Winning projects and candidates

Le virus du Nil occidental (WNV) est un orthoflavivirus responsable de maladies neurologiques et de décès chez l'homme. Le virus est transmis entre les oiseaux, qui servent d'hôtes amplificateurs, par la piqûre de moustiques infectés et, accessoirement, l'homme et d'autres mammifères peuvent être infectés. En raison principalement des changements climatiques, son aire de répartition géographique s'étend à de nouvelles régions, dont l'Europe.

L'objectif de notre projet est de fournir de nouvelles informations sur les mécanismes moléculaires régulant l'infection par le WNV dans les cellules humaines et aviaires, dans le but de mieux comprendre les interactions entre le virus et ses hôtes, et ainsi d'accélérer la découverte de nouveaux composés pour le traitement de la maladie.

Nous proposons de caractériser dans un premier temps les interactions entre les 2 enzymes du WNV, qui sont des protéines virales clés et représentent donc le talon d'Achille du virus, et les protéines cellulaires en utilisant des stratégies de purification d'affinité et de spectrométrie de masse. Les 2 protéines virales (NS2B3 et NS5) seront exprimées dans des cellules humaines et aviaires. Nous comparerons la liste des partenaires cellulaires humains et aviaires et sélectionnerons des partenaires communs aux deux hôtes. Nous choisirons ~15 candidats avec un score de confiance élevé par protéine virale et pour des recherches plus approfondies. Des criblages fonctionnels seront ensuite réalisés pour déterminer si l'expression réduite de ces candidats affecte la réplication virale dans les cellules humaines et aviaires. La réplication virale sera estimée à l'aide d'un panel de tests virologiques. Nous sélectionnerons ensuite les 2 ou 3 candidats qui sont nécessaires à la réplication du virus pour réaliser des études mécanistiques approfondies. Nous utiliserons une combinaison de tests de microscopie, de biologie cellulaire, de biochimie, de protéomique et de virologie moléculaire pour déterminer par quels mécanismes les protéines candidates modulent la réplication du WNV dans plusieurs modèles cellulaires, y compris des cellules primaires humaines. Enfin, nous utiliserons Alphafold pour modéliser l'interaction entre les protéines virales et les partenaires cellulaires sélectionnés. Nous utiliserons ces modèles pour mener des études computationnelles et exploiter des bases de données chimiques et ainsi identifier les molécules qui bloquent ces interactions dans les cellules humaines.

Notre projet permettra de révéler l’ensemble complet des interactions moléculaires entre deux enzymes clés du WNV et des protéines humaines et aviaires. Il permettra de caractériser les voies clés de ces hôtes qui servent de facteurs proviraux critiques et conservés. Enfin, il permettra d'identifier des composés qui perturbent la réplication virale et pourra conduire au développement de nouvelles interventions thérapeutiques.

Le projet de thèse proposé, iPAVE, vise à approfondir la compréhension des dynamiques épidémiologiques et des schémas de transmission des principales infections respiratoires aiguës (IRA) – grippe, VRS et SARS-CoV-2 – en France. En utilisant l’ensemble des données génomiques à large échelle des réseaux de surveillance comme RELAB et Sentinelles et des méthodes phylodynamiques actuelles, le projet cherche à répondre à deux questions principales : i) Comment les méthodes phylodynamiques actuelles peuvent-elles être étendues pour traiter des ensembles de données de surveillance moléculaire à grande échelle et en quasi temps réel ? et ii) Quels sont les principaux facteurs responsables de la propagation des virus respiratoires en circulation, et comment ces facteurs varient-ils selon les différentes populations, régions géographiques et périodes ?

Bien que les méthodes phylodynamiques, développées au cours des deux dernières décennies, aient été essentielles pour suivre les épidémies à l'aide de données moléculaires, elles rencontrent actuellement des difficultés avec les grands ensembles de données et l'analyse en temps réel. Pour surmonter ces limitations, iPAVE développera et intégrera des modèles phylodynamiques avancés dans une plateforme de surveillance, permettant un suivi précis de l'évolution et de la propagation virale. Le projet exploitera l'ensemble de données RELAB, qui devrait générer environ 10 000 séquences par an, offrant une vision détaillée des IRAs en France. Le projet est divisé en trois tâches principales : i) la validation et la préparation des données, ii) l'extension et l'évaluation comparative des méthodes phylodynamiques, et iii) l'application et l'analyse à grande échelle. Les résultats attendus incluent une compréhension détaillée des dynamiques épidémiologiques virales et l'établissement d'un benchmark pour les techniques phylodynamiques actuelles, applicables à la surveillance mondiale.

Le projet sera mené au sein de l'unité "Mécanismes moléculaires de la multiplication des Pneumovirus" en étroite collaboration avec le Centre National de Référence des Virus Respiratoires à l'Institut Pasteur, en tirant parti de leur expertise et de leur infrastructure informatique haute performance. Il bénéficiera également de la collaboration avec le groupe EID à l'Institut Pasteur. Cette recherche est susceptible d'apporter des contributions significatives à la surveillance et à la gestion mondiales des virus respiratoires et autres pathogènes.

Les virus respiratoires peuvent se propager rapidement et provoquer des épidémies mondiales, comme illustré par la pandémie de COVID-19. Les coronavirus sont largement présents chez les animaux et franchissent régulièrement la barrière d’espèces. Au cours des 25 dernières années, trois coronavirus pathogènes ont ainsi émergé chez l’homme : le SARS-CoV en 2003, le MERS-CoV en 2012 et le SARS-CoV-2 en 2019, à l'origine de la COVID-19. De plus, quatre autres coronavirus humains sont responsables d’épidémies saisonnières chaque hiver. Comme tous les virus, les coronavirus sont des parasites intracellulaires obligatoires et dépendent de leurs cellules hôtes pour se répliquer. En réponse, celles-ci ont développé des mécanismes de défense, dont des protéines antivirales exprimées constitutivement ou induites lors de l'infection par l’interféron. Un enjeu majeur en virologie est d’identifier les gènes cellulaires régulant positivement ou négativement la réplication virale. Malgré les avancées récentes dues aux outils de cribles génétiques à grande échelle tels que CRISPR, nos connaissances sur les interactions hôtes/pathogènes restent limitées. En effet, la plupart des cribles génétiques ont été réalisés dans des lignées cellulaires cancéreuses, qui ne reproduisent pas fidèlement l'environnement naturel ni le microenvironnement intracellulaire des cellules cibles humaines de ces virus et présentent des biais inhérents à leur origine tumorale. Des études ont montré que les gènes identifiés dans ces cribles varient fortement en fonction du modèle cellulaire utilisé, soulignant la nécessité d’études dans un contexte cellulaire pertinent.

Ce projet de thèse vise à identifier le paysage des gènes humains régulant la réplication des coronavirus dans un modèle primaire de choix, des épithélia respiratoires primaires humains (human airway epithelia, HAE) génétiquement modifiés et cultivés à l’interface air-liquide (ALI). Ce modèle 3D contient les principaux types cellulaires épithéliaux retrouvés in vivo (cellules basales, ciliées, et sécrétrices) et reproduit l'architecture pseudostratifiée et les fonctions mucociliaires des voies respiratoires. L’équipe a mis au point des méthodes CRISPR pour éditer efficacement les cellules progénitrices de l’épithélium respiratoire humain (les cellules basales) et ainsi obtenir des HAE-ALI génétiquement modifiés, différenciés et fonctionnels. Le projet de thèse s’articulera autour de trois axes principaux. Le premier axe consistera à réaliser des cribles CRISPR rationalisés, au format individuel, dans des cultures primaires d’HAE-ALI pour évaluer le rôle régulateur de gènes humains préalablement identifiés comme jouant un rôle dans la réplication des coronavirus dans des lignées cancéreuses. Le deuxième axe reposera sur l’analyse de données de séquençage d’ARN à l’échelle de la cellule unique (scRNA-seq) afin d’établir une liste de gènes spécifiquement exprimés dans les cultures primaires HAE-ALI. Le rôle de gènes candidats sélectionnés sur la réplication des coronavirus sera ensuite évalué, comme dans le premier axe. Enfin, le troisième axe visera à élucider les mécanismes moléculaires d’action de nouveaux gènes de choix via une combinaison d’approches dont des analyses structure-fonction, de l’interactomique et de la microscopie.

En utilisant des technologies avancées de CRISPR dans des modèles cellulaires primaires physiologiquement pertinents, ce projet de thèse améliorera notre compréhension des interactions entre les coronavirus et leurs véritables cibles cellulaires chez l’homme. Ces connaissances pourraient ouvrir la voie à des stratégies antivirales ciblant des facteurs de l’hôte. Ce projet s’inscrit donc pleinement dans les objectifs de cet appel à projets, qui vise à répondre aux enjeux des maladies infectieuses émergentes et à renforcer notre capacité de réponse face à de futures pandémies.

Le projet ESCAPE vise à redéfinir les stratégies de réponse aux épidémies dans les pays à revenu faible et intermédiaire (PRFI) en identifiant et en exploitant des clusters spatiaux épidémiologiquement significatifs issus des données de mobilité de la population. Centré sur l’épidémie d’Ebola de 2014–2015 en Guinée, ESCAPE exploitera des données de téléphonie mobile anonymisées provenant d’environ 9 millions d’utilisateurs, ainsi que des rapports épidémiologiques détaillés au niveau préfectoral, afin de mieux aligner les stratégies d’intervention sur les dynamiques réelles de transmission. Le projet répond à une limite majeure des interventions de santé publique traditionnelles: leur ancrage sur des frontières administratives statiques, qui ne reflètent pas nécessairement les schémas de propagation des maladies façonnés par les mouvements humains. ESCAPE extraira des clusters spatiaux guidés par la mobilité et évaluera leur pertinence en tant qu’unités dynamiques, fondées sur les données, pour des actions de santé publique ciblées. Le projet poursuit deux objectifs principaux: (1) identifier des clusters de mobilité à l’aide de la science des réseaux appliquée aux données de téléphonie mobile; (2) simuler l’impact des interventions ciblant ces clusters à l’aide de modèles épidémiques de type métapopulation. En comparant ces résultats avec les stratégies historiquement fondées sur les frontières administratives, ESCAPE quantifiera les gains en matière de réduction de la propagation épidémique et de l’impact sociétal. Ce projet propose ainsi une nouvelle solution de rupture pour la préparation aux épidémies dans des contextes à ressources limitées, avec des implications potentielles pour la gestion d'autres maladies infectieuses sensibles à la mobilité.

Lors de l'assemblage des particules virales du VIH-1 dans les cellules infectées, deux copies de l'ARN génomique non épissé sont sélectionnées parmi un mélange complexe d'ARN cellulaires et viraux épissés pour être empaquetées dans les virions. Cette spécificité est déterminée par des signaux d’empaquetage en cis situés dans la région 5′ non traduite (5′UTR) de l’ARN viral, qui sont reconnus par la polyprotéine Pr55Gag. Ces signaux sont non seulement essentiels à la réplication virale, mais également cruciaux pour l'optimisation des vecteurs lentiviraux utilisés en thérapie génique, dans le développement de vaccins et pour les cribles CRISPR à l’échelle du génome. Par ailleurs, cibler ces éléments ARN représente une stratégie antivirale prometteuse, notamment face à la capacité du VIH-1 à développer rapidement des résistances aux traitements existants.

Bien que leur rôle soit fondamental, les mécanismes moléculaires régissant l’empaquetage du génome du VIH-1 restent mal compris. Nos travaux récents ont révélé de nouvelles interactions inter-domaines au sein de la région 5′UTR du VIH-1, qui régulent dynamiquement la structure de l’ARN, la dimérisation du génome et la reconnaissance par Pr55Gag. Ces éléments régulateurs sont influencés par la liaison de l’ARNt de l’hôte et par des processus de maturation de l’ARN tels que l’épissage, suggérant un rôle plus large dans la réplication virale.

Nous émettons l’hypothèse que ces interactions inter-domaines nouvellement identifiées couplent l’empaquetage du génome à d’autres étapes du cycle de vie du VIH-1 via la régulation dynamique de la structure de l’ARN.

L’objectif de ce projet est de disséquer trois mécanismes régulateurs basés sur l’ARN qui contrôlent la sélection et la réplication du génome du VIH-1 :

1. Commutateurs structuraux de l’ARN parmi les différentes souches du VIH-1 – Identifier et comparer les interactions inter-domaines (ex. PBS–SL1, polyA–SL1) impliquées dans la dimérisation et l’empaquetage du génome.
2. Rôle de la liaison de l’ARNt dans la sélection du génome – Étudier comment l’assemblage de l’ARNtLys3 sur le PBS influence la conformation de l’ARN, la dimérisation, l’empaquetage du génome et la transcription inverse.
3. Base structurelle de l’exclusion des ARN viraux épissés – Déterminer comment certaines structures alternatives des ARN viraux épissés empêchent leur encapsidation dans les virions.

En éclaircissant ces mécanismes régulateurs, cette étude apportera des connaissances fondamentales sur l’empaquetage du génome du VIH-1, avec des applications directes dans l’optimisation des vecteurs lentiviraux et le développement de nouvelles stratégies antivirales ciblant la réplication virale. De plus, ce projet fournira la première preuve de concept que la structure de l’ARN peut être une cible thérapeutique viable, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives pour des interventions antivirales basées sur la modulation de l’ARN.