Winning projects and candidates

Contexte

Les virus à ARN tels que le VHC ont développé des mécanismes moléculaires qui sont considérés comme moins dépendants de la transcription et la biologie nucléaire que des processus post-transcriptionnels, y compris la traduction.

Des études dans le domaine de la biologie cellulaire ou du cancer démontrent que la chimie de l’ARN ribosomal (ARNr) est susceptible de plasticité au niveau de la 2′-O-méthylation (2′-O-Me), un événement moléculaire ayant un impact sur la traduction en termes d’activité et de fidélité. Notre hypothèse, fondée sur l’ensemble des données préliminaires, est que le VHC pourrait altérer la 2′-O-Me, induisant des conséquences fonctionnelles qui lui seraient bénéfiques.

Les objectifs de ce projet sont de disséquer l’impact du VHC sur la chimie de l’ARN ribosomal (spécifiquement le 2′-O-Me) et sa voie de régulation, ainsi que de le corréler avec ses conséquences phénotypiques virales et cellulaires.

Données préliminaires

Les équipes candidates ont en particulier montré que :

– il existe des preuves directes de l’impact du VHC sur la 2′-O-Me des ARNr 5S, 18S et 28S en utilisant la technique RiboMethSeq ;

– le 2′-O-Me de l’ARNr in vitro pourrait être modifié par la modulation de la fibrillarine (FBL) ; 

– Le VHC est étonnamment sensible à la déplétion des FBL (inhibition de l’expression du noyau de 10 fois, mais augmentation de 4 fois des niveaux d’ARN du VHC),

– Le VHC peut modifier spécifiquement la traduction de transcrits hôtes pertinents pour la survie cellulaire (par exemple, UNC5A) mais pas d’autres (par exemple, l’ARNm de référence GUS) dans les échantillons de patients.

Méthodologie

Sera considéré en premier lieu l’impact de la réplication de HCV JFH1 sur les ribosomes de la cellule hôte, via la 2′-O-Me de l’ARNr, qui sera cartographiée après isolement de l’ARN total ou fractionnement polysomal par RiboMethSeq. En outre, l’impact du VHC sur la voie de ribométhylation de la cellule hôte (protéines Nop, FBL, snoRNAs, rRNA), l’activité et la fidélité traductionnelles de la cellule hôte en tenant compte de cibles pertinentes pour la virologie et la pathologie du VHC telles que ApoB/E et EGFR sera étudié par spectrométrie de masse.

Réciproquement, sera examiné l’impact des altérations de la 2′-O-Me ribosomale sur la souche JFH1 à travers l’évaluation des principaux paramètres viraux. Des validations virologiques seront effectuées sur les souches de Gt1 H77 et de Gt3 S52.

Enfin, une validation clinique des données sera mise en œuvre à l’aide de la cartographie par RiboMethSeq de la 2′-O-Me de l’ARNr dans les échantillons de biopsies HCV+ par rapport à des échantillons HCV-, en considérant les sites de méthylation de l’ARNr identifiés comme sensibles au VHC in vitro, et en prenant en compte plusieurs critères clinico-biologiques dans des analyses multivariées.

Faisabilité

Les deux équipes travaillent sur la traduction cellulaire depuis le début des années 2010 en utilisant deux modes d’approche distincts : par le biais du VHC et de la biologie des cellules hépatiques pour l’équipe A, et par le biais du cancer et des caractéristiques structurelles du ribosome pour l’équipe B, indiquant leur complémentarité.

Dans l’ensemble, ce projet devrait permettre de disséquer les nouvelles propriétés de subversion des virus à ARN (+), en utilisant le VHC comme modèle principal, et devrait contribuer à l’identification de domaines du ribosome hépatocytaire utilisables pour d’éventuelles thérapies à base d’ARN.

L’hépatite E touchant l’homme est une hépatite virale causée par le virus de l’hépatite E (HEV). Le virus infecte chaque année près de 20 millions de personnes, conduisant à environ 3,3 millions de cas symptomatiques et 44000 à 70000 morts. Bien qu’impactant substantiellement les systèmes de santé, y compris dans les pays développés, de nombreuses questions restent sans réponse quant au fonctionnement de ce virus, notamment au niveau structural. Comme la plupart des virus à ARN positif, le HEV code une polyprotéine, appelée ORF1, indispensable à la réplication virale. L’ORF1 est notamment responsable de la synthèse des nouveaux génomes, lesquels seront ensuite encapsidés avant propagation à d’autres cellules. Jusqu’à très récemment, aucune structure tridimensionnelle n’avait été résolue pour cette protéine. Plus généralement, la délimitation et les fonctions des domaines qui constituent l’ORF1 de HEV sont encore sujettes à caution. L’absence de données structurales découle de la grande difficulté à produire les polyprotéines virales, en particulier présentant les critères requis pour des projets de biologie structurale (solubilité, pureté, quantité et activité). Cependant, un verrou technique a été levé ces dernières années, grâce à l’utilisation d’un système d’expression par traduction in vitro à partir d’extrait de germes de blé, qui permet, pour des protéines réputées très difficiles à exprimer, la production de plusieurs milligrammes de protéines pures, solubles, repliées et fonctionnelles. Nous avons mis en place au laboratoire cette technique de traduction in vitro et nous l’appliquons à plusieurs projets, en particulier pour la production de polyprotéines de réplication homologues à l’ORF1 du HEV y compris celles de virus humains. Le présent projet vise à déterminer la possibilité de produire l’ORF1 du HEV avec ce système de traduction in vitro, en se focalisant sur  les génotypes 1 et 3 (respectivement souches Sar55 et Kernow C1-p6). Au terme du contrat d’initiation, nous pensons être à même de débuter l’étude structurale de cette polyprotéine par cristallographie des rayons X et cryo-microscopie électronique. En parallèle, nous pourrons également réaliser des études fonctionnelles pour mieux comprendre la ou les fonctions de la polyprotéine mais également de chacun des domaines qui la composent.

La tuberculose (TB) causée par Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est un enjeu mondial de santé publique, dont l’importance sera accentuée par la crise sanitaire de la COVID-19. Des stratégies innovantes sont nécessaires pour améliorer l’efficacité des traitements antituberculeux actuels. Le décryptage de la réponse immunitaire anti-Mtb pourrait guider des approches dirigées vers l’hôte (HDT), afin de renforcer les traitements antibiotiques dont nous disposons. Les lymphocytes T spécifiques de Mtb sont essentiels pour la guérison des patients tuberculeux. Dans ce projet nous proposons une approche translationnelle pour caractériser le répertoire des récepteurs, les fonctionnalités et les spécificités antigéniques précises des lymphocytes T spécifiques de Mtb chez les patients traités pour la TB. Ce projet d’intitiation vise à mettre au point un flux de travail innovant basé sur l’utilisation des techniques de séquençage sur cellules uniques. Pour ce faire, les lymphocytes circulants spécifiques de Mtb seront sélectionnés de manière exhaustive et non-biaisée avec un large panel de peptides Mtb couplés aux molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH), multimérisées et marquées avec des code-barres oligonucléotidiques. Chaque panel sera personnalisé en fonction des allèles du CMH du patient (au cours de ce projet l’allèle  fréquente A2 sera exploré) et de l’isolat clinique de Mtb correspondant. Par cette approche de médecine personnalisée de la TB nous allons promouvoir la détection d’antigènes rares de Mtb et de lymphocytes T spécifiques de Mtb rares, mais pertinents pour la réponse immunitaire protectrice contre la TB et pour des futurs vaccins.

Une fois mis au point et validé, ce flux sera appliqué afin d’explorer une plus large cohorte de patients. L’accomplissement d’une telle étude permettra de caractérises des lymphocytes T protectrices anti-Mtb et de nouveaux peptides immunogènes de Mtb, offrant ainsi de nouvelles perspectives de développement de HDT dans la tuberculose.

L’incidence du cancer anal est en forte augmentation depuis qu’elle est passée de 1,5 à 6 cas pour 100000 habitants, principalement dans la population des hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes (HSH) et séropositifs. Le VIH présente un sur-risque évalué de 20 à 100 fois supérieur à celui de la population générale. Le carcinome épidermoïde de l’anus (CA) est ainsi devenu le troisième cancer chez l’homme infecté par le VIH. Il est secondaire à une infection par le papillomavirus humain (HPV). Les génotypes à haut risque oncogénique (HR-HPV, type 16 et 18), sont responsables de la dysplasie anale et du cancer. L’incidence de l’infection au HPV varie selon le sexe, l’âge, le nombre de partenaires sexuels, la pratique des rapports anaux et l’immunosuppression. Cette infection est plus fréquente chez les HSH avec ou sans infection par le VIH.

Les marqueurs associés à l’évolution de ces lésions dysplasiques vers des lésions cancéreuses sont relativement bien décrits dans la carcinogénèse du col de l’utérus. Au contraire, à ce jour, l’évolution de ces marqueurs est peu décrite pour la carcinogénèse anale et uniquement dans des études transversales. Ainsi, il est nécessaire d’acquérir des connaissances dans la physiopathologie de l’infection à HPV au niveau du canal anal afin de pouvoir identifier les patients porteurs de lésions dysplasiques anales qui seraient à risque élevé de progression vers le cancer.

L’objectif de ce projet est d’étudier les marqueurs de l’évolution des lésions dysplasiques anales (méthylation de l’ADN et intégration de l’ADN HPV dans le génome humain) dans le cadre d’une étude ancillaire chez les patients infectés par HPV issus de la cohorte Nationale des patients ayant des lésions anales dysplasiques de haut grade, dite « Cohorte AIN3 ». Les inclusions dans la Cohorte AIN3 ont été stoppées en Juin 2020. Au total, 977 sujets ont été inclus dans 28 centres sur l’ensemble du territoire national, avec un âge médian de 49 ans, dont 56% d’hommes et 390 (40%) personnes vivant avec le VIH (PVVIH). Le suivi médian est de 42,8 mois (IQR = 40.0-45.1). Nous observons à ce jour 54 sujets avec un carcinome épidermoïde de l’anus.

L’objectif principal de ce projet est d’étudier l’association possible entre le niveau de méthylation de l’ADN mesuré dans le frottis anal à l’inclusion dans la cohorte AIN3 avec l’évolution clinique à 3 ans.

Les objectifs secondaires sont :

– Décrire le niveau de méthylation de l’ADN en fonction du stade des lésions cytologiques et son évolution entre deux frottis anaux du même patient recueillis à 1 an d’intervalle pour lesquels une aggravation des lésions cytologiques est survenue ;

– Décrire la proportion de patients, parmi ceux avec un matériel histologique disponible, chez lesquels le génome HPV est présent sous forme intégrée dans le génome humain ;

– Décrire l’évolution longitudinale du niveau de méthylation de l’ADN et du statut de l’intégration de l’ADN HPV dans le génome humain chez les patients ayant développé un cancer ;

– Décrire la localisation génomique des sites d’intégration du génome HPV dans le génome humain.

Les analyses du niveau de méthylation de l’ADN se feront par PCR en temps réel. Pour mettre en évidence les évènements d’intégration du génome HPV dans le génome humain nous allons utiliser une technologie de capture des génomes HPV suivie d’un séquençage haut débit (Capture-NGS).

Cette étude fournira, dans le cadre de la cancérogenèse anale liée à l’HPV, la première description conjointe dans une étude longitudinale de deux marqueurs d’évolution des lésions dysplasiques : le niveau de méthylation de l’ADN et l’intégration du génome viral dans le génome humain. Notre projet fournira de nouvelles données en cancérogenèse anale et l’identification de biomarqueurs innovants potentiels prédisant la progression d’une lésion dysplasique anale. Les résultats de cette recherche translationnelle aideront à la prise en charge d’une lésion anale de haut grade, procédure qui pourrait être évaluée dans d’autres études cliniques. Le processus de carcinogénèse anale due à HPV reste encore mal connu ce jour.

La recherche sur les vaccins contre le VIH-1 a connu un essor considérable depuis la découverte de nombreux anticorps largement neutralisants (bnAbs) ciblant divers sites de la glycoprotéine d’enveloppe (Env) du VIH-1.

Bien qu’aucun vaccin capable d’induire une réponse anticorps neutralisante d’un large spectre (bnAb) n’ait encore été mis au point, des progrès considérables ont été réalisés pour comprendre la complexité de la réponse humorale au cours de l’infection. Ces études ont conduit à la découverte d’une pléthore d’anticorps ciblant divers sites de la protéine d’enveloppe (Env)  tels que les régions V1/V2, V3, le site de liaison aux CD4, sur la sous unité gp120 , le peptide de fusion sur la sous unité gp41 et/ou l’interface gp120/gp41, la face silencieuse de la gp120 et la région externe proximale de la membrane (MPER) de la gp41. La biologie structurale, associée à des études longitudinales sur le développement de la lignée des cellules B, a joué un rôle clé dans la compréhension du rôle de l’hypermutation somatique dans la génération d’anticorps largement neutralisants. Malgré ces avancées, le développement d’un vaccin pose toujours d’énormes défis et les approches vaccinales actuelles utilisant des trimères Env natifs induisent au mieux une neutralisation autologue.

La région externe proximale de la membrane (MPER) de la gp41 est l’une des régions de l’Env les plus conservées et les anticorps bnAbs spécifiques de la MPER sont parmi les anticorps les plus largement neutralisants. Les bnAbs MPER reconnaissent des épitopes linéaires courts et utilisent un long CDR3 de la chaîne lourde (HCDR3) qui n’est pas nécessaire à la reconnaissance de l’épitope, mais essentiel pour la neutralisation. HCDR3 contient généralement des résidus hydrophobes aromatiques à son extrémité qui sont positionnés pour s’insérer dans la bicouche lipidique. En outre, les bnAbs MPER interagissent avec la membrane via des contacts électrostatiques ou une interaction lipidique spécifique. Cela a conduit à la proposition que les bnAbs MPER sont autoréactifs et donc difficiles à induire par la vaccination. Une structure récente de la gp41 réalisée par notre laboratoire suggère que les bnAbs MPER entrent également en contact avec le peptide de fusion (FP) via le hCDR3 en plus de l’interaction MPER établie. Nous émettons donc l’hypothèse que toutes les tentatives passées d’induire des anticorps neutralisants MPER ont échoué parce que les immunogènes employés manquaient de FP. A partir de nos résultats acquis ou préliminaires sur des anticorps neutralisants ciblant l’interface du MPER et du FP, nous proposons donc de caractériser davantage l’interaction HCDR3-FP et de tester l’immunogénicité d’un ensemble de nouveaux immunogènes qui incluent le MPER et le FP dans un environnement de bicouche lipidique. L’objectif principal de cette proposition est de (i) concevoir de nouveaux antigènes de la gp41 qui présentent le MPER et le FP, (ii) présenter le ou les immunogènes dans un environnement membranaire via une formulation vaccinale d’ARNm ou des nanoparticules, (iii) tester l’immunogénicité chez les petits animaux et (iv) évaluer la neutralisation, y compris l’isolement de bnAbs comme preuve de concept.

Bien que la prévalence du VIH-1 groupe M (VIH-1M) soit relativement faible dans les pays de la région du bassin du Congo (BC), ceux-ci abritent pourtant une quantité extraordinaire de diversité virale. Outre le sous-type A et le recombinant CRF02_AG, responsable de la plupart des infections dans la région, les lignées virales en circulation incluent également tous les sous-types connus du VIH-1M, de nombreux autres formes recombinantes et des lignées très divergentes qui apparaissent généralement á la base des arbres phylogénétiques du VIH-1M. Même si on ne peut exclure la possibilité que cette distribution soit le fait du hasard (c’est à dire sans avoir besoin d’invoquer un avantage au niveau du fitness), on devrait au moins se demander comment ces lignées ont persisté comme prédominantes dans cette région où le potentiel de compétition entre le sous-type A, le CRF02_AG et les virus appartenant aux autres sous-types est très élevé. Au-delà du BC, il est bien établi que les sous-types du VIH-1M sont répartis de manière inégale dans les pays d’Afrique subsaharienne; suggérant la possibilité que les caractéristiques intrinsèques de ces sous-types puissent expliquer, ou du moins contribuer aux différences épidémiologiques observées dans ces régions. Des études sont donc nécessaires pour déterminer s’il existe des différences biologiques entre les souches virales circulant dans le BC susceptibles d’expliquer leur répartition inégale dans la région.

La protéine virale Gag est essentielle au cycle de vie du VIH. Des corrélations entre la capacité réplicative (CR) virale induite par la protéine Gag et les marqueurs de progression de la maladie d’une part ou avec la CR de virus entiers d’autre part ont été bien établis. En outre, des résultats antérieurs ont révélé une hiérarchisation de la CR induite par Gag dans les épidémies de l’Afrique de l’Est où plusieurs sous-types co-circulent ; hiérarchisation qui était similaire à la distribution épidémiologiques des sous-types. Cependant, toutes ces études étaient restreintes aux sous-types de VIH-1M circulant en dehors du BC et ne peuvent donc pas par conséquence expliquer pourquoi certaines lignées de VIH-1M circulant dans le BC ne se sont pas propagées dans le reste du monde.

Les objectifs principaux de l’étude proposée sont de déterminer (1) les variations de la fonction de la protéine Gag qui existeraient entre les lignées de VIH-1M circulant dans le BC, et (2) si les différences observées concordent avec les différences épidémiologiques des variants viraux circulant dans la région. Plus spécifiquement, nous testerons l’hypothèse selon laquelle, par rapport aux virus prédominants du sous-type A et du CRF02_AG, les souches rares (sous-types H, J et K) et inhabituelles du VIH-1M circulant dans le BC, ont une CR sous-optimale induite par la protéine Gag (et par conséquent, des taux de transmissibilité réduits). Il est possible qu’il existe une fourchette de CR en dehors desquelles les virus seraient incapables de se propager et que les variants rares du VIH-1M du BC aient des CR qui se situent en dehors de cette fourchette. Pour atteindre ces objectifs, nous allons (i) évaluer l’épidémiologie moléculaire du VIH-1M dans deux pays de la région du BC: le Cameroun, qui a probablement été le lieu de la transmission initiale inter-espèces ayant abouti au VIH-1M, et la République Démocratique du Congo qui fut le point de départ de l’épidémie mondiale du VIH; (ii) identifier et caractériser des nouvelles lignées très divergentes et (iii) évaluer la fonction Gag de tous les isolats de VIH-1M circulant dans ces deux pays.

Cette étude permettra d’expliquer l’histoire de la propagation de l’épidémie du VIH-1M dans la région du BC et au-delà. Par exemple, elle pourrait fournir une indication sur la raison pour laquelle certains variants rares circulant dans le BC ne se sont pas propagés à l’échelle mondiale. L’étude est prévue pour 24 mois et renforcera notre collaboration et partenariat avec des scientifiques en France et en Afrique du Sud. De plus, les activités de renforcement des capacités mettront l’accent sur la formation d’un jeune scientifique dans le domaine de la virologie du VIH.