Winning projects and candidates

l est désormais bien établi que la communication bidirectionnelle entre les systèmes immunitaire et nerveux joue un rôle clé dans l'initiation et le développement des réponses de l'hôte aux infections et autres signaux de danger. Le rôle du système nerveux dans la réponse de l'hôte à la tuberculose (TB) n'a pas encore été élucidé. Nous avons récemment fait l'observation que des cellules b3-tubuline (TUBB3)+ (un marqueur pan-neuronal) sont présentes dans les poumons de souris infectées par Mycobacterium tuberculosis (Mtb) à proximité des granulomes. Leur présence corrèle avec l'incidence de l'inflammation tissulaire. Grâce à un contrat d'initiation (ANRS CI ECTZ242543), nous savons maintenant que des cellules neuronales TUBB3+ sont également présentes dans les granulomes pulmonaires chez les primates non humains infectés par Mtb et chez les patients atteints de TB. De plus, nous pensons que ces cellules sont d'origine nerveuse sympathique autonome en raison de la colocalisation, au moins en partie, avec la tyrosine hydroxylase (TH), un marqueur des neurones sympathiques. Ces cellules neuronales TUBB3+ modifient-elles la progression de la TB ? Ou est-ce que la présence de ces cellules dans les lésions tuberculeuses sont le reflet d'un rôle physio-pathologique inexploré et insoupçonné du système nerveux sympathique autonome dans cette infection pulmonaire ? Ces questions nous encouragent aujourd’hui à poursuivre nos recherches sur ce sujet passionnant. Ainsi, le projet proposé visera à (i) caractériser ces nouvelles neuronales pulmonaires TUBB3+, notamment in situ dans les granulomes tuberculeux chez les souris infectées, grâce à différentes approches de pointe ; (ii) préciser l'origine, le recrutement et le processus de différenciation de ces cellules dans le poumon au cours de l'infection, en se concentrant sur deux hypothèses basées sur la manière dont le système nerveux sympathique infiltre les tumeurs solides, à savoir la neurogenèse et l'axonogenèse ; (iii) étudier les conséquences de la déplétion ciblée, par des approches chimiques et génétiques, des cellules TUBB3+ sur la dynamique des granulomes, la réponse immunitaire antimycobactérienne et la pathogénèse de la TB dans le modèle murin ; et (iv) établir une corrélation entre la présence de cellules neuronales TUBB3+ et la sévérité de la maladie dans des échantillons de poumons provenant de primates non humains infectés par Mtb et de patients tuberculeux. Ces résultats pourraient ouvrir une voie de recherche entièrement nouvelle dans le domaine de la neuroimmunologie de la TB, un domaine largement inexploré à ce jour.

Parmi les personnes vivant avec le VIH (PVVIH), un groupe rare de personnes (<1%) contrôlent spontanément la réplication virale au long cours sans traitement antirétroviral (TARV) : les HIV controllers (HIC). Ces PVVIH ont un taux d’ADN viral très bas, et la connaissance des mécanismes de contrôle immunologique est importante pour l’établissement de stratégies thérapeutiques innovantes. Parmi les caractéristiques des HIC, nous avons observé que les femmes sont plus représentées, tant dans la cohorte française de l’ANRS (CODEX) que dans d’autres groupes. L’impact de cette prévalence plus importante de femmes sur les mécanismes de contrôle du VIH n’est pas déterminé.

La réponse immunitaire innée joue un rôle important dans le contrôle de la réplication virale dès la primo-infection. La production d’Interféron (IFN) de type I, notamment l’IFNα, en est un des reflets. Il est principalement produit par les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) en réponse à l’activation des motifs de reconnaissance antigéniques (PRR) comme le TLR7. L’IFNα joue cependant un rôle complexe, dépendant de la temporalité de sa production : en primo-infection, un défaut de réponse IFNα est associé à un moindre contrôle antiviral, mais en phase chronique, sa persistance est associée à l’activation immunitaire persistante. La modulation de la voie des IFN fait partie des pistes stratégiques dans une optique de réduction des réservoirs.

Le rôle du sexe biologique est important dans la régulation de la voie des IFN. Les pDC des femmes expriment des taux de la protéine TLR7 (liée au chromosome X) plus importants que les hommes et ont des réponses fonctionnelles différentes aux antigènes viraux. Certains polymorphismes de TLR7, dont le rs179001 (c.32A>T), ont été décrits comme étant fonctionnels mais associés à une moindre production d’IFNα en réponse à la stimulation TLR7. Ce polymorphisme a été étudié dans le contexte de l’infection par le VIH par les équipes impliquées dans ce projet, montrant que l’expression des SNP c.32A/T ou T/T est associée une charge virale (ADN/ARN) diminuée et un taux sérique IP-10 plus bas chez les femmes de la cohorte ANRS PRIMO. Les liens entre ces réponses immunitaires chez les femmes et le contrôle du réservoir viral, ainsi que l’activation immunitaire, restent à explorer, la majorité des études publiées ayant été effectuée dans le contexte de l’infection par le VIH sous TARV.

Dans ce projet, l’hypothèse de travail est de déterminer le rôle bénéfique ou délétère de la réponse IFNα dans la dynamique du réservoir du VIH-1 en étudiant les femmes de la cohorte CODEX, contrôlant spontanément la réplication virale sans TARV. Nous prévoyons d’étudier la prévalence des polymorphismes de TLR7 (rs179008 et rs3853839) et de CXorf21 (rs887369) à partir des culots secs disponibles de la cohorte CODEX (n=300). Après cette étape de génotypage, une analyse fonctionnelle de stimulation des pDC par agoniste de TLR7 (CL097) afin de mesurer la fréquence des pDCs IFNa+TNFa+ en cytométrie en flux par marquage intracellulaire sera effectuée. Cette manipulation permettra d’évaluer chez 40 femmes HIC l’impact du polymorphisme AA (n=20) vs AT (n=20) sur la production d’IFNa et de TNFa. Enfin, nous analyserons les liens entre ces polymorphismes et les caractéristiques des PVVIH de la cohorte ANRS CODEX (statut « indetectable » ou « blipper », évolution des taux de LT CD4, du ratio CD4/CD8, de la charge virale ARN ultra-sensible et de l’ADN VIH/PBMC, ainsi que des paramètres d’activation immunitaire disponibles dans les données de suivi).

Nous espérons que cette étude sur 12 mois apportera des éléments importants dans la réponse IFNα des pDC des HIC. En fonction des résultats obtenus, nous envisageons une étude approfondie afin d’analyser fonctionnellement les réponses IFNa de l’ensemble des cellules immunitaires en lien avec l’activation immunitaire et son évolution au cours du temps, pour déterminer les facteurs associés aux risques de perte de contrôle immuno-virologique ou la survenue de comorbidités inflammatoires.

Le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre la tuberculose passe par une compréhension plus approfondie de la biologie de Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agent de la tuberculose humaine. Mtb possède une enveloppe cellulaire atypique comportant deux membranes : une membrane interne et une membrane externe appelée mycomembrane. La mycomembrane, principalement composée de glycolipides, joue un rôle clé dans les interactions hôte-pathogène et la résistance intrinsèque de Mtb aux antibiotiques. De façon notable cette structure est la cible de plusieurs antituberculeux. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans son assemblage pourrait donc conduire à l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. A ce jour, les mécanismes associés au transport des lipides de la mycomembrane à travers l’enveloppe cellulaire depuis le compartiment cytoplasmique où ils sont synthétisés, restent très mal caractérisés. Ce projet vise à combler cette lacune en apportant des informations sur la composition et l'organisation de la machinerie moléculaire impliquée dans le transport de ces lipides chez Mtb.

 Il a été montré qu’une famille de transporteurs appelés MmpL (Mycobacterial membrane protein Large) joue un rôle clé dans le transfert des lipides de la mycomembrane à travers la membrane plasmique. Nous faisons l'hypothèse que d'autres protéines coopèrent avec les MmpL pour transporter ces lipides à travers et au-delà la membrane plasmique. Des données antérieures suggèrent que des protéines membranaires de la famille Gap et les lipoprotéines de la famille LprG pourraient être impliquées dans ce processus, mais leur rôle dans le transport reste à confirmer. En outre, nous avons récemment identifié diverses protéines interagissant avec un transporteur MmpL qui pourraient potentiellement être des composants de la machinerie d'export des lipides. Dans ce contexte, nos objectifs visent : 1) à étudier le rôle des protéines de la famille Gap et des lipoprotéines de la famille LprG dans le transport des lipides ainsi que leur organisation au sein de l’enveloppe et leur association avec les MmpL, 2) à examiner le rôle dans le transport de protéines candidates interagissant avec les transporteurs MmpL pour découvrir de nouveaux composants de la machinerie de transport.

 Pour aborder ces questions, nous proposons d’étudier le rôle de ces protéines dans l’export de deux familles modèles de glycolipides de la mycomembrane de Mtb, les di- et polyacyltréhaloses (DAT/PAT) et les sulfolipides (SL). Les études seront réalisées dans un premier temps chez la mycobactérie modèle Mycobacterium smegmatis (Msm) qui produit une famille des glycolipides, les polyphléates de trehalose (TPP), dont la structure et la voie de biosynthèse sont similaires à celles des DAT/PAT et SL de Mtb. Les connaissances acquises chez Msm seront ensuite validées chez Mtb. Nous générerons une collection de mutants Msm exprimant les protéines des familles Gap et LrpG de Mtb pour étudier leur rôle dans le transport, avant de valider leur fonction chez Mtb. Nous utiliserons également diverses approches biochimiques pour caractériser la topologie et l’organisation supramoléculaire de ces protéines ainsi que leur localisation dans l’enveloppe et leur interaction avec les MmpL. En parallèle, nous mettrons en place une approche globale basée sur la technologie CRISPRi pour identifier, parmi les protéines interagissant avec les MmpL, celles associées au transport des glycolipides.

Ce projet apportera des informations fondamentales sur l'organisation des machineries de transport des DAT/PAT et SL chez Mtb. Celles-ci serviront de guide pour l’étude des voies de transport d’autres lipides de l’enveloppe de Mtb mais également l'assemblage de la mycomembrane chez d'autres mycobactéries. En outre, compte tenu de l'importance des lipides de la mycomembrane dans la survie et la virulence de Mtb, l'identification de nouvelles protéines impliquées dans leur export pourrait conduire à la découverte de nouvelles cibles pharmacologiques pour traiter la tuberculose qui reste un problème majeur de santé publique.

Les métabolites sont des petites molécules biologiques qui participant a de nombreux processus cellulaires. Ils sont impliqués par exemple dans la glycolyse et la respiration mitochondriale (aussi appelée Oxphos), les deux principales méthodes de production d’énergie dans les cellules. Les particules virales de virus enveloppés comme le VIH se composent de protéines et d’acides nucléiques d’origine à la fois cellulaire et virale. Les composants provenant de la cellule sont incorporés dans la particule virale au moment de sa formation à la membrane de la cellule productrice. Il a été récemment montré que les particules virales peuvent également contenir une petite molécule ayant des propriétés de modulation de la réponse immunitaire : l’AMP-GMP cyclique (cGAMP). Lorsque ces virus contenant cGAMP entrent dans une nouvelle cellule cible, cGAMP se lie à son récepteur STING ce qui induit l’activation de la cellule qui produit alors des cytokines pro-inflammatoire et augmente son expression de gènes antiviraux. L’incorporation de cGAMP dans des particules virales utilisées dans un contexte de vaccination augmente l’efficacité du vaccin. Ainsi, une petite molécule incorporée dans une particule virale peut avoir un effet significatif sur l’organisme. Nous avons émis l’hypothèse que les particules virales peuvent également incorporer des petites molécules d’origine cellulaires et en particulier des métabolites. Des expériences préliminaires nous ont permis d’identifier des métabolites dans des préparations virales par une approche metabolomique semi-ciblée. Dans ce projet, nous souhaitons confirmer la présence de ces métabolites cellulaires dans les particules virales (« métabolites viraux »), développer des méthodes pour moduler les quantités de métabolites présents dans les particules virales et décrire les effets de ces métabolites viraux sur la cellule cible.

Les préparations virales contiennent à la fois les particules virales et des petites vésicules extracellulaires (sEVs) qui ont des caractéristiques morphologiques et physico-chimiques similaires aux particules virales. Dans un premier temps, nous testerons donc plusieurs méthodes de séparation des particules virales et des sEVs et nous identifierons la plus efficace par western blot et par microscopie électronique. Nous confirmerons ensuite que les métabolites identifiés dans nos expériences préliminaires sont présents dans les particules virales ainsi purifiées en utilisant des méthodes plus ciblées telles que des ELISAs, des tests enzymatiques in vitro et de la spectrométrie de masse ciblée. Ces métabolites viraux peuvent être incorporés soit de manière passive lors de la formation de la particule virale à la membrane cellulaire, soit par des processus actifs qui pourraient alors impliquer des protéines virales. L’existence de tel mécanismes viraux pour l’incorporation de métabolites spécifiques suggèrerait que ces métabolites sont importants pour la pathologie du VIH. Dans un second temps, nous identifierons donc des méthodes pour moduler l’incorporation des métabolites viraux en modifiant soit la cellule productrice, soit le virus. Cela nous permettra de produire des particules virales contenant des quantités plus importantes ou moins importantes de certains métabolites choisis. Nous utiliserons ensuite différentes méthodes pour étudier les effets des métabolites viraux sur le métabolisme de la cellule cible ainsi que sur la réplication virale et la réponse immunitaire a l’infection.

Ce projet décrira pour la première fois la présence de métabolites cellulaires dans les particules virales et montrera les effets de ces métabolites sur la réplication virale et la réponse immunitaire à l’infection dans les cellules cibles du VIH. Il révèlera ainsi un nouvel aspect de la relation hôte-pathogène et permettra d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes.