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Objectif

Cette investigation vise à évaluer la présence de Mycobacterium tuberculosis dans l’air environnant des chambres de patients hospitalisés pour tuberculose pulmonaire. Cette étude exploratoire permettra d’obtenir des données en vie réelle sur la contamination aérienne, afin de mieux comprendre les risques de transmission respiratoire et d’adapter les mesures de précaution en milieu hospitalier.

Situation du sujet

La tuberculose pulmonaire est une infection transmissible par voie respiratoire, causée par M. tuberculosis. Selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS), en 2023, 10,8 millions de personnes ont développé une tuberculose, et 1,25 million en sont décédées. La transmission se fait par inhalation de particules contaminées en suspension dans l’air, émises par un patient infecté lors de la toux, de la parole ou d’un éternuement. Toutefois, la quantification de la présence de M. tuberculosis dans l’environnement aérien des patients hospitalisés n’a jamais été réalisée avec des méthodes de quantification standardisées.

Problématique

Les recommandations actuelles en matière de prévention reposent principalement sur l’examen microscopique des expectorations des patients pour évaluer leur contagiosité. Il a été démontré que des patients avec examen direct des expectorations négatif mais une culture positive peuvent également transmettre la maladie. L’absence de données précises sur la quantification de M. tuberculosis dans l’air hospitalier limite l’optimisation des précautions complémentaires respiratoires. Il semble donc nécessaire d’établir une méthodologie fiable pour détecter et quantifier la présence de M. tuberculosis dans l’environnement hospitalier afin d’affiner les stratégies de prévention du risque infectieux.

Méthodes

Cette étude exploratoire sera réalisée dans le service des maladies infectieuses et tropicales de l’hôpital Saint-Louis (AP-HP, Paris). L’échantillonnage de l’air sera effectué à l’aide d’un dispositif AerosolSense™ (ThermoFisher Scientific™), installé dans la chambre des patients hospitalisés pour une tuberculose pulmonaire confirmée. L’appareil collectera les particules en suspension pendant 4 heures, permettant l’analyse de l’air ambiant.

Les échantillons collectés seront ensuite analysés par :

• Techniques moléculaires (PCR qualitative GeneXpert MTB Rif Ultra et PCR quantitative IS1081) pour détecter et quantifier l’ADN de tuberculosis.
• Culture en milieux liquide et solide afin d’évaluer la viabilité des bactéries prélevées.
• Examen microscopique pour la détection des bacilles acido-alcoolo-résistants.

Ces résultats seront corrélés avec des données cliniques (intensité de la toux, charge bactérienne des expectorations) et environnementales (ventilation de la chambre, mesure du CO₂) afin d’identifier les facteurs influençant la contamination aérienne.

Résultats Attendus

Cette étude permettra d’obtenir des données originale quantitative sur la présence de M. tuberculosis dans l’air des chambres de patients hospitalisés pour prise en charge d’une tuberculose pulmonaire. Elle fournira une preuve de concept démontrant la faisabilité de la détection aérienne du bacille tuberculeux. Cette étude pourrait ouvrir la voie à une recherche plus large sur l’évolution de la contamination par voie respiratoire au fil du temps et sous traitement, contribuant ainsi à renforcer la lutte contre la transmission en milieu de soins de la tuberculose.

L’infection par le VIH-1 requière l’intégration du génome viral dans des conditions permettant une transcription optimale. Le site d’intégration, l’association du complexe d’intégration à l’ADN nucléosomal ainsi que l’environnement chromatinien entourant le site d’intégration vont définir le devenir du provirus et son état transcrit ou latent. Ces dernières années, de nombreuses observations suggèrent un lien entre le processus d’intégration et les machineries transcriptionnelles cellulaires. L’interaction entre le domaine carboxy-terminal (CTD) de l’intégrase (IN) et l’ARN génomique viral a été notamment décrite. Or, des mutations au niveau des résidus du CTD sujets à acétylation et impliqués dans cette interaction présentent des effets sur la transcription des gènes viraux intégrés et non sur l’intégration tout en affectant la stabilité et la présence de l’enzyme sur le site après intégration. De plus, l’interaction entre ces résidus du CTD de l’IN et l’élément ARN viral TAR influence l’interaction in vitro entre cet élément et la protéine virale TAT et, ainsi, pourrait affecter la transactivation des gènes viraux soulignant un lien direct entre l’IN et la transcription. Les multiples fonctions du CTD de l’IN suggèrent que ce domaine constituerait un pivot dans les processus intégratifs et post-intégratifs et participerait, notamment, à la transactivation des gènes viraux médiée par la protéine TAT.

Alors que les étapes pré-intégratives et intégratives sont bien documentées l’ensemble de ces évènements post-intégratifs n’est pas connu. Le devenir du complexe d’intégration après l’intégration, le mécanisme et la chronologie de sa dissociation du site et les facteurs de l’hôte impliqués restent inconnus. Notre projet visera à dévoiler l’ensemble de ces évènements post- intégratifs et mettre à jour le rôle pressenti de l’IN dans ces événements. L’objectif principal de notre projet sera donc de dévoiler les liens fonctionnels existant entre intégration et transcription et, en particulier, le rôle du domaine CTD de l’IN en définissant comment l’intégration peut influencer la transcription des gènes viraux intégrés et comment la machinerie transcriptionnelle rencontrée par le complexe d’intégration sur le site d’insertion peut moduler le processus d’intégration. Nous répondrons aux questions suivantes : i) l’IN influence-t-elle la transcription des gènes intégrés, ii) la machinerie transcriptionnelle est-elle requise pour une bonne intégration ou une bonne réparation du site et notamment est-ce que l’ARN TAR transcrit sur le site est impliqué dans la dissociation du complexe post-intégratif, iii) quels sont les facteurs associés spécifiquement au complexe post-intégratif dans les régions transcriptionnelles ciblées par le VIH-1, iv) comment interférer avec ces évènements post-intégratifs impliquant l’IN et les ARN en identifiant les premiers composés chimiques ciblant ces phases précoces post intégratives.

Les données préliminaires obtenus dans notre équipe consolident fortement l’hypothèse d’implication des ARN et de TAR dans les étapes de désassemblage post-intégratives aboutissant à la libération du site. Les mécanismes moléculaires impliqués, le rôle de l’acétylation dans la régulation de ce processus, la démonstration de ce mécanisme dans un contexte cellulaire et l’identification des possibles autres partenaires cellulaires requis dans ce processus constitue les objectifs de notre projet. Pour cela nous i) confirmerons l’importance des processus de transcription pour l’intégration du VIH-1, ii) étudierons le processus moléculaire de dissociation du complexe d’intégration par les ARN et TAR par des approches biochimiques et biophysiques, iii) identifierons les facteurs cellulaires associés à la machinerie transcriptionnelle qui pourraient interagir avec le complexe post-intégratif et iv) sélectionnerons les premiers composés ciblant les phases post-intégratives impliquant l’IN et l’ARN.

L’intégration du génome du rétroviral dans la cellule infectée est une étape clé du cycle réplicatif permettant de pérenniser l’infection. L’interaction fonctionnelle entre l’intasome (complexe formé entre l’ADN viral et l’intégrase, IN) et le nucléosome, complexe final siège de l’intégration, constitue le premier point de contact entre le génome viral et cellulaire. Cette association représente, ainsi, une plateforme d’échanges moléculaires entre le virus et l’hôte. Notre projet vise par une combinaison d’approches biochimiques, fonctionnelles et cellulaires, à définir les interfaces entre le complexe d’intégration du VIH-1 et son substrat cellulaire nucléosomal afin de comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu au sein de cette plateforme d’échanges.

Dans ce travail, nous i) caractériserons les interfaces physiques et fonctionnelles entre l’intasome et le nucléosome humain dans un contexte de nucléosome isolé mais aussi dans le cadre de differentes structures chromatiniennes ; ii) déterminerons comment ces interfaces sont régulées par les facteurs cellulaires précédemment identifiés (cofacteurs de l’IN, structure et remodelage de la chromatine, machineries associées à la transcription) ; iii) développerons la première approche thérapeutique ciblant spécifiquement les interfaces intasome/nucleosome par la technique Alphascreen.

Ce projet permettra notamment de déterminer comment cette association intasome/nucléosome peut affecter le choix du site d’insertion de l’ADN viral, l’efficacité d’intégration et de réplication du virus ainsi que le développement d’approches thérapeutiques innovantes. Notre travail constituera ainsi la première caractérisation d’envergure du complexe intasome/nucléosome, intermédiaire central de l’intégration et de la réplication virale.

Contexte: Bien que la prophylaxie pré-exposition (PrEP) soit très efficace pour la prévention de la transmission muqueuse du VIH-1, la PrEP n’est ni optimale ni exempte de complications. L’acquisition muqueuse du VIH-1 est accrue chez les patients co-infectés par le virus herpès simplex (VHS). La compréhension des mécanismes de synergie directe entre le VIH-1 et le VHS pendant la co-infection est une condition préalable à la mise au point de nouveaux microbicides préventifs. Nous avons déjà découvert un mécanisme limitant les infections virales, à savoir une interaction neuro-immunitaire entre le peptide muqueux  « calcitonine gene-related peptide » (CGRP) et les cellules de Langerhans (LC). Par conséquent, les neurones périphériques sensoriels de la douleur (appelés nocicepteurs) qui innervent toutes les épithélium muqueux, secrètent du CGRP et sont en contact direct avec les LC. Ce CGRP interagit ensuite avec les LC par l’intermédiaire de son récepteur spécifique et module une multitude d’événements cellulaires et moléculaires. Ceux-ci entraînent une inhibition significative de la transinfection des lymphocytes T CD4+  par le VIH-1 induite par les LC. Plus récemment, avec le financement de l’ANRS, nous avons montré que le CGRP inhibe également l’infection des LC par le VHS. En particulier, lors de son invasion muqueuse, le VHS cible naturellement les cellules épithéliales et les nocicepteurs. 

Hypothèse de travail: Comme le VHS pourrait interférer avec la sécrétion de CGRP par les nocicepteurs, nous supposons qu’un mécanisme non reconnu par lequel le VHS augmente la transmission du VIH-1 implique une réduction de la sécrétion muqueuse de CGRP. Nous supposons en outre que le renforcement des effets bénéfiques du CGRP serait obtenu efficacement en utilisant des agonistes du récepteur CGRP (CGRP-R).

Objectifs: Nous proposons d’étudier les activités antivirales du CGRP et des agonistes du CGRP-R selon deux axes complémentaires: i) Axe fondamental – établir de nouveaux modèles expérimentaux muqueux neuro-immuno compétents, en utilisant la technologie de la microfluidique et incluant des LC, des cellules épithéliales et des nocicepteurs ; ii) Axe translationnel – caractériser la pharmacologie et fonctions antivirales de nos agonistes CGRP-R, que nous avons récemment développés et déjà trouvé d’exercer des activités antivirales.

Stratégie: Nous utiliserons les modèles « mucosa-on-chip » pour décrire la propagation muqueuse du VHS et déterminer si le VHS induit des lésions axonales et altère la sécrétion de CGRP, facilitant ainsi l’acquisition du VIH-1. À noter, le rôle des cellules épithéliales et des lymphocytes T CD4 + sera également largement étudié, comme décrit dans le projet PhD associé. Nous étudierons également nos agonistes CGRP-R nouvellement développés. Nous évaluerons leur capacité à activer les voies de transduction du signal liées au CGRP, à induire la sécrétion de CGRP et à inhiber la trans-infection par le VIH-, l’infection par le HSV et la co-infection VIH-1 / HSV in-vitro et ex-vivo. Nous définirons aussi leur protection cardiovasculaire et leur potentiel anti-VHS in-vivo.

Originalité: Nous combinerons des cellules neuronales, épithéliales et immunitaires dans des dispositifs microfluidiques, pour imiter l’architecture et la fonction de la muqueuse neuro-immune, alors que les modèles microfluidiques actuels ignorent largement la composante immunitaire. De plus, nos agonistes non peptidiques de CGRP-R sont les seuls développés à ce jour. Enfin, nous exploiterons le dialogue bidirectionnel entre les systèmes nerveux et immunitaire, en renforçant un mécanisme de protection antiviral endogène médié par le CGRP, représentant la première tentative de développement de stratégies neuro-immunes pour lutter contre la co-infection VIH-1/VHS.

Perspectives: Dans l’ensemble, nos études originales qui combinent des méthodologies de science fondamentales et translationnelles, ont pour objectif pratique de développer des stratégies neuro-immunitaire basées sur le CGRP afin de lutter contre le VIH-1 et d’autres infections muqueuses.