Projets et candidats lauréats

Le virus de l’hépatite E (VHE), un virus à ARN positif, est la principale cause d’hépatite virale aiguë. VHE est reconnu comme un problème de santé publique dans les régions en développement. Il existe peu de données sur le rôle de la réponse immunitaire de l’hôte dans la pathogenèse de l’infection par le VHE. Nouveaux résultats d’études cliniques et épidémiologiques, associés à des taux élevés d’hépatite et de taux de mortalité élevés, ainsi qu’aux effets de la morbidité et de la mortalité maternelles. La réponse immunitaire innée est cruciale pour le confinement précoce de virus et joue un rôle clef pour la mise en place de la réponse adaptative spécifique.

En début de la grossesse humaine, les leucocytes tissulaires maternels présents dans la decidua sont représentés par une population majoritaire de cellules dNK (70%) et des macrophages deciduaux (20%). Ces cellules immunitaires innées ont un rôle clef dans la mise en place de l’interface mère-fœtus et dans le développement du placenta et du fœtus ainsi que dans la mise en place de la tolérance fœtale. Elles assurent également un rôle antimicrobien canonique pour la protection du fœtus contre les infections venant de la mère. 

Le projet de recherche de notre équipe vise à comprendre l’infection virale par l’hépatite E et la plasticité fonctionnelle des cellules immunitaires innées de l’interface mère-fœtus. Nous caractérisons tout d’abord l’impact de l’infection par le VHE sur la fonction des cellules stromales (trophoblastes, macrophages, cellules mésenchymateuses) à l’interface mère-fœtus. Définirons ensuite les mécanismes intrinsèques de contrôle / exacerbation de l’infection VHE. Enfin, nous déterminerons la plasticité fonctionnelle des cellules NK au niveau cellulaire et moléculaire, et nous analyserons l’impact de l’infection sur le dialogue entre les cellules NK et les macrophages.

Pour mieux étudier la réponse immunitaire au VHE, nous avons donc mis au point un modèle cellulaire innovant capable d’exprimer les protéines ORF2 et ORF3 du génotype 1 ou 3 du VHE. Nos préliminaires résultats montrent que les cellules NK sont capables de détecter le signal de stress dû à l’expression des protéines virales, de s’activer et d’enclencher leur fonction effectrice cytotoxique via la formation d’une synapse immunologique. Dans notre modèle de grossesse, nous avons également établi et créé un nouveau système d’expression de lentivirus qui permet la transduction de cellules tissus primaires avec une grande efficacité. Ces outils précieux vont nous permettre de mieux appréhender les questions posées sur le dialogue NK-macrophages et passer outre la difficulté de faible taux d’infection par VHE ex vivo.

En conclusion, ce projet nous permettra de disséquer l’interaction entre les composants immunitaires de l’hôte au cours de l’infection par le VHE et apportera de nouvelles informations pouvant aider à la compréhension de la pathogenèse du VHE pendant la grossesse.

Les macrophages (Mϕ) jouent un rôle clé dans la physiopathologie de l’infection VIH. Ils contribuent à la dissémination et sont d’importants réservoirs du virus. Ce sont les cellules cibles du virus dans le système nerveux central (SNC), dont l’infection conduit à des troubles neurologiques chez près de 50 % des patients. Etonnament, les mécanismes qui sous-tendent l’entrée du virus dans les Mϕ ne sont pas parfaitement élucidés. La majorité des virus qui infectent les Mϕ sont de tropisme R5, mais beaucoup des virus R5 ne sont que peu ou pas capables d’infecter les Mϕ, à la différence des lymphocytes T CD4 (LTCD4). Cela a trait à l’expression de facteurs de restriction dans les Mϕ, mais aussi comme nous venons de l’illustrer (Colin, PLoS Pathog, 2018), à des blocages à l’entrée virale. Pour des raisons qu’il conviendra d’identifier, l’efficacité d’utilisation de CCR5 par les virus (inversement proportionnelle au nombre de molécules de CCR5 requises à l’entrée virale) est moindre dans les Mϕ que dans les LTCD4. Nos résultats suggèrent que cela est lié à la nature des conformations de CCR5 qui diffèrent entre les Mϕ et les LTCD4. De manière intéressante, l’efficacité d’infection des Mϕ est augmentée lorsque ces cellules interagissent puis fusionnent avec des LTCD4 infectés (Bracq, JVI, 2017 ; et nos données préliminaires). Cela suggère donc que les contraintes habituellement rencontrées par les virus R5 pour infecter les Mϕ, et donc probablement la faible efficacité de leurs interactions avec CCR5, sont contournées lors d’un transfert viral entre les LTCD4 et les Mϕ.

Nous pensons que l’interaction Env/CCR5 est l’étape clé dont dépend le tropisme Mϕ des virus R5, et pour illustrer cela, nous poursuivrons trois objectifs spécifiques. i/ Nous caractériserons ces formes de CCR5 sur les Mϕ, comparativement à celles présentes dans les LTCD4. Nous souhaitons montrer que le caractère plus ou moins marqué du tropisme Mϕ des virus R5 varie suivant qu’ils sont capables d’exploiter ces conformations particulières de CCR5 à la surface des Mϕ. La permissivité des Mϕ à VIH varie aussi considérablement d’un donneur à l’autre, suivant l’origine tissulaire ou la polarisation de ces cellules, et nous chercherons à savoir si cela a trait à des modifications des propriétés structurales du corécepteur. Nous rechercherons enfin si des différences existent dans la nature des formes de CCR5 qu’expriment les Mϕ d’individus sains et de patients selon qu’ils ont ou pas développé des troubles neurocognitifs. ii/ Nous étudierons l’hypothèse que les virus R5 M- et non M-tropiques se distinguent par la nature des voies de signalisation de CCR5 qu’ils mobilisent. En effet, nous venons de montrer que les Envs de différentes souches de virus ne se lient pas nécessairement aux mêmes conformations de CCR5 à la surface cellulaire et ce faisant, n’activent pas les mêmes voies de signalisation intracellulaires en aval du corécepteur. Or la littérature atteste que la signalisation de CCR5 régule de manière critique l’accomplissement du cycle viral dans les Mϕ. iii/ Nous voulons enfin montrer que l’accroissement de l’efficacité d’infection des Mϕ via des contacts avec des LTCD4 conduit à ce que la majorité des virus R5 infectent les Mϕ. Nous pensons en effet que des expériences basées sur l’utilisation de virus libres ont depuis longtemps sous estimé la proportion des virus susceptibles d’infecter les Mϕ. Nous évaluerons aussi l’hypothèse que la formation de complexes entre les LTCD4 et les Mϕ conduit à accroitre l’efficacité des interactions Env/CCR5. Réciproquement, nous développerons des approches de vidéomicroscopie pour montrer que ces interactions jouent un rôle clé pour stabiliser les contacts entre LTCD4 et Mϕ et ainsi permettre à ces deux cellules de fusionner.

Ce projet est le fruit d’une réflexion entre nos deux équipes spécialisées depuis longtemps dans les mécanismes de l’entrée virale (B. Lagane) et de l’infection des Mϕ (S. Benichou). Il entend éclaircir les mécanismes moléculaires de l’entrée de virus R5 dans les Mϕ et ainsi mieux appréhender le rôle de ces cellules dans divers aspects de la physiopathologie de l’infection VIH.

Les virus responsables du SIDA, HIV-1 et HIV-2, ont développé des protéines dîtes auxiliaires afin d’échapper aux défenses immunitaires de l’hôte. Ces protéines virales inactivent les facteurs de restriction qui inhibent la réplication virale. Ainsi, Vpx, qui appartient à la lignée lentivirale HIV-2/SIVsmm, augmente l’infection virale en induisant la dégradation du facteur cellulaire SAMHD1. La dégradation de SAMHD1 ne permet pas d’expliquer l’ensemble des phénotypes associés à Vpx, ce qui nous a conduit à rechercher de nouvelles protéines cellulaires ciblées par cette protéine virale Vpx. Suite à un crible protéomique, nous avons identifié le complexe HUSH en tant que nouvelle cible de Vpx, un complexe composé des protéines Tasor, MPP8 et periphilin, et qui est impliqué dans la répression épigénétique de transgènes. Nos résultats montrent une diminution de l’expression de HUSH dans les cellules primaires et dans les cellules infectées par un virus HIV-2 qui exprime Vpx. Vpx interagit avec HUSH et induit sa dégradation par le protéasome, via le recrutement d’une ubiquitine ligase assemblée par DCAF1. De ce fait, Vpx est capable de réactiver des virus latents dans un modèle de latence, contrairement à des mutants de Vpx incapables d’assurer la dégradation de HUSH. De plus, nous avons montré que la fonction d’antagonisme de HUSH est spécifique de protéines virales issues de certaines espèces de singe. L’ensemble de nos résultats révèle que HUSH est un facteur de restriction au même titre que SAMHD1, actif dans les cellules T primaires CD4+ et contrecarré par Vpx.

Notre hypothèse est donc que HUSH représente un facteur additionnel clé de la latence virale chez les individus infectés par les virus HIV. Le projet présenté vise à étudier le rôle de la restriction HUSH dans la pathogénèse chez le patient. Dans cette optique, trois axes sont proposés :

1- Identification d’un peptide ou molécule qui induirait la dégradation de HUSH.

Le but ultime de cet axe est de tester si l’inactivation de HUSH peut permettre de réactiver des virus latents présents dans les cellules de patients infectés. Malheureusement, l’outil « Vpx » ne permet pas d’aborder cette question car le simple fait de « transfecter » ou « transduire » des cellules les active et réveille les virus indépendamment de la présence de toute protéine virale. Ainsi, mimer l’activité de Vpx avec un peptide ou molécule pourrait constituer une alternative pour valider nos conclusions sur des échantillons cliniques.

2- Etude de protéines Vpx issues de patients HIV-2 à différents stades de la maladie afin d’établir une corrélation potentielle entre l’inactivation de HUSH et la pathogénèse.

Nous faisons l’hypothèse que l’évolution de la maladie chez des patients infectés par le virus HIV-2 pourrait dépendre (entre autres) de variations au niveau des séquences de Vpx qui auraient un impact sur la dégradation de HUSH.

3- Etude d’une corrélation potentielle entre l’activité de HUSH et la virémie chez les patients infectés par HIV-1 ou HIV-2.

Nous proposons d’étudier s’il existe une corrélation entre l’activité de HUSH, mesurée via l’expression des gènes cibles de HUSH (dont l’expression est favorisée si HUSH est inactivée) et les taux d’ARN viral plasmatique (rapportés aux charges d’ADN viral intégré).

Nous espérons que l’ensemble de nos résultats permettra de caractériser le rôle de la restriction HUSH chez les patients infectés.

L’infection chronique par le virus de l’Hépatite B (HBV) concerne environ de 250 millions de personnes dans le monde et représente la première cause de carcinome hépatocellulaire (HCC). Les traitements antiviraux actuellement utilisés en clinique, principalement des analogues de nucléosides, permettent de réduire de façon significative la virémie dans le sang des patients, en agissant au niveau de la reverse-transcription virale mais ne résultent que rarement dans un effet suppresseur à long terme lors de l’arrêt du traitement. En effet, la présence du génome viral (ADNccc) dans le noyau des cellules infectées et sa capacité à réactiver la transcription/réplication virale lors de l’arrêt du traitement garantit la persistance du virus dans l’organisme et constitue une source continue de protéines virales qui contribuent à progressivement modifier les fonctions de l’hépatocyte.

Nos recherches s’intéressent à l’étude des fonctions régulatrices nucléaires de la protéine Core (ou HBc) d’HBV. En effet, en plus de ses fonctions structurales dans le cytoplasme, la protéine HBc est également présente dans le noyau de l’hépatocyte où elle s’associe au cccDNA et aux  ARN viraux. Le projet de recherche que nous avons initié depuis 2 ans (financé par l’ANRS en 2017) nous a conduits à identifier plusieurs protéines de fixation à l’ARN (RBP) parmi les facteurs associés à HBc dans le noyau des hépatocytes humains. En particulier, 11 facteurs d’épissages dont la protéine SRSF10 étaient hautement enrichis parmi les partenaires d’HBc. SRSF10 est une protéine SR qui régulé l’épissage alternatif de nombreux gènes cellulaires de façon phosphorylation-dépendante et qui intervient lors de la différenciation cellulaire et dans la réplication du VIH-1. Nous avons montré que SRSF10 exerce une activité anti-virale vis-à-vis d’HBV en diminuant les ARN viraux sans altérer leur épissage. De plus, nous avons identifié un composé (1C8), précédemment caractérisé comme un inhibiteur de la phosphorylation de SRSF10 comme pouvant exercer un fort effet anti-viral pan-génotypique (brevet N° EP18306398–DURANTEL18126AF). Des analyses biochimiques ont permis d’identifier les kinases CLK1, 2 et 4, responsables de la phosphorylation des protéines SR, comme les plus fortement inhibées par 1C8.  Dans l’ensemble ces résultats suggèrent que la forme dé-phosphorylée de SRSF10, induite lors du traitement par 1C8, est responsable de son effet anti-viral. Ils suggèrent aussi que l’activité de certaines kinases nucléaires, en particulier celles ciblées par 1C8, contrôle de façon critique la réplication d’HBV en modulant l’activité pro- ou anti-virale des RBP interagissant avec HBc. Les objectifs de ce projet sont : 1) d’identifier la(les) kinase(s) ciblées par 1C8 dans des hépatocytes ; 2) de caractériser l’activité antivirale de composés inhibant l’activité de cette (ces) kinase(s) in vivo. 3) d’analyser son (leurs) effets sur la phosphorylation d’HBc et ses fonctions dans le noyau, et 4) d’identifier de nouveaux facteurs pro- ou anti-viraux ciblés par cette (ces) kinase(s) dans des hépatocytes infectés par HBV. Ce projet permettra de déterminer comment des kinases nucléaires inhibent la réplication d’HBV, en particulier en contrôlant les activités nucléaires d’HBc, et de fournir des informations critiques pour le développement de nouvelles stratégies anti-virales.

Plus de 25 millions de personnes dans le monde souffrent d’une infection chronique par le virus de l’hépatite D (VHD). Alors que l’évolution clinique de l’infection aiguë par le VHD ne se distingue guère de l’hépatite B aiguë, à l’exception d’un taux plus élevé d’hépatites fulminantes, l’infection chronique par le VHD aggrave les pathologies hépatiques causées par le VHB. Le VHD se réplique dans les hépatocytes et les altérations qu’il induit se limitent au foie, se caractérisant par une nécrose des hépatocytes et des infiltrats inflammatoires. Le virion du VHD est une particule enveloppée constituée d’une enveloppe lipidique contenant des protéines de surface du VHB (HBsAg) et enrobant une ribonucléoprotéine interne (RNP), composée d’un multimère de la protéine delta (HDAg) codée pour le VHD et associée à une copie de l’ARN viral circulaire monocaténaire.

Bien que la protéine HDAg ait été initialement considérée comme un nouvel antigène du VHB, il a été montré par la suite qu’elle était associée à un petit ARN en tant qu’agent transmissible et défectueux utilisant les glycoprotéines (GP) d’enveloppe du VHB pour sa propagation, reflétant ainsi la nature du VHD comme virus satellite du VHB. En effet, les particules du VHD utilisent uniquement le mécanisme d’enveloppement et de bourgeonnement fournis par les GPs du VHB, ce qui permet ensuite le ciblage et l’entrée des particules du VHD dans les hépatocytes humains via des mécanismes qui dépendent des facteurs d’entrée du VHB. Le VHB, un virus « furtif » qui induit peu d’activation de la réponse innée et même la supprime, est lui-même réprimé lors d’une co-infection par le VHD,viadivers mécanismes directs et indirects. En particulier, l’activation de la réponse innée par le VHD, laquelle a peu ou pas d’effet sur le VHD lui-même, peut affecter plusieurs paramètres du VHB.

L’origine du VHD est actuellement inconnue. Il est possible que son ARN provienne du transcriptome cellulaire, en accord avec la découverte selon laquelle les ARN circulaires sont abondants dans les cellules. Par conséquent, une possibilité pourrait être que l’ARN du VHD soit apparu dans des hépatocytes infectés par le VHB après évolution de formes d’ARN cellulaire circulaires devenant auto-réplicatives et pour lesquelles le ribozyme viral et les séquences d’ARN codant pour HDAg pourraient être issues du transcriptome humain. Alternativement, comme l’ARN du VHD peut s’auto-répliquer dans une grande variété de types de cellules et d’espèces, ceci pose la possibilité théorique qu’il puisse être transmis par des processus différent de ceux fournis par le VHB.

Une étude récente de notre laboratoire a montré la possibilité que le VHD peut être transmis dans des infections expérimentales in vivopar différents virus génétiquement non apparentés au VHB, notamment par le virus de l’hépatite C (VHC). Ces résultats suggèrent que le VHD interrogent sur les raisons pour lesquelles le VHD semble, en apparence du moins, avoir naturellement évolué avec le VHB et non avec d’autres virus hépatotropes tels que le VHC. Dans le cas d’éventuelles co-infections VHD/VHC naturelles, le VHD et le VHC pourraient soit se neutraliser mutuellement, via des interactions réciproques négatives, soit coexister simultanément, ce que nous proposons de modéliser et disséquer dans ce projet.

Ainsi, nous investiguerons dans des co-infections expérimentales VHD/VHC in vitroet in vivo: 1) comment le VHC, qui est génétiquement différent du VHB, pourrait fournir au VHD ses mécanismes d’enveloppement, de bourgeonnement, de sécrétion ainsi que ses fonctions d’entrée ou de transmission, 2) quelles seraient les conséquences d’une telle transmission sur la réplication et la propagation du VHD, ou vice-versa, et sur ses interférences directes ou indirectes (immunes) entre les deux virus. Ce projet devrait également permettre de mieux comprendre les mécanismes qui on permis au VHD de s’adapter naturellement au VHB.