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Le virus de l’hépatite E est la principale cause d’hépatite aiguë et touche 20 millions de personnes dans le monde par an. Souvent spontanément résolutive, l’hépatite E peut devenir fulminante chez les femmes enceintes, ou chronique chez les patients immunodéprimés.

Quatre génotypes affectent l’Homme. Les génotypes 1 et 2 se transmettent par voie féco-orale, généralement par l’eau contaminée. Les génotypes 3 et 4 ont une transmission zoonotique via la consommation de viande de porc ou de gibier crue ou peu cuite. En Europe, où circule principalement le HEV de génotype 3, l’hépatite E est considérée comme une maladie émergente.

De nombreux aspects du cycle viral sont à élucider car le HEV est longtemps resté difficile à amplifier in vitro. Récemment, un système efficace de culture utilisant la souche infectieuse p6 de génotype 3 a été mis au point dans notre équipe (Montpellier et al., 2018). Celui-ci permet de produire des particules virales infectieuses in vitro et in vivo ainsi que des protéines virales en grande quantité. Le génome du HEV est un ARN de polarité (+) composé de 3 cadres ouverts de lecture (ORF). Les protéines structurales sont l’ORF2p qui correspond à la capside virale et l’ORF3p, une phosphoprotéine impliquée dans la sécrétion des particules. L’ORF1 code une polyprotéine non structurale, l’ORF1p ou réplicase virale. La maturation de l’ORF1p, l’identification des compartiments cellulaires associés à la réplication du HEV ainsi que sa capacité à induire une réorganisation de l’architecture membranaire constituent des aspects de la réplication virale peu ou pas explorés. Dans ce projet de recherche, nous proposons donc de les étudier en caractérisant la réplicase ORF1p.

Nous avons déjà obtenu des résultats préliminaires très intéressants. Aucun anticorps anti-ORF1p n’étant fonctionnel dans des systèmes cellulaires réplicatifs, nous avons inséré des épitopes dans la région hypervariable et à l’extrémité C-terminale de la réplicase virale. Ces insertions permettaient de préserver la capacité réplicative de la souche HEV p6 de génotype 3. Pour la première fois, nous avons pu détecter l’ORF1p étiquetée dans un système cellulaire réplicatif. De façon surprenante, la protéine détectée migrait à plus de 180kDa, une taille correspondant à l’ORF1p non maturée. Des analyses par microscopie confocale ont révélé une localisation nucléaire et cytoplasmique de l’ORF1p étiquetée ce qui a été confirmé en Western blot. Enfin, nos premières analyses par microscopie électronique à transmission de cellules infectées par la souche HEV p6 indiquent la présence de structures vésiculaires en cluster avec une membrane dense aux électrons. Ceci suggère que le HEV pourrait induire des réarrangements membranaires dans la cellule hôte.

Dans ce projet, la maturation de l’ORF1p sera étudiée en détails par différentes approches biochimiques sensibles telles que des marquages métaboliques et des immunoprécipitations, afin de tenter de détecter des formes potentiellement clivées et peu abondantes. Puis, nous étudierons la localisation subcellulaire de l’ORF1p. Pour cela, des co-immunofluorescences utilisant des marqueurs de compartiments cellulaires seront réalisées et analysées en microscopie confocale. L’ORF1p produisant un ARN intermédiaire double brin (dsRNA), nous projetons également de comparer la distribution de ORF1p avec celle des dsRNA. Enfin, en utilisant des analyses par immuno-microscopie électronique, nous caractériserons les réarrangements membranaires potentiels dans la cellule hôte à l’aide d’un réplicon stable du HEV ou de la souche p6 infectieuse exprimant l’ORF1p étiquetée. En complément, ces 3 aspects seront explorés dans le contexte de la souche Sar55 de génotype 1 dont nous disposons également au laboratoire.

Le développement de notre projet de recherche devrait donc apporter une connaissance pointue sur les interactions entre le HEV et la cellule pendant la réplication. Au delà d’avancées majeures dans le domaine de la recherche fondamentale sur ce virus, nos travaux pourraient également conduire à l’identification de cibles thérapeutiques conduisant au développement de nouveaux antiviraux.

Les organes lymphoïdes secondaires (OLS) sont les sièges de la présentation des antigènes aux lymphocytes T et de la mise en place des réponses immunitaires adaptatives. Les OLS sont colonisés très tôt par VIH-1 après sa transmission. Il s’y réplique, forme les premiers réservoirs et contribue à la déplétion de lymphocytes T CD4 (LTCD4), cela participant aux dérégulations immunitaires chez les personnes infectées. Connaitre la nature des LTCD4 des OLS ciblés par les virus T/F ou ceux de la primo-infection (PHI) est donc important pour comprendre comment s’établit une infection, la prévenir ou limiter ses conséquences physiopathologiques. Aujourd’hui cependant, notre connaissance en la matière reste incomplète. Cela tient d’abord à l’hétérogénéité phénotypique des LTCD4 dans les OLS, même si certaines sous-populations de LTCD4 ont été décrites comme particulièrement ciblées par le virus, comme les TFH ou des LTCD4 phénotypiquement proches des lymphocytes T résidents mémoires des tissus (TRM). Cette hétérogénéité phénotypique et l’organisation des LTCD4 dans leur environnement tissulaire restent en outre très mal connues, et de fait la manière dont ces paramètres influencent l’infection aussi. Enfin, l’infection des LTCD4 des OLS a seulement rarement été étudiée au moment de la PHI. Des travaux ont indiqué des différences dans la nature des LTCD4 ciblés dans les ganglions lymphatiques lors de la PHI, comparativement au stade chronique, mais les raisons à cela restent spéculatives, en particulier car la propension des virus T/F à infecter les différentes sous-populations de LTCD4 n’est pas connue.

     L’objet de cette demande est de compléter notre travail sur la caractérisation des LTCD4 ciblés par les virus T/F dans les OLS, et l’influence du tropisme viral à cet égard, puisque les infections sont initiées majoritairement par des virus R5 mais aussi parfois par des virus X4 ou R5X4, avec potentiellement des conséquences sur la nature des réservoirs viraux et la déplétion en LTCD4. Sur la base d’infections de cellules mononuclées isolées d’amygdales comme modèles d’OLS par des virus de la PHI R5 ou X4/R5X4, nous avons montré que différentes sous-populations de LTCD4 se distinguent par leur propension à établir des infections productives ou latentes ou leur sensibilité aux effets cytopathiques des virus, et cela d’une manière dépendante du tropisme des virus. Afin de comprendre le lien entre le phénotype de ces LTCD4 déterminé 4 jours post-inoculation (J4) et celui qu’ils avaient dans le tissu, nous avons utilisé la technologie CITE-Seq pour cartographier au plan transcriptomique et en fonction de leurs protéines de surface les LTCD4 à J4 et à J0, soit immédiatement après leur isolement du tissu. Les données de ces expériences, qui témoignent de l’empreinte phénotypique des LTCD4 acquise dans le tissu, seront complétées dans le cadre de cette demande par des expériences de transcriptomique spatiale et de microscopie confocale multiplexée sur des coupes d’amygdales, des expériences déjà mises au point dont nous avons validé la faisabilité et les potentialités.

Dans ce contexte, les objectifs du projet sont:

– Répéter les expériences de transcriptomique spatiale en utilisant un panel de marqueurs de gènes enrichi de marqueurs identifiés dans les expériences de CITE-Seq.

– Compléter les expériences de microscopie multipléxée en ciblant des protéines identifiées dans les expériences de CITE-Seq.  

– Confirmer le rôle de nouvelles populations de LTCD4 identifiées par les approches précédentes dans la réplication, la latence virale ou la sensibilité à la déplétion.

Ce programme s’étendrait sur 18 mois, soit jusqu’à l’échéance de la thèse de T. Montagné qui soumet parallèlement à cette demande de subvention une demande d’allocation de 4ème année de thèse. Il permettra de mieux comprendre comment l’environnement des LTCD4 dans les OLS façonne leur phénotype et leur rôle dans l’infection VIH-1. Il pourrait nous aider à mieux comprendre comment VIH-1 influence la structure et les fonctions des OLS chez les PVVIH.

Contexte

Bien que le Cambodge ait déja atteint l’objectif des 90-90-90 dans la population générale, la prévalence du VIH et l’usage non-systématique du préservatif au sein des populations-clés ((travailleuses du sexe (TS), hommes ayant des relations sexuelles avec des hommes (HSH), femmes transgenres (FTG)) restent préoccupants.

Peu de données sont disponibles sur l’acceptabilité et la volonté d’utiliser la PrEP dans les populations-clés au Cambodge. En raison de l’image négative consécutive à l’interruption d’un essai clinique de prévention du VIH chez des travailleuses du sexe suite à une forte protestation communautaire, la PrEP fut controversée au Cambodge pendant de nombreuses années, chez les autorités politiques et les communautés. Une évaluation qualitative sur l’acceptabilité de la PrEP dans les populations-clés du Cambodge est cruciale avant d’envisager une possible mise en œuvre de la PrEP au Cambodge.

Objectifs

Les objectifs principaux de l’étude sont :

• Evaluer la connaissance, la perception et l’acceptabilité de la PrEP dans les populations-clés (TS, FTG, HSH), parmi les soignants et chez les décideurs politiques, médicaux, et associatifs dans le contexte cambodgien

Les objectifs secondaires sont :

• Mieux comprendre les caractéristiques, besoins et attentes des organisations communautaires, afin de définir les conditions optimales de mise en œuvre de la PrEP communautaire
• Identifier les outils utiles pour améliorer la connaissance et l’acceptabilité de la PrEP, en particulier issus des nouvelles technologies (applications, sites internet).

Méthodes

L’étude consistera en une série de 7 focus-groupes :

• HSH âgés de moins de 25 ans 
• HSH agés de plus de 25 ans 
• Femmes transgenres
• Travailleuses du sexe employées d’établissements de divertissement
• Travailleuses du sexe indépendantes
• Soignants 
• Travailleurs communautaires

Quatre entretiens semi-directifs seront conduits auprès de décideurs :

• NCHADS (agence de lutte contre le VIH/SIDA)
• Ministère de la Santé
• Influenceurs des communautés HSH, transgenres, travailleuses du sexe

Echéancier

Le projet sera mené pendant 12 mois par une équipe pluridisciplinaire cambodgienne et française incluant des chercheurs en santé publique et en santé communautaire, une psychologue de la santé, et des médecins. Les 3 premiers mois seront consacrés à la phase préparatoire incluant mise en relation avec les personnes à enquêter, préparation des outils d’enquête et formation. La phase de collecte de données sur le terrain sera mise en œuvre pendant deux mois. Les données seront retranscrites et analysées durant les 5 mois suivants. Enfin, les résultats seront restitués durant les deux derniers mois.

Résultats et retombées attendus

L’analyse des données qualitatives devraient nous permettre d’identifier les freins et facteurs favorables à la PrEP dans le contexte particulier du Cambodge, ainsi que les conditions et outils nécessaires à une mise en œuvre de la PrEP communautaire. Cela devrait nous permettre de fournir aux autorités cambodgiennes des informations pertinentes pour l’établissement d’un plan de mise en œuvre de la PrEP dans le cadre du programme national de lutte contre le VIH.

TLR7 et TLR8 sont des récepteurs Toll dont les gènes sont codés sur le chromosome X. Ils sont présents dans les endosomes et sont activés par des séquences d’ARN simple brin provenant de virus comme le VIH-1. Ils sont exprimés simultanément par les lymphocytes T  (LT) CD4+ et les monocytes, et l’interaction entre VIH-1 et TLR7 ou TLR8 peut avoir des impacts fonctionnels distincts sur les LT CD4+ humains ou les monocytes. En particulier, il a été récemment montré que la stimulation des LT CD4+ humains avec des ligands de TLR8 amplifie l’activation via le TCR, la production de cytokines pro-inflammatoires et promeut leur différenciation en cellules effectrices Th1/Th17. L’activation de TLR8 favorise la réplication du VIH-1 et induit la réversion de la latence dans les LT CD4+ de patients VIH+ avirémique. Nous avons établi que TLR8, comme TLR7, sous leur forme clivée active, sont bien exprimés dans les LT CD4+ d’hommes et de femmes. En visualisant les transcrits primaires en RNA FISH, nous avons démontré que le gène TLR8, comme TLR7, échappe à l’inactivation du chromosome X dans les LT CD4+ et les monocytes, et présentent également un profil d’expression distinct sur le chromosome X actif, co-dépendant chez les femmes, et mutuellement exclusif sur l’X des hommes. Par conséquent, à l’échelle unicellulaire les cellules exprimant les deux gènes simultanément sont 7-fois moins fréquentes chez les hommes comparées aux femmes. Ces résultats indiquent que les gènes TLR7 et TLR8 forment un cluster de gènes corégulés que nous avons appelé « X-linked Toll-like receptor locus » (Youness et al., soumis). La prise en compte du sexe dans l’analyse des interactions VIH-1/LT CD4 nous apparait donc essentiel, ce qui curieusement n’a jamais été pris en considération jusqu’à présent.

            Nos objectifs seront d’étudier 1) s’il existe un biais du sexe dans l’infection par le VIH-1 dans les cellules T CD4+ et 2) si l’expression bi-allélique de TLR8 dans les LT CD4+ de femmes leur donne un avantage dans l’infection et/ou la réversion de la latence des LT CD4+ infectées.

            Ce projet s’articulera autour de 3 objectifs spécifiques :

1) Impact de l’activation de TLR8 sur la permissivité à l’infection par le VIH-1 des LT CD4+ activés en fonction du sexe

2) Rôle de TLR8 dans l’infection VIH-1 dans les LT CD4+ provenant d’un tissu lymphoïde, les amygdales, en fonction du sexe

3) Impact de l’activation de TLR8 sur la réversion du VIH-1 latent dans les LT CD4+ en fonction du sexe.

            Notre hypothèse de travail est que le bais de sexe dans l’infection VIH-1 pourrait être lié à un biais de sexe dans la susceptibilité à l’infection productive des LT CD4+ et/ou à un biais de sexe dans l’établissement du réservoir latent. Cette différence liée au sexe pourrait être intrinsèque aux LT et dû à l’expression différentielle du récepteur TLR8 codée par l’X entre les cellules T CD4+ d’hommes et de femmes. Une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les facteurs biologiques liés au sexe impactent l’inversion de la latence et la persistance du VIH-1 pourrait promouvoir le développement d’approche thérapeutique spécifique à chaque sexe.

La plupart des cas de VIH pédiatrique surviennent pendant l'allaitement, et des thérapies innovantes sont nécessaires de toute urgence pour parvenir à éliminer la transmission verticale du VIH dans un avenir proche. Le VRC07-523LS est un anticorps neutralisant à large spectre (bNAb) prometteur mis au point par le Centre de recherche sur les vaccins du NIH américain, qui présente l'activité la plus large et la plus puissante contre les virus du clade C, ceux circulant en Afrique australe dont la Zambie. Ce bNAb est actuellement évalué dans le cadre d'une étude de phase I sur la détermination de la dose, l'innocuité et la pharmacocinétique, et de deux études de phase II sur l'innocuité et la pharmacocinétique, qui s'achèvera à la fin de l'année 2025. Les investigateurs de l'étude de phase 1 ont rapporté que la dose de 30mg/kg peut fournir une concentration plasmatique de bNAb supérieure à la cible pendant 3 mois avec un excellent profil d'innocuité. Sur la base d'un solide rationnel pour tester un seul bNAb, l'objectif principal de ce projet est d'évaluer l'efficacité contre la transmission postnatale du VIH d'un bNAb à longue durée d'action, VRC07-523LS, administré par voie sous-cutanée aux nouveau-nés et aux nourrissons allaités à haut risque en Zambie et au Mozambique. Pour atteindre cet objectif, nous avons conçu un essai de phase 3, multicentrique, en double aveugle, contrôlé et randomisé, qui recrutera 1100 nouveau-nés et nourrissons allaités dont les mères vivent avec une infection à VIH non contrôlée. Les nouveau-nés seront randomisés 1:1 pour recevoir soit le VRCO7-523LS, soit un placebo par injection sous-cutanée tous les 3 mois. Dans les deux groupes, des services de PTME de routine seront fournis conformément aux directives nationales. Le résultat principal est le temps écoulé avant l'infection par le VIH jusqu'à 12 mois, et les résultats secondaires évalueront l'innocuité et étudieront les infections survenant pendant le suivi, notamment dans le bras bNAb. Un analyse intermédiaire est prévue à mi-parcours. Le rapport coût-efficacité de l'intervention sera également évalué. VRC07-523LS est le seul bNAb pouvant faire l'objet d'un essai de phase 3 et, à notre connaissance, aucune autre équipe, en particulier aux États-Unis, n'a prévu de mener une étude similaire en utilisant un seul bNAb. En cas de succès, cette étude pourrait représenter une avancée majeure et un tournant majeur vers l'élimination du VIH pédiatrique.

Dans ce projet, nous proposons d’effectuer une étude fonctionnelle des anticorps anti-HBs, dirigés contre l’antigène de surface (AgHBs) porté par les protéines d’enveloppe du HBV. Nous poursuivrons trois objectifs :

Objectif-1. Mesurer l’activité neutralisante des anticorps anti-HBs dans un modèle d’infection in vitro, pour la comparer au titre établis par ELISA. Les analyses seront pratiquées en utilisant plusieurs sources d’anticorps : i) “naturels” présents chez les sujets ayant guéri d’une infection, ii) “vaccinaux” présents chez des sujets ayant reçu différents types de vaccins, iii) “HBIG” présents dans les préparations commerciales d’immunoglobulines, iii) monoclonaux, potentiellement utilisables comme outil thérapeutique chez les porteurs chroniques, ou en immunoprophylaxie.

Objectif-2. Mesurer la spécificité des anticorps anti-HBs neutralisants face à la diversité du HBV en utilisant des inoculums viraux spécifiques de i) différents génotypes HBV (A-G), ii) sous-types, iii) variants émergents tels que les mutants d’échappement à la réponse immune ou aux vaccins.

Objectif-3. Mesurer l’étendue de la diversité des épitopes reconnus par les anticorps anti-HBs en cartographiant les épitopes, dits neutralisants, à l’aide d’un test ELISA et d’une banque de mutants de protéines AgHBs portant chacun une substitution alanine pour chaque résidu du déterminant antigénique majeur de l’AgHBs (déterminant-a).

Les résultats de cette étude permettront d’établir les cartographie et hiérarchie des épitopes neutralisants majeurs de l’AgHBs qui pourront être confrontées avec les analyses à venir de structure par cristallographie ou de cryo-microscopie électronique à haute définition. L’ensemble de ces informations renseignera sur la structure tridimensionnelle du polypeptide portant l’AgHBs et sur le mécanisme de neutralisation du HBV par les anticorps anti-HBs. Cette avancée sera décisive pour le développement d’anticorps monoclonaux anti-HBs thérapeutiques ou prophylactiques, et pour l’optimisation des stratégies d’immunoprophylaxie de l’hépatite B