui fournissent l’imperméabilité entre deux cellules endothéliales. Les partenaires impliqués, le rôle des protéines associées aux TJs (TJAPs) et l’impact du VIH lors de ce processus restent obscures.

Ce projet a pour but de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués lors de la transmigration des monocytes à travers les endothéliums, et l’influence du VIH-1 durant ces étapes. Pour se faire, nous avons d’abord déterminé que le VIH-1 induit une transmigration significativement plus importante des monocytes primaires au travers d’une barrière endothéliale. De plus, le virus n’a pas d’influence sur les niveaux d’attachement des monocytes à la monocouche endothéliale, la première étape du processus de transmigration, mais à des étapes plus tardives. Ainsi, nous avons cherché si les protéines associées aux jonctions serrées exprimées par les monocytes (mTJAPs) pouvaient représenter des molécules participant aux étapes post-adhésion de la transmigration. Dans ce contexte, une mTJAP a été identifiée comme étant un acteur important de la transmigration des monocytes infectés par le VIH. Nous avons mis en place un système de micro-fluidique qui nous a permis d’observer que cette mTJAP promeut l’étalement des monocytes rapidement après une exposition à un flux (à vitesse physiologique de la circulation sanguine). Dans ces conditions, alors que la capacité des monocytes à adhérer reste inchangée, l’augmentation de l’étalement est fréquemment associée à une augmentation des capacité pro-migratoire des cellules. De plus, nous avons pu déterminer par microscopie confocale 3D en temps réel que les monocytes infectés par le VIH transmigrent via la formation de structure ressemblant à des « lamélipodes », un processus pour lequel notre mTJAP a été impliquée. Enfin, la combinaison de l’infection par le VIH et la surexpression de la mTJAP entraine une forte augmentation de la transmigration, à des valeurs synergétiques plutôt qu’additives. Nos résultats suggèrent que HIV et la mTJAP coopèrent pour faciliter la transmigration des monocytes.

Afin de valider le rôle de la mTJAP durant la transmigration de monocytes infectés par le VIH-1, nous proposons maintenant d’utiliser une combinaison de microscopie en temps réel et micro-fluidique associées à des techniques classiques de virologie et biologie cellulaire. Nous allons disséquer en détails le mécanisme de transmigration médié par la mTJAP et déterminer comment le VIH-1 subverti cette protéine pour induire la transmigration du monocyte au travers des endothéliums.

Ce projet devrait fournir les bases moléculaires nécessaires pour mieux comprendre comment est initié la formation de réservoirs du VIH et ainsi apporter de nouvelles approches afin d’imaginer des stratégies antivirales innovantes visant les réservoirs.

Les populations de cellules dendritiques (DC) sont hétérogènes et jouent un double rôle en ce qui concerne le VIH-1: acteurs clés de l’établissement et de la propagation de l’infection par le VIH-1, les DC provoquent également des réponses immunitaires anti-virales innées et adaptatives. Récemment, le développement d’approches à haute dimension a permis l’identification de pré-DC, une nouvelle population de précurseurs circulants des DC. En dehors de leur rôle dans l’ontogenèse, les fonctions immunitaires des pré-DC restent à établir. Les pré-DC sont équipées d’une variété de récepteurs de type lectine, dont certains sont connus pour se lier au VIH-1. Le présent projet vise à définir précisément les altérations des fonctions pré-DC induites par le VIH-1 in vitro et chez les patients infectés en utilisant des approches à haute dimension.

Nos résultats montrent que les pré-DC sont la population de DC la plus sensible à l’infection par le VIH-1 et qu’elles permettent la dissémination du VIH-1 aux cellules T CD4 + in vitro. La capture du VIH-1 et l’infection des pré-DC sont dépendantes de Siglec-1 (CD169). Siglec-1 est un récepteur de type lectine qui est exprimé de façon unique par les pré-DC de manière constitutive. Lors de l’activation, les pré-DC deviennent résistantes à l’infection par le VIH-1. Elles deviennent alors capables de transférer le virus (sans être infectées) vers les lymphocytes T primaires activés. Ce mécanisme de transfert est également médié par Siglec-1. Fait important, le VIH-1 s’assemble à la membrane plasmique des cDC2 infectées de la même façon que dans les lymphocytes T. A l’inverse, les pré-DC infectées par le VIH-1 produisent et accumulent de nouveaux virions dans des compartiments internes en contact avec le milieu extracellulaire (similaires à ceux observés dans la macrophages).

Notre projet vise à comprendre la dynamique et les fonctions des pré-DC dans le contexte de l’infection par le VIH-1 in vivo et in vitro. L’objectif à long terme du projet est d’établir le rôle des pré-CD pendant l’infection par le VIH, de la population cellulaire jusqu’au niveau de la cellule unique, en étudiant leur pertinence dans la dissémination du VIH et la génération de la réponse immunitaire antivirale. Le projet s’articule autour de trois questions principales: i) Comment l’exposition au VIH-1 affecte-t-elle les fonctions immunitaires des pré-DC: détection virale, différenciation et capacité de migration? ii) Les pré-DC participent-elles à la physiopathologie de l’infection par le VIH-1? iii) Quels sont les déterminants moléculaires impliqués dans l’assemblage du VIH-1 dans les pré-DC?

En utilisant des approches à « haute dimension » réalisées en combinaison avec des méthodes phénotypiques et fonctionnelles, nous caractériserons les voies moléculaires induites par la détection et la réplication du VIH-1. Les effets du VIH-1 sur la différenciation des pré-DC et sur leur capacité de migration seront également évalués en utilisant des systèmes de culture établis. Nous déterminerons en outre si des pré-DC infectées sont présentes chez les patients infectés par le VIH-1. La dynamique et les fonctions des populations de DC seront évaluées dans différentes cohortes de patients infectés par le VIH-1. Enfin, nous utiliserons le modèle pré-DC / cDC2 pour identifier les acteurs moléculaires impliqués dans la formation et la régulation des compartiments contenant le virus.

Nos résultats concernant la susceptibilité pré-DC à l’infection par le VIH-1 et leur capacité à transmettre le virus aux cellules T CD4 + suggèrent un rôle potentiellement important des pré-DC dans la physiopathologie du VIH-1. Élargir nos connaissances concernant les pré-DC nouvellement définies pourrait également aider à la conception de nouvelles stratégies en immunothérapie.

De par leur localisation, les cellules dendritiques (DC) représentent des cibles préférentielles précoces de microbes transmis par voies sexuelles ou sanguines. Ainsi, ces cellules expriment différents facteurs de restriction virale spécifiques permettant de limiter toute infection ou transmission microbienne. Néanmoins, quelques pathogènes, comme le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), se sont adaptés au cours de l’évolution pour contrecarrer ou détourner ces défenses cellulaires afin d’échapper aux mécanismes de dégradation et de surveillance immunitaire et ainsi faciliter la dissémination de l’infection. La caractérisation de SAMHD1 comme étant un puissant facteur de restriction de l’infection par le VIH-1 a été une découverte majeure. Alors que cette restriction SAMHD1-dépendante a été démontrée sans ambiguïté dans la plupart des DC de lignage myéloide, l’influence de ce facteur de restriction dans les cellules de Langerhans (LC) n’est pas connue. L’impact de notre étude s’avèrerait d’autant plus important que ces cellules, principalement présentes au niveau de l’épithélium de revêtement des muqueuses et de la peau, contribueraient activement aux évènements précoces de la transmission virale. Nos données, publiées très récemment, démontrent l’existence d’une activité antivirale inconnue présente dans les LC et induite par la voie de signalisation du TGF-b. En effet, alors que le récepteur lectine de type-C langerin (exprimé spécifiquement dans les LC et aussi nommé CD207) et SAMHD1 peuvent partiellement restreindre l’entrée et l’infection virale, nous avons pu observer que ces facteurs ne sont définitivement pas les seuls acteurs de restriction du VIH-1 dans ces cellules. Le facteur beta de croissance de transformation (TGF-b de l’anglais transforming growth factor beta), une cytokine par ailleurs essentielle au développement des LC, est le facteur limitant induisant une activité antivirale forte dans ces cellules. Cette forte activité antivirale induite par le TGF-b est transposable à d’autres cellules myéloides et visibles après 24 à 48h de traitement, suggérant une régulation transcriptionnelle TGF-b-spécifique du ou des facteur(s) de restriction du VIH-1. En se rapportant à notre hypothèse d’une régulation transcriptionnelle TGF-b-dépendante de l’expression d’un facteur antiviral dans les LC, nous avons donc développé des approches ambitieuses menées sur des cellules humaines primaires et basées sur des technologies innovantes de criblage à haut-débit (IlluminaSeq, criblage par interférence ARN…) afin d’établir un transcriptome différentiel permettant, notamment, d’identifier certains facteurs cellulaires dont la fonction pourrait être reliée à l’immunité intrinsèque. Cette approche nous a permis de caractériser différentes protéines dont l’expression est fortement accrue dans les LC et en présence de TGF-b. Parmi celles-ci, la protéine S100A9 s’est révélée comme un potentiel facteur de restriction du VIH-1 majeur dans les LC. En effet, nos données montrent que la diminution d’expression de S100A9 dans les LC rend ces cellules fortement susceptibles à l’infection alors que l’expression exogène de S100A9 dans différents types cellulaires limite la réplication virale. De même, nous avons pu aussi observer que l’expression et la localisation de S100A9 sont régulées de manière TGF-b-dépendante en corrélation avec la résistance à l’infection. La restriction virale exercée par S100A9 semble se dérouler entre les étapes tardives de la reverse transcription (RT) et l’intégration du provirus. Nos résultats révèlent donc l’existence d’une nouvelle activité antivirale présente dans les LC et pour laquelle nous souhaitons maintenant caractériser le mécanisme d’action. Nos données préliminaires nous orientent pour l’instant vers 2 mécanismes possibles que nous souhaitons analyser par des approches biochimiques et génétiques. Il est d’ores et déjà clair que cette étude génèrera des données biologiques sur de nouvelles cibles et leurs mécanismes impliqués dans les évènements précoces de l’infection par le VIH-1.

Le recueil de sang sur papier buvard (DBS pour Dried Blood Spots) est un outil permettant l’extension de la couverture de la charge virale VIH au Sud et d’extension des programmes de dépistage de l’infection à VIH et des hépatites B et C, au Nord comme au Sud.

La problématique générale des analyses réalisées sur DBS est le nombre important de facteurs pré-analytiques et analytiques pouvant influer sur le résultat. Ainsi, à l’exception de la charge virale VIH, il n’existe pas de réactifs approuvés par les fabricants sur cette matrice mais une grande diversité d’adaptations techniques. Il n’existe pas non plus de critères consensuels sur les conditions de stockage avant analyse, ni de matériel biologique de référence permettant aux laboratoires de démontrer la maitrise continue des performances et notamment pas de programmes d’évaluation externe de la qualité

Un sondage a permis d’identifier 15 laboratoires (8 au Nord et 7 au Sud) pratiquant des analyses sur DBS. Nous proposons de monter un premier Contrôle de Qualité Externe (CQE) portant sur 3 marqueurs sérologiques (Ag/Ac VIH, Ac HCV et HBsAg) et 3 marqueurs moléculaires (ARN VIH, ARN VHC et ADN VHB), avec 3 niveaux par marqueur (positif, positif faible et négatif), les niveaux faibles de charge virale étant proches des seuils décisionnels.

Ce premier CQE permettra de faire un état des lieux des indications et de la diversité des techniques utilisées au Nord et au Sud, et de leur concordance qualitative et quantitative. Il pourra être renouvelé pour accompagner les évolutions des techniques sur le terrain, et contribuer au processus d’amélioration continue.