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Le développement d’approches innovantes pour lutter contre l’infection à VIH, y compris les vaccins prophylactiques et thérapeutiques, reste une priorité pour mettre fin à la pandémie du VIH/SIDA. La plateforme de nanoparticules lipidiques (LNP) d’ARNm présente un potentiel très prometteur pour la vaccination. Cependant, il est prouvé que son immunogénicité et son efficacité à long terme doivent être renforcées, ce qui est généralement obtenu grâce aux effets des adjuvants. Notre objectif ici est de développer et d’évaluer la réactogénicité et le potentiel d’induction d’une immunité efficace spécifique du HIV/SIV d’une plateforme vaccinale combinant ARNm-LNP et un agoniste de STING comme adjuvant. Les agonistes de STING sont de puissants inducteurs de la sécrétion d’interféron de type I (IFN) et représentent des immunomodulateurs prometteurs favorisant l’induction de fortes réponses cellulaires et humorales. Nous générerons et utiliserons des vecteurs LNP encapsulant des ARNm codant pour des antigènes modèles, VIH/VIS gag, et l’agoniste de STING cGAMP pour la délivrance d’antigènes et l’adjuvanticité respectivement. Des formulations associant ARNm-LNP avec ou sans adjuvant seront testées à l’aide d’approches d’induction de lymphocytes T spécifiques d’antigène in vitro, et après immunisation intramusculaire ou intranasale chez des souris standards ainsi que HLA-A2 transgéniques. La quantité et la qualité des lymphocytes T spécifiques de l’antigène et des anticorps seront analysées dans ces modèles. Enfin, nous caractériserons in vitro la réponse des cellules innées de primates non humains en réponse aux ARNm-LNP avec ou sans adjuvant, ainsi que leur capacité à stimuler des lymphocytes T mémoires spécifiques de SIV, expériences préliminaires à des essais in vivo chez le macaque.

Le virus de l’hépatite E (HEV) est la cause la plus fréquente d’hépatites aiguës dans le monde. Les souches infectant l’homme appartiennent à l’espèce Orthohepevirus A. Les génotypes 3 et 4 sont notamment responsables d’hépatites chroniques chez la personne immunodéprimée et le génotype 1 d’hépatite fulminante chez la femme enceinte. Le HEV est un virus à ARN simple brin de polarité positive, retrouvé sous forme d’une particule nue dans les selles des patients et le milieu extérieur mais qui quitte la cellule infectée et circule dans le sang sous la forme d’une particule associée aux lipides. Les mécanismes qui conditionnent le bourgeonnement de cette particule, dite quasi-enveloppée, sont encore mal connus. Le bourgeonnement des particules HEV emprunte des éléments de la voie des exosomes ; nos résultats préliminaires indiquent aussi un rôle de l’autophagie dans le cycle du HEV. Nous avons développé un système de culture du HEV sur hépatocytes polarisés en culture qui reproduit les principales caractéristiques physiologiques de l’hépatocyte et permet d’analyser les sécrétions apicale (biliaire) et basolatérale (vasculaire). Nous avons montré que le HEV est sécrété sous une forme quasi-enveloppée aux deux pôles de l’hépatocyte mais que les particules infectieuses sont préférentiellement sécrétées du côté biliaire. Exocytose, autophagie et polarisation épithéliale sont liées par certaines protéines communes. L’objectif de ce projet est d’explorer le rôle de l’autophagie dans le bourgeonnement du HEV en tenant compte de la polarisation de l’hépatocyte.

L’expression de protéines clés de la voie d’autophagie sera éteinte par la transfection de shRNA dans les cellules polarisées et leur effet sera évalué par la quantification de l’ARN HEV intra- et extracellulaire et de l’infectiosité des particules sécrétées. Des analyses de colocalisation des protéines virales ORF2 et ORF3 avec des marqueurs des vésicules impliquées dans l’autophagie et l’exocytose seront réalisées à partir d’images obtenues en microscopie confocale. Pour une analyse fine de ces colocalisations, nous utiliserons ensuite la microscopie de super-résolution.

Nous avons identifié dans la séquence de la protéine de capside ORF2 un domaine homologue à un domaine LIR (LC3 interacting region). Nous étudierons l’interaction de la protéine de capside ORF2 et de la protéine de l’autophagie LC3B par communoprécipitations et mutagenèse dirigée de la séquence LIR.

Les phosphoinositides (PI) font partie des molécules ségrégées lors du processus de polarisation avec un enrichissement en phosphatidylinositol(4, 5) biphosphate [PtdIns(4,5) P2] au pôle apical et en PtdIns (3, 4, 5) P3 au pôle basolatéral. Nous souhaitons déterminer si les sites membranaires enrichis en PtdIns (4,5)P2 au pôle apical sont ceux où s’accumulent les protéines ORF2 et ORF3. Nous étudierons en outre la distribution de la PI kinase de classe I et de PTEN (PI3P phosphatase), les enzymes qui assurent la transition du PtdIns (4,5)P2 au PtdIns (3, 4, 5)P3 et inversement, ainsi que celle du cholestérol.

Pour compléter cette étude, et comprendre les différences de densité et d’infectiosité que nous avons observées entre le pôle apical et le pôle basolatéral, nous déterminerons la composition des particules virales sécrétées à chaque pôle par des expériences de protéomique et de lipidomique.

Ce travail permettra de mieux comprendre les voies de sécrétion biliaire et vasculaire que détourne le HEV pour se propager. La détermination d’acteurs clés du cycle viral pourrait ouvrir la voie à la mise en évidence de nouvelles molécules antivirales, agissant sélectivement sur les voies de sécrétion polarisées pour limiter l’infection de l’hôte et la propagation du HEV.

Le projet METEOR est axé sur l'exploration de l'exométabolome de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) afin de comprendre son rôle dans l'adaptation et la virulence de cette bactérie pathogène. Bien que l'exométabolome joue un rôle crucial à l'interface hôte-pathogène, aucune analyse approfondie et systématique de l'exométabolome de Mtb n'a été réalisée jusqu'à présent. Les données préliminaires indiquent que Mtb sécrète une large variété d'intermédiaires métaboliques dans son environnement, ce qui pourrait être crucial pour influencer les interactions hôte-pathogène.

Le projet a trois principaux objectifs. Premièrement, il vise à réaliser la première caractérisation sans a priori de l'exométabolome de Mtb sous diverses conditions de stress. Cela impliquera l'identification des exométabolites libérés lors des différentes réponses au stress, révélant ainsi des mécanismes d'adaptation de Mtb. Deuxièmement, le projet se concentrera sur l’élucidation des voies de biosynthèse de ces exométabolites clés, qui sont essentielles pour l'adaptation de Mtb aux stress. Troisièmement, le projet examinera comment ces métabolites affectent la virulence de Mtb en utilisant des modèles in vitro (macrophages) et in vivo(modèle murins). Cela impliquera le ciblage d'enzymes spécifiques au sein de ces voies pour comprendre leur impact sur la virulence de Mtb.

Pour atteindre ces objectifs, le projet METEOR utilise une combinaison d’approches de métabolomique basée sur la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la spectrométrie de masse (SM). Cette approche bénéficie de la facilité expérimentale d'accès à l'exométabolome par rapport aux métabolites intracellulaires et, de la capacité à identifier les métabolites abondants dans l’exométabolome grâce aux techniques de RMN et de SM.

Le projet est divisé en trois workpackages (WPs). Dans le WP1, l’étude se concentre sur une analyse approfondie de l'exométabolome de Mtb, incluant l'identification et la quantification des métabolites libérés sous diverses conditions de stress. Dans le WP3, l’étude vise à moduler la production et l'excrétion des métabolites en modifiant génétiquement les réseaux métaboliques de Mtb, en créant des mutants pour tester les effets sur les profils métaboliques et l'activité métabolique. Enfin, dans le WP3, le rôle de ces métabolites dans la virulence de Mtb est exploré en testant leur impact sur des macrophages infectés et des modèles murins. Cela inclut l'évaluation de la fitness des souches de Mtb et de la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection.

Le projet METEOR fournira donc une vision unique sur le fonctionnement du réseau métabolique de Mtb et les interactions hôte-pathogène, offrant l’opportunité d'identifier de nouvelles cibles pour des thérapies anti-TB innovantes.

Différents processus cellulaires controlant la stabilité de l’ARN peuvent avoir de effets sur la réplication virale. C’est notamment le cas du nonsense mediated mRNA decay (NMD) qui dégrade les ARN messagers présentant un codon stop dans un contexte atypique. Récemment, la caractérisation des ARN retroviraux comme des cibles potentielles du NMD nous a amené à nous demander comment ces retrovirus arrivent à contourner cette menace et comment cela peut modifier l’expression des genes cellualires : une cis-inhibition du NMD qui n’impacte que l’ARN viral et/ou une trans-inhibition du NMD qui modifie également la stabilité des ARN cellulaires. Dans le cas du VIH, l’ARN viral semble globalement protégé mais nous ne savons pas encore ce qui empeche le NMD de cibler cer ARN. De plus, il n’a jamais été demontré si l’expression du VIH peut moduler l’efficacité du NMD en trans, affectant alors les ARN cellulaires et comment cela se traduit sur les voies associées que sont le splicing alternatif et la traduction.  

Dans ce programme de recherche nous prévoyons de démontrer tout d’abord que le NMD est sensible à l’expression du virus VIH en mesurant la stabilité des ARN et les niveaux de protéines traduites dans des cellules. Pour ce faire, nous utiliserons des ARN rapporteurs sensibles au NMD que nous avons déjà largement utilisés dans le passé. Dans un second temps, nous décrirons le mécanisme d’inhibition après avoir identifié son effecteur viral.Chaque protéine d’VIH sera testée seul ou en combinaison. Des résultats préliminaires ont déjà montré que Rev peut inhiber le NMD. Sur la base de ce travail et notre connaissance de l’autre rétrovirus humain HTLV  (notamment de l’homologie entre Rev et HTLV-1 Rex), nous suspectons que l’inhibition dependante de Rev soit liée à son activité de transfert nucléo-cytoplasmique à travers son interaction avec CRM1. La caractérisation de l’effet de Rev sera aussi analysé du point de vue des facteurs du NMD : en utilisant des protéines mutantes et des drogues déjà décrites, nous pourrons definirà quelle(s) etape(s) du nmd VIH manipule. dans la troiseme partie du projet, nous voulons cribler  les arn dont la dérégulation est liée 0 l’inhibition du NMD. La caractérisation des ½ vies des ARN cellulaires srea réalisée par RNAseq dans des cellules exprimant Rev. Nous avons déjà mis au point cette procédure pour des analyses similaires avec des portéines d’HTLV-1 au laboratoire.  De ces résultats de RNAseq et en utilisant des outils de bioinformatique developpées par d’autres équipe du LBMC, nous analyserons l’impact de cette inhibition du NMD sur le splicing alternatif. Finallement nous réaliserons des ribosomes footprintings afin de corréler la dérégulation du NMD à une possible modification de l’éfficacité traductionnelle.

Des résultats préliminaires ont déjà validé Rev comme inhibiteur du NMD. Ainsi, dès le début du projet, nous pourrons commencer à travailler sur 2 axes en parallèle : la description du mécanisme d’inhibition et l’identification des cibles NMD cellulaires en RNAseq.

activateurs de l’immunité innée. Une fois reconnus par des récepteurs cytosoliques, ils déclenchent la production de cytokines pro-inflammatoires et d’interférons. La voie de signalisation reposant sur les protéines cGAS et STING a été identifiée comme essentielle pour la détection des acides nucléiques cytosoliques. Néanmoins, nous avons pu montrer que, dans des cellules dépourvues de cGAS, la présence d’ADN double brin cytosolique peut induire la production d’interférons. Cela indique la présence de voies de détection des acides nucléiques qui opèrent en l’absence de cGAS. Nous avons identifié qu’en l’absence d’une voie cGAS-STING active, des protéines appartenant à la voie de réparation de l’ADN par jointure d’extrémités non-homologues (ou « non-homologous end-joining » (NHEJ)), en particulier PRKDC et PAXX, jouent un rôle majeur dans la détection des ADNs double brins cytosoliques. En effet, des analyses biochimiques et fonctionnelles montrent que l’activité catalytique de la protéine PRKDC est nécessaire pour les réponses inflammatoires indépendantes de cGAS et que PAXX est un régulateur négatif de ces réponses. Nous proposons d’étudier la contribution de la voie du NHEJ, et en particulier de PAXX, aux réponses inflammatoires associées au VIH-1.

Sur la base de nos données préliminaires, j’émets l’hypothèse qu’en absence de cGAS, l’ADN double brin dérivé du VIH-1 peut être détecté par la voie du NHEJ et que PAXX régule négativement  cette voie de signalisation. Pour tester cette hypothèse, nous poursuivrons 3 objectifs:

1. Caractériser les déterminants du recrutement du NHEJ sur l’ADN double brin cytosolique en absence de cGAS.
2. Évaluer la contribution du NHEJ et en particulier de PAXX sur la détection immunitaire innée dans les cellules qui n’expriment pas cGAS.
3. Étudier l’impact des composantes du NHEJ sur la réponse inflammatoire associée au VIH-1.

La réalisation de ces objectifs me permettra de démontrer que les protéines du NHEJ, en particulier PAXX, sont des régulateurs clés des réponses inflammatoires associées au VIH-1. Ceci est d’autant plus intéressant car les traitements actuels qui visent à réduire l’inflammation associée aux acides nucléiques ciblent principalement la voie de signalisation associée à cGAS. Cependant, nos données montrent que lorsque cGAS est absent, la voie du NHEJ déclenche des réactions inflammatoires qui peuvent avoir des effets délétères supplémentaires. L’inhibition de l’activité catalytique de PRKDC peut bloquer cette réponse inflammatoire indépendante de cGAS. En conséquence, ce projet permettra de mettre en lumière de nouvelles voies pour moduler ou prévenir l’inflammation associée au VIH-1.

            La vaccination fait partie des moyens de prévention de certaines infections sexuellement transmissibles proposés aux hommes ayant des relations sexuelles avec des hommes (HSH). En raison des risques auxquels ils sont exposés, les recommandations vaccinales françaises préconisent que les HSH se vaccinent contre l’hépatite B, l’hépatite A et, pour les moins de 26 ans, contre les infections à papillomavirus humains (PVH). Les données de couvertures vaccinales et les études sur les déterminants du recours à la vaccination chez les HSH sont peu nombreuses en France, pays par ailleurs caractérisé par une défiance de la population générale envers les vaccins, alimentée par des controverses multiples.

     L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre les freins et leviers du recours à la vaccination chez les HSH en France. Il porte plus spécifiquement sur les vaccinations contre l’hépatite A, l’hépatite B et les infections à PVH. Les objectifs secondaires sont : 1) d’estimer les couvertures vaccinales déclarées pour ces trois vaccins et, parmi les personnes non vaccinées, la prévalence de l’intention de se faire vacciner ; 2) d’estimer la prévalence de l’hésitation vaccinale (i.e., avoir déjà refusé, retardé ou accepté un vaccin tout en ayant des doutes sur cette vaccination) dans cette population, la part des personnes hésitant vis-à-vis des trois vaccins considérés dans cette étude, et les motifs de cette hésitation ; 3) d’étudier les facteurs associés au fait d’être vacciné (ou d’avoir l’intention de se faire vacciner) et à l’hésitation vaccinale liée spécifiquement à ces trois vaccins, en s’intéressant plus particulièrement : i) à certaines connaissances, croyances et perceptions (vis-à-vis des vaccins, de la prévention diversifiée du VIH…) ; ii) aux antécédents médicaux et aux pratiques sexuelles ; iii) aux facteurs liés au système et aux professionnels de santé ; iv) aux caractéristiques démographiques, économiques et sociales ; v) au niveau de confiance accordé aux autorités de santé et à la médecine conventionnelle et au degré d’implication des individus dans les décisions de santé.

     Ce projet sera mené par une équipe pluridisciplinaire incluant des chercheurs en santé publique, en sociologie et des experts de Santé publique France.

     Ce projet repose sur une méthodologie innovante associant 1) une enquête quantitative administrée sur support digital (sites de rencontre gay sur internet, réseaux sociaux…) auprès d’environ 15 000 à 18 000 personnes, selon le retour d’expérience de précédentes enquêtes de ce type ; 2) une enquête qualitative par entretiens individuels semi-directifs menés auprès d’une trentaine de personnes ayant répondu à l’enquête quantitative ; 3) un recueil de données issues des carnets de vaccination auprès d’environ 800 personnes ayant répondu à l’enquête quantitative, ceci afin d’estimer la qualité des données déclarées de comportement de vaccination ou non. Ce projet sera réalisé sur une période de 36 mois. La 1ère année sera consacrée à l’élaboration du questionnaire de l’enquête quantitative et des demandes d’autorisations, à la définition de la stratégie de diffusion du questionnaire et à la réalisation d’une enquête pilote auprès d’une trentaine de personnes. La 2ème année du projet sera consacrée à la collecte des données quantitatives et qualitatives et à la préparation des bases de données. La 3ème année sera consacrée à la réalisation des analyses statistiques, à l’analyse des entretiens qualitatifs et à la valorisation des résultats de l’enquête.

     Les résultats de ce projet devraient permettre d’avoir une meilleure connaissance et compréhension des comportements et des processus de décisions vis-à-vis de la vaccination contre les hépatites B et A et contre les PVH parmi les HSH en France. Ces résultats sont essentiels pour guider les décisions et les choix des pouvoirs publics, des professionnels de santé et des acteurs impliqués dans la prévention auprès de ce public, en matière de stratégies d’intervention et de contenu des actions afin de promouvoir et faciliter l’accès à ces vaccins en tenant compte des besoins et attentes des personnes.