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Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) requiert la contribution concertée de nombreux facteurs cellulaires et de différentes voies de signalisation pour se répliquer. Parallèlement, les cellules de mammifères expriment de nombreuses protéines qui agissent de façon dominante et autonome afin de supprimer la réplication virale. Ces facteurs de restriction définissent la première ligne de défense contre les infections. Parmi eux, les protéines de la famille APOBEC3 (apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3 ou A3) et en particulier A3G et A3F, sont des désaminases de cytosines dont l’action d’édition des cytosines en uridines lors de la transcription inverse du génome viral est létale pour le virus. L’activité antivirale d’A3G/3F est contrecarrée par la protéine Vif (virion infectivity factor) du VIH-1, qui réduit considérablement leur taux d’expression et leur incorporation dans les particules virales (i) en recrutant une E3 ubiquitine ligase et en induisant la dégradation d’A3G par le protéasome, (ii) en réduisant la transcription des gènes dépendant de RUNX, dont A3G, et (iii) en régulant négativement la traduction de l’ARNm d’A3G. Concernant ce dernier mécanisme, nous avons récemment découvert la présence d’un uORF (upstream ORF) dans la région 5’ non traduite (5’UTR) de l’ARNm d’A3G et montré son importance non seulement pour la traduction intrinsèque d’A3G, qui serait traduit par un mécanisme original de leaky-scanning et de ré-initiation, mais également pour sa régulation par Vif.

Au vu du rôle des uORF dans la répression traductionnelle en général, notre projet s’articulera autour de 3 axes majeurs :

1. Explorer la conservation phylogénétique de l’uORF chez les hominoïdes et son impact dans la réplication virale. Nous avons montré la conservation de l’uORF d’A3G pour A3F chez l’humain, avec des propriétés similaires vis-à-vis de Vif. Nous élargirons nos connaissances phylogénétiques au niveau de l’uORF à l’ensemble des APOBEC3 issues des hominoïdes et étudierons l’impact du polymorphisme sur l’expression protéique et la réplication virale (collaboration avec Lucie Etienne, ENS-CIRI, Lyon).
2. Identifier les facteurs protéiques cellulaires requis pour l’inhibition traductionnelle. Par des techniques de pull-down basées sur la biotinylation des ARNm d’A3G ou par l’utilisation d’une biotine ligase (BirA), suivie d’une analyse par spectrométrie de masse, nous identifierons les facteurs protéiques cellulaires spécifiques de Vif et de l’uORF de l’ARNm d’A3G.
3. Cartographier les ARNm cellulaires régulés par Vif. Vif étant une protéine chaperon d’ARN, nous chercherons à identifier par la technique de PAR-CLIP les ARN cellulaires qui interagissent avec Vif (potentiellement via une uORF). Ces ARN, et/ou leur produit d’expression, pourraient être des régulateurs potentiels de la réplication virale (collaboration avec Sarah Gallois-Montbrun, Institut Cochin, Paris).

L’ensemble de ces résultats devrait apporter une vision nouvelle sur un mécanisme original d’inhibition traductionnelle induit par une protéine virale. Cette nouvelle compréhension élargie du phénomène de restriction cellulaire pourrait permettre à l’ensemble de la communauté scientifique d’imaginer de nouvelles stratégies d’inhibition de la réplication virale qui ciblerait spécifiquement l’interaction de Vif avec les ARNm d’A3G/3F, le complexe d’initiation de la traduction dépendant de Vif ou encore les nouveaux partenaires identifiés.

L’OMS et l'ONUSIDA ont appelé à mettre fin à l’épidémie du VIH/Sida pédiatrique d'ici 2030. Alors que de nombreux pays continuent de progresser vers l’atteinte de cet objectif au sein de la population adulte, les enfants (âgés de 0 à 14 ans), adolescents (âgés de 10 à 19 ans) et jeunes adultes (âgés de 15-24 ans) vivant avec le VIH (EAVVIH) accusent un retard important. Nous faisons l’hypothèse que ce constat s’explique principalement par l’invisibilité de cette population pédiatrique, et l’absence d’interventions adaptées. Les EAVVIH constituent une population complexe et hétérogène d’un point de vue épidémiologique. Cette population est constituée d'enfants vivant avec le VIH depuis la période péri/postnatale et vieillissant jusqu'à l'adolescence, à laquelle s’ajoutent les adolescents et jeunes adultes nouvellement infectés horizontalement par le VIH au cours de l'adolescence, dont les jeunes populations clés et les jeunes femmes, touchées de manière disproportionnées par l’épidémie.  Pour atteindre l'objectif des « 95-95-95 », ciblant 95% des enfants vivant avec le VIH identifiés, 95% de ceux identifiés sous traitement et 95% de ceux traités en succès virologique, il est essentiel pour chacun des pays de connaitre l’ampleur de l’épidémie et définir les différents dénominateurs des populations cibles. La modélisation s'avère être un outil pragmatique et joue un rôle important pour mieux comprendre la dynamique des épidémies et pour planifier et évaluer les interventions de prévention.

L’objectif principal de notre projet est d’améliorer la précision des indicateurs VIH pédiatriques en Afrique de l’Ouest et du Centre. Pour y arriver, notre équipe développera un modèle de simulation novateur et interactif, qui pourrait être facilement utilisé par les planificateurs de programmes en santé dans trois pays clés : la Côte d’Ivoire, le Togo et le Cameroun.

Le projet s'appuiera sur les collaborations existantes dans chacun des trois pays et sera construit en lien avec les programmes nationaux. Nous établirons un « groupe de travail modélisation du VIH chez les enfants, adolescents et jeunes adultes », constitués de chercheurs, épidémiologistes et acteurs des programmes locaux, afin d'examiner les données disponibles et fournir des recommandations sur l’interprétation et l’utilisation de celles-ci. Le modèle que nous proposons sera un modèle de transition d'états, dépendant du temps. Il simulera distinctement les différentes populations : jeunes filles, et jeunes hommes à « faible risque », hommes ayant du sexe avec les hommes, les travailleuses du sexe, et leurs clients. Il prendra en compte les mouvements entre populations, ainsi que la transmission inter et intra populations et leur dynamique spatiale.  Nous projetterons sur la période 2020-2030 le nombre d’EAVVIH ainsi que la part attribuable à chacune des sous populations, et selon s’ils aient été diagnostiqués, s’ils ont initié un traitement antirétroviral et s’ils sont en suppression virologique. Notre évaluerons l’impact d’interventions existantes (par exemple, le diagnostic précoce avant l’âge de 2 mois) et l’impact du passage à l’échelle de nouvelles interventions, dont la prophylaxie préexposition pour les adolescents et les antirétroviraux à action prolongée. Enfin, nous conduirons plusieurs analyses de sensibilité pour évaluer l'impact de différentes sources d'incertitude sur les résultats du modèle calibré, ce qui nous permettra d’identifier quels paramètres sont les plus sensibles et donc les besoins en production de données pour la recherche. Enfin, nous développerons une application web, accessible en ligne, servant d’interface dans laquelle les programmes pourront sélectionner leur pays et insérer les paramètres propres à leur contexte.

A travers ce projet, nous proposons de tirer parti de l'expérience de chacune des équipes pour faire progresser la modélisation de l'épidémie de VIH chez les enfants, adolescents et jeunes adultes en Afrique de l’Ouest et du Centre et contribuer à l'élaboration de politiques de santé efficaces et efficientes, permettant à la région de rattraper son retard dans la lutte contre le VIH/sida.

L’intestin est un compartiment clé pour la réplication du VIH-1, dès les stades précoces de l’infection, entraînant une déplétion profonde des lymphocytes T CD4+ dans la muqueuse intestinale, notamment les cellules productrices d’IL-17 (Th17, Th1Th17) qui jouent un rôle central dans l’homéostasie muqueuse.

Dans l’étude ANRS EP44, nous avons observé un défaut de reconstitution des lymphocytes T CD4+ dans la muqueuse intestinale sous traitement antirétroviral, en particulier des Th17 et Th1Th17, notamment du fait d’altérations du recrutement des lymphocytes T CD4+ du sang vers le compartiment intestinal.

La caractérisation virologique réalisée chez les individus de l’étude ANRS EP44 a révélé la persistance d’une fraction augmentée de T CD4+ hébergeant de l’ADN VIH-1 par rapport aux T CD4+ sanguins, la persistance d’une production virale résiduelle, et une compartimentation des populations virales dans l’intestin chez plus de 75% des individus étudiés.

Le projet proposé a pour objectif de mieux caractériser les cellules cibles du VIH-1 dans la muqueuse intestinale, notamment en fonction du tropisme d’utilisation des corécepteurs CCR5 et CXCR4. Nous avons développé un modèle d’histocultures de tissu intestinal humain permettant d’étudier l’infection des différentes sous-populations de T CD4+ dans le micro-environnement tissulaire muqueux. Nos résultats préliminaires montrent que les virus utilisant CCR5 infecteraient préférentiellement les T CD4+ CCR6+, en particulier les Th1Th17 et Th17, alors que les virus utilisant exclusivement CXCR4 cibleraient préférentiellement les T CD4+ CCR6-. Nous chercherons à mieux caractériser les sous-populations de T CD4+ ciblées par les virus utilisant CCR5, notamment les Th17, Th1Th17, Th22 ainsi que les sous-populations de Treg CCR6+ vs. CCR6-, et à comparer les cinétiques d’infection entre ces sous-populations. Nous chercherons également à préciser les sous-populations ciblées préférentiellement par les virus utilisant CXCR4, et à mieux comprendre les facteurs de susceptibilités à l’infection entre ces sous-populations T CD4+ en fonction du tropisme viral.

La caractérisation des cellules cibles du VIH-1 dans la muqueuse intestinale, et les différences de susceptibilités selon le tropisme viral pour CCR5 ou CXCR4 pourraient permettre de mieux comprendre le rôle de ce compartiment dans la sélection des virus utilisant CCR5 observée aux stades précoces de l’infection. Ce projet pourrait également avoir des implications concernant la persistance du VIH-1 sous traitement antirétroviral.

Le rôle central des traitements antirétroviraux (TARV) pour le contrôle et la réduction de l’incidence de l’infection à VIH à l’échelle globale, mais surtout dans les régions du monde les plus affectées, principalement l’Afrique subsaharienne, n’est plus a démontré. Cependant, le risque d’échec au traitement est réel, ce risque est accompagné par celui de développer des résistances au traitement, ce qui doit conduire à un changement de traitement. Le nombre limité de molécules exige donc de développer des stratégies qui doivent être efficaces pour maintenir la suppression virologique le plus longtemps possible et limiter l’émergence et la circulation de virus résistants. Dans ses dernières recommandations 2019 pour les pays à ressources limitées, l’OMS recommande une 1ère ligne comprenant 2 inhibiteurs nucléosidiques de la reverse transcriptase (INRT) et un inhibiteur de l’intégrase (INI), préférentiellement ténofovir (TDF)+Lamivudine (3TC)/emtricitabine (FTC)+dolutégravir (DTG). Cette nouvelle stratégie, attendue et souhaitée dans le contexte des pays du Sud où l’augmentation des niveaux de la résistance prétraitement et sous-TARV, inquiète depuis plusieurs années, pose cependant un certain nombre d’incertitudes. En effet, les données disponibles et publiées sur l’efficacité du DTG découlent essentiellement des études conduites dans les pays du Nord, très peu d’essais cliniques ont évalué la stratégie dans les pays du Sud et pratiquement aucune évaluation de l’efficacité de cette approche dans le contexte de vie réelle au Sud n’a été conduite à ce jour. De plus, peu ou pas de recommandations n’ont été faites pour accompagner cette transition vers une nouvelle 1ère ligne DTG au Sud. Cela est d’avantage préoccupant pour les patients qui sont actuellement sous 1ère ligne à base d’INNRT, et qui seront switchés vers une nouvelle 1ère ligne à base de DTG. Cette population comprendra des profils virologiques très variables, allant des patients en suppression virologique, aux patients en échec avec accumulation de mutations de résistance. En l’absence de recommandations claires et financées pour l’organisation de ces transitions, le risque que cette transition produise des résultats inférieurs aux attentes est réel et important. De plus, la réalité de la prise en charge de l’infection à VIH au Sud se heurte régulièrement à d’importants défis exacerbés par le manque de ressources financières et humains. Cela rend souvent difficile l’application de décisions prises même au niveau national. Pour illustration, malgré l’unanimité autour l’utilisation de la charge virale pour le suivi des personnes sous TARV, l’accès et la disponibilité de cet examen dans la pratique quotidienne reste faible, voire très difficile dans plusieurs programmes au Sud. Il est donc essentiel d’évaluer la réponse virologique chez les personnes qui vont être switcher de la 1ère ligne actuelle, vers la nouvelle 1ère ligne, en vrai vie au Sud. Cette étude, développée et considérée comme prioritaire par le groupe de travail AC43 « Virologie Médicale » de l’ANRS, a pour objectif d’évaluer cette nouvelle stratégie en contexte de vie réelle dans trois pays d’Afrique subsaharienne, la Côte d’Ivoire, le Mali et le Togo. Il s’agira principalement d’évaluer l’efficacité virologique de la 1ère ligne ARV à base de DTG en contexte de vraie vie dans les programmes nationaux du Sud chez les patients infectés par le VIH-1 et initialement sous 1ère ligne à base d’INNRT et déterminer l’impact de la résistance aux INRT sur le succès de la nouvelle stratégie. Ces trois pays ont tous adoptés les nouvelles recommandations de l’OMS et le déploiement des 1ère lignes DTG est en cours d’initiation. Il est donc essentiel que cette recherche soit rapidement menée dans sillage de cette transition en cours, afin que les résultats obtenus aident à élaborer des recommandations qui permettront aux programmes des pays du Sud de mieux encadrer l’utilisation de cette nouvelle molécule, à améliorer le suivi thérapeutique et virologique des patients, à prévenir les échecs précoces, l’émergence et la circulation rapide des résistances.

Les thérapies anti-rétrovirales traitent efficacement les infections au VIH. Cependant, l’arrêt du traitement entraîne un rebond viral et le traitement doit donc être poursuivi à vie, avec des risques importants. Les rebonds viraux sont provoqués par des cellules infectées de manière latente, qui peuvent être réactivées même après des années de traitements. De plus, alors qu’une variable médicale clé pour développer une cure est la vitesse à laquelle les cellules latentes se réactivent, nous savons très peu de choses sur la transcription virale dans les cellules latentes. Des données récentes indiquent que la sortie de latence est stochastique, ce qui reflète les fluctuations aléatoires de la transcription observées dans les cellules vivantes. Sachant que la plupart des gènes ne sont transcrits qu’épisodiquement, nous pensons que certaines cellules latentes ne sont pas complètement silencieuses mais expriment le virus de manière transitoire, lors de brèves impulsions, et donc de manière indétectables avec des méthodes conventionnelles. Ces cellules latentes pourraient être des facteurs clés de l’infection car elles pourraient échapper à la surveillance immunitaire et déclencher deux types d’événements: (i) des sursauts sporadiques de transcription virale, trop faibles pour activer complètement le virus mais néanmoins produisant suffisamment de virus pour déclencher un nouveau cycle infectieux; (ii) une sortie de latence, dans laquelle une impulsion produit suffisamment d’ARN pour initier la boucle de rétroaction de Tat, et donc pour activer complètement le virus. Ces événements stochastiques pourraient être dus à un bruit intrinsèque, créé par la stochasticité inhérente aux réactions biochimiques de l’initiation de la transcription, ou à un bruit extrinsèque, qui est généré par des facteurs affectant l’ensemble de la cellule, comme une activation aléatoire d’une voie de signalisation, un stress mécanique, etc…

          Dans ce projet, nous exploiterons la puissance de l’imagerie de molécule unique pour étudier la transcription virale dans les cellules infectées de manière latente par le VIH-1. Nous avons précédemment développé des systèmes permettant de visualiser des molécules uniques d’ARN viral dans des cellules vivantes, et ces méthodes sont parfaitement adaptés pour détecter les rares événements de transcription virale qui se produisent dans les cellules latentes. Grâce à de l’imagerie de cellules vivantes à haut débit, nous déterminerons:

• But 1: l’activité transcriptionnelle virale dans un grand nombre de cellules T latentes;
• But 2: l’hétérogénéité de la réponse virale à l’activation cellulaire;
• But 3: la contribution des facteurs extrinsèques et intrinsèques à ces évènements de transcription.

Ce projet offrira une vision renouvelée de la latence virale et aidera à concevoir des stratégies plus efficaces pour combattre le virus.

L'infection par le virus de l'hépatite B (VHB) reste un problème global majeur de santé publique. Des vaccins thérapeutiques efficaces et des traitements antiviraux ont actuellement disponibles, mais ils doivent être pris à vie et ne parviennent pas à éradiquer le virus du foie infecté. La recherche de nouvelles cibles thérapeutiques est en continuel développement. Certaines de ces nouvelles approches visent à réduire la sécrétion de pseudo-particules virales (SVPs; subviral particles) et/ou de virions, tous deux porteurs de l'antigène de surface du VHB (AgHBs), dont la perte spontanée ou induite par traitement a été associée à un meilleur pronostic clinique. Cependant, l'accumulation intracellulaire de protéines d’enveloppe mutées a été associée à un risque pro-oncogène accru. Il semble important que de futurs traitements réduisant la sécrétion d'AgHBs n’entraînent pas son accumulation intracellulaire. Il est donc essentiel d'approfondir les connaissances sur les mécanismes moléculaires qui confèrent à la petite protéine de surface S du VHB (SHBs) la capacité intrinsèque de s'auto-assembler en structures oligomères complexes constituant l'élément structurel majeur des SVPs et de l’enveloppe des virions.

      Des études suggèrent que la boucle cytosolique 1 (CYL-1) de SHBs aurait un rôle important dans la morphogenèse et la sécrétion des SVPs, qui constituent la majeure partie du pool d'AgHBs. L'étude proposée vise à caractériser l'implication des motifs moléculaires et structurels spécifiques de CYL-1 et leur fonction dans l'oligomérisation et le trafic intracellulaire des protéines S conduisant à la sécrétion extracellulaire des SVPs, en étudiant les mutations aux positions sW35R, sW36R/G, sS38F/W, sC48H/Y/W, sH60C/Y, sC65G/H/R/S, sC69H/R/W et sM75T, précédemment associées à une rétention intracellulaire de l'AgHBs. L'effet des mutations sur la sécrétion de l'AgHBs sera confirmé in vitro dans des cellules Huh7 et HepG2 transfectées avec des plasmides recombinants exprimant soit les SHBs seules, soit inclues dans la protéine de surface longue du VHB (LHBs), un composant mineur des SVPs. L'oligomérisation et la localisation subcellulaire des SHBs mutées et sauvages (WT) seront étudiées dans des cellules transfectées à l'aide des techniques de microscopie en immunofluorescence confocale, et d’imagerie FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy), TEM (Transmission Electron microscopy) et FCS (Fluorescence correlation spectroscopy). Le niveau de stress du réticulum endoplasmique et l'efficacité de l'activation de la réponse UPR (Unfolded Protein Response) induite par l'accumulation de mutants CLY-1 seront étudiés in vitro. Nous émettons l’hypothèse que les mutants CYL-1 pourraient interférer avec les composants de la voie ERAD (ER-associated degradation) de l’UPR et la voie de l’autophagie afin d'échapper à la dégradation, et les mécanismes moléculaires potentiellement impliqués seront explorés. L'impact de mutants CYL-1 sur l'inflammation hépatique et le développement de la fibrose sera étudié in vivo dans un modèle murin, à l'aide du vecteur adénovirus-associé hépatotrope AAV2/8 et d'une lignée de souris transgéniques VHB. La nature et l'étendue de l'environnement pro-inflammatoire et des lésions hépatiques associés à la rétention de l'AgHBs dans les hépatocytes seront évaluées dans les tissus hépatiques animaux.

      L'analyse fonctionnelle des mutants CYL-1 altérant la production/sécrétion de l'AgHBs permettra d'approfondir les connaissances sur les motifs moléculaires et structurels de CYL-1 et leurs fonctions dans les premières étapes de l'oligomérisation et/ou dans le trafic intracellulaire des protéines S conduisant à la libération extracellulaire des pseudo-particules virales. La caractérisation des éléments critiques de CYL-1 pourrait faciliter le développement de nouvelles cibles thérapeutiques. L'accumulation intracellulaire de protéines virales étant un facteur pro-oncogène potentiel, il semble essentiel d'évaluer dans quelle mesure l'altération de la structure/fonction de CYL-1 peut contribuer à échapper au mécanisme de dégradation des protéines en interférant avec les mécanismes ERAD et de l’autophagie.