Winning projects and candidates

L’intégration rétrovirale est catalysée par une structure oligomérique et dynamique appelée intasome, composée de l’intégrase et de l’ADN viral, associés à des partenaires viraux et cellulaires. L’association finale intasome/chromatine régit l’efficacité de l’intégration du génome viral. Par ailleurs, l’environnement chromatinien du site d’intégration proviral détermine l’expression des gènes viraux. Ainsi, il est crucial de mieux comprendre le processus engagé dans cette étape de la réplication virale pour développer de nouvelles thérapies antivirales originales, ou de nouvelles approches permettant de réorienter l’intégration vers des régions moins favorables de la chromatine.

Malgré les données structurales récemment acquises sur les intasomes rétroviraux, aucune structure de complexe formé entre l’intasome du VIH-1 et son substrat chromatinien n’est disponible contrairement à PFV. Nos données récentes indiquent qu’une raison probable de cet échec est liée à un ancrage différent de cet intasome sur la chromatine qui l’engagerait dans une structure spécifique encore inconnue.

L’originalité de notre projet est d’aborder ces questions encore obscures sur l’association entre l’intasome du VIH-1 et le site d’intégration sur la chromatine de l’hôte en visant à obtenir des informations inédites sur la structure fonctionnelle du nucléo-complexe impliqué dans l’interaction entre les génomes (viral et cellulaire) ainsi qu’à élucider la question du rôle de cofacteurs cellulaires dans ce processus. Le but principal est d’obtenir les premières structures à résolution atomique du complexe intasome/chromatine du VIH-1 validées fonctionnellement.

Dans ce projet, nous i) déterminerons le substrat de chromatine optimal pour l’intégration du VIH-1 en utilisant des tests d’intégration in vitro et des approches d’assemblage de la chromatine maîtrisés par l’équipe partenaire 2 (Parissi, MFP Bordeaux). ii) Le substrat nucléosomal optimal ainsi identifié sera ensuite caractérisé dans des approches biophysiques et structurales de cryo-microscopie (CryoEM) dans l’équipe coordinatrice 1 (Ruff, IGBMC, Strasbourg), experte du domaine, afin d’identifier les déterminants moléculaires de l’interaction intasome/nucléosome et les interfaces fonctionnelles intasome/nucléosome. iii) Ces interfaces seront ensuite validées fonctionnellement par mutagenèse dirigée de l’intégrase (IN) réalisée sur des vecteurs lentiviraux dérivés du VIH-1 afin de suivre leur rôle dans l’efficacité d’intégration et son ciblage vers les différentes régions chromatiniennes par des tests d’infectiosité et séquençage des sites d’intégration réalisés dans l’équipe partenaire 3 (Negroni, IBMC, Strasbourg). iv) L’impact des variations génétiques de l’IN sur ces interfaces sera étudié en comparant différentes formes circulantes et différents sous-types du VIH-1 afin d’obtenir des données sur l’évolution des souches virales ainsi que de prévoir les prochaines émergences de variants possibles (équipe 3). Enfin, v) les données de structure/fonction obtenues dans ce projet serviront de base à la sélection et à la conception rationnelle de nouveaux composés chimiques inhibiteurs ciblant ces interfaces intasome/nucléosome afin de bloquer et/ou de recibler l’intégration (équipes 1, 2 et 3).

Les objectifs de notre projet s’organisent en quatre principaux volets interconnectés qui pourront être développés en parallèle. Les données fonctionnelles viendront enrichir les approches biophysiques et structurales en permettant la sélection des meilleurs candidats pour ces analyses. Les données structurales acquises serviront pour réajuster les études fonctionnelles afin d’affiner nos résultats. L’ensemble de ces données servira de base pour le design de drogues ciblant spécifiquement les interfaces intasome/nucléosome fonctionnelles ainsi définies.

Notre projet permettra ainsi de mieux définir l’environnement chromatinien du site d’intégration dont dépend l’expression du génome viral, de mieux contrôler le ciblage des complexes d’intégration vers ces sites et ainsi définir de nouvelles voies de contrôle de l’intégration lentivirale et de la latence virale (stratégie block and lock).

Situation. L’Afrique, zone de haute endémie du virus de l’hépatite B (VHB), connaît une mortalité précoce par cirrhose ou cancer du foie. Sans intervention, le risque de transmission du VHB de la mère AgHBs+ à l’enfant (TME) est de l’ordre de 38% si la mère est AgHBe+ et de l’ordre de 5% si elle est AgHBe- selon une méta-analyse récente. Aussi la vaccination universelle des nouveaux nés (NN) dès la naissance a été recommandée par l’OMS. Cette mesure, appliquée en Asie, a permis de réduire la prévalence de l’AgHBs et l’incidence du cancer du foie. Au Cameroun, la prévalence de l’AgHBs est entre 5,4% et 25,3%. Pour prévenir la TME du VHB, le programme élargi de vaccination prévoit une valence hépatite B (PEV-HB) comprenant 3 injections aux 6, 10 et 14èmes semaines. Cependant, une forte réplication du VHB chez les mères expose les NN à un échec de ce schéma vaccinal. Avec le Groupe d’Etudes Moléculaires des Hépatites, nous avons financé en 2007 un programme de vaccination à la naissance des NN dans le district de Tokombéré. Sur 1276 femmes enceintes (FE), 20,3% étaient AgHBs+ dont 22,8% étaient AgHBe+ avec une charge virale moyenne de 7,5 ± 2,1 log UI/mL. Plus de 90% des NN ont été vaccinés à la naissance. En 2015, l’ANRS a financé l’étude 12303 afin d’évaluer l’efficacité de ce programme. Les résultats ont montré que chez les 607 couples mère-enfant étudiés, le taux de transmission du VHB était globalement de 6% et de 28% lorsque les mères étaient AgHBe+. Les facteurs de risque de transmission étaient entre autres la présence de l’AgHBe, une charge virale élevée chez les mères et des problèmes de respect des délais de vaccination.

Le but de l’étude interventionnelle proposée est de réduire la TME du VHB, en proposant aux FE à haut risque de transmission, un traitement par Ténofovir disoproxil (TDF) en plus de la vaccination à la naissance des NN, suivie du PEV-HB.

Problématique. Au regard du taux résiduel de transmission malgré la vaccination HB à la naissance, et en l’absence d’Ig anti HBs, il est important d’évaluer l’efficacité d’une TME du VHB des mères à haut risque de transmission, consistant à ajouter au schéma vaccinal actuel , un traitement antiviral. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’efficacité de cette intervention. Les objectifs secondaires sont d’évaluer sa faisabilité dans « la vraie vie ». Le coût-efficacité de cette intervention sera également évaluée par rapport à la situation où seule la vaccination est implémentée.

Méthodes. Après obtention du consentement des FE, l’AgHBs sera recherché à la 1ère consultation prénatale à l’aide d’un test rapide. En cas de positivité, l’AgHBe sera recherché ainsi que l’ADN du VHB à partir de prélèvements sur Dried Blood Spot (DBS). Les DBS seront acheminés au centre Pasteur du Cameroun (CPC) et conservés à -20°C. Un traitement antiviral par TDF sera proposé aux FE AgHBe+ ou ayant une CV>200 000 UI/mL à partir de leur 6ème mois de grossesse et jusqu’à un mois après l’accouchement. Les enfants nés des mères ayant bénéficié du traitement seront testés pour l’AgHBs entre 10 et 14 mois. Chez les enfants identifiés AgHBs+, une caractérisation de l’ADN du VHB (recherche de mutants) sera réalisée. Pour un risque alpha de 5%, une puissance de 85% et une différence d’efficacité de 30% entre l’association TDF-vaccination à la naissance et la vaccination seule (situation actuelle évaluée dans le projet ANRS 12303), l’inclusion de 120 FE AgHBe+ ou ayant une CV >200 000 UI/mL permettra de démontrer l’efficacité de l’ajout du TDF au schéma actuel de vaccination. Le critère principal de jugement sera la proportion d’enfants AgHBs+ entre 10 et 14 mois.

Résultats attendus. L’étude fournira des informations importantes sur l’efficacité du traitement préemptif sur la TME du VHB dans la vraie vie et dans le contexte spécifique de l’Afrique Centrale ainsi que sur la faisabilité de cette intervention, la compréhension de ses causes échecs et son coût-efficacité. Ces informations seront particulièrement utiles pour l’élaboration des politiques de lutte contre la transmission materno-fœtale du VHB.

l est désormais bien établi que la communication bidirectionnelle entre les systèmes immunitaire et nerveux joue un rôle clé dans l'initiation et le développement des réponses de l'hôte aux infections et autres signaux de danger. Le rôle du système nerveux dans la réponse de l'hôte à la tuberculose (TB) n'a pas encore été élucidé. Nous avons récemment fait l'observation que des cellules b3-tubuline (TUBB3)+ (un marqueur pan-neuronal) sont présentes dans les poumons de souris infectées par Mycobacterium tuberculosis (Mtb) à proximité des granulomes. Leur présence corrèle avec l'incidence de l'inflammation tissulaire. Grâce à un contrat d'initiation (ANRS CI ECTZ242543), nous savons maintenant que des cellules neuronales TUBB3+ sont également présentes dans les granulomes pulmonaires chez les primates non humains infectés par Mtb et chez les patients atteints de TB. De plus, nous pensons que ces cellules sont d'origine nerveuse sympathique autonome en raison de la colocalisation, au moins en partie, avec la tyrosine hydroxylase (TH), un marqueur des neurones sympathiques. Ces cellules neuronales TUBB3+ modifient-elles la progression de la TB ? Ou est-ce que la présence de ces cellules dans les lésions tuberculeuses sont le reflet d'un rôle physio-pathologique inexploré et insoupçonné du système nerveux sympathique autonome dans cette infection pulmonaire ? Ces questions nous encouragent aujourd’hui à poursuivre nos recherches sur ce sujet passionnant. Ainsi, le projet proposé visera à (i) caractériser ces nouvelles neuronales pulmonaires TUBB3+, notamment in situ dans les granulomes tuberculeux chez les souris infectées, grâce à différentes approches de pointe ; (ii) préciser l'origine, le recrutement et le processus de différenciation de ces cellules dans le poumon au cours de l'infection, en se concentrant sur deux hypothèses basées sur la manière dont le système nerveux sympathique infiltre les tumeurs solides, à savoir la neurogenèse et l'axonogenèse ; (iii) étudier les conséquences de la déplétion ciblée, par des approches chimiques et génétiques, des cellules TUBB3+ sur la dynamique des granulomes, la réponse immunitaire antimycobactérienne et la pathogénèse de la TB dans le modèle murin ; et (iv) établir une corrélation entre la présence de cellules neuronales TUBB3+ et la sévérité de la maladie dans des échantillons de poumons provenant de primates non humains infectés par Mtb et de patients tuberculeux. Ces résultats pourraient ouvrir une voie de recherche entièrement nouvelle dans le domaine de la neuroimmunologie de la TB, un domaine largement inexploré à ce jour.