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Activités anti-VIH des 12 sous-types d’interféron alpha

Les études de l’inhibition de la réplication du VIH par l’interféron alpha sont généralement limitées à l’utilisation d’un seul sous-type (alpha 2). Cependant, le génome humain code pour 12 sous-types, qui lient le même récepteur, mais avec des affinités différentes, et sont capables d’induire l’expression de séries de gènes communs et d’autres spécifiques à chaque sous-type. En conséquence, leur efficacité antivirale est différente à la fois sur un virus donné et sur des virus appartenant à des familles différentes.

Concernant le VIH, des publications relativement récentes ont démontré que certains sous-types sont plus efficaces que d’autres.  Nous avons entrepris une étude systématique de l’effet anti-VIH des 12 sous-types d’IFN alpha. Nous avons initialement confirmé une hiérarchie de l’effet antivirale sur la réplication du virus. Ensuite, de façon originale, nous avons mis en évidence des spécificités dans leur puissance d’inhibition sur des étapes précises du cycle viral.  Pour identifier des facteurs potentiellement responsables des différences d’inhibition observées, nous avons conduit une analyse de l’expression des ARN (RNAseq) par des cellules exposées à chaque sous-type ; analyse que nous avons réalisée par séquençage profond, à génome entier. Cette analyse a permis d’identifier un nombre restreint de gènes induits spécifiquement par certains sous-types. Notre but est d’identifier, parmi ces gènes, ceux qui sont responsables de l’inhibition observée à chaque étape du cycle viral. Le caractère non-biaisé de notre approche (RNAseq) nous permettra d’explorer l’implication de facteurs inattendus. En effet, notre analyse a mis en évidence l’induction de l’expression de gènes jusqu’alors non associés à la réponse interféron.

Cette étude nous permettra de définir le potentiel anti-VIH des IFN-alpha, qui se révèle bien plus vaste qu’initialement imaginé.  L’identification de nouveaux facteurs capables de cibler des étapes précises du cycle viral pourra inspirer des approches antivirales novatrices.

Les réponses immunitaires dues aux cellules Natural Killer (NK) et B surviennent aux premiers stades de l’infection virale B et sont essentielles pour l’éradiquer. Pourtant, l’infection chronique (CHB) se produit parce que la réponse immunitaire antivirale est insuffisante. Les événements qui conduisent à un dysfonctionnement immunitaire ont été étudiés par notre groupe et nos partenaires. Grâce aux financements de l’ANRS, nous avons montré que les cellules B et NK sont dysfonctionnelles au cours de l’infection liée au virus de l’hépatite B (VHB) dans des modèles humains in vitro et validé ces résultats chez les patients atteints d’une infection chronique. Nous avons observé que les réponses des cellules B médiées par le Toll Like Receptor 9 (TLR9) étaient inhibées par la protéine d’enveloppe du virus (HBsAg). Nous avons noté que la perte d’expression de TLR9 sur la totalité des sous-ensembles de cellules B était médiée par la perte de l’activité de promoteur du VHB qui s’accompagne d’un blocage de la phosphorylation du facteur de transcription CREB. En outre, les réponses des cellules B médiées par TLR9, telles que la prolifération et la production de cytokines ont été inhibées chez les patients CHB. Pour les cellules NK, nous avons démontré plusieurs changements significatifs dans l’expression de leurs récepteurs, la perte de cytokines tels que IFNg, MIP1a et de la fonction de cytotoxicité par rapport aux donneurs sains. Cependant, la base moléculaire et la voie de signalisation du dysfonctionnement des cellules NK et B sont mal caractérisées. De plus, si cet état pouvait être inversé, ce que nous cherchons à déterminer, l’impact thérapeutique serait clef. Nous avons des données montrant que la perte de la fonction pCREB dans les cellules B entraîne non seulement la perte de l’expression de TLR9 mais également des gènes tels que BCL-2 qui est important dans le contrôle de la croissance cellulaire. Nous émettons l’hypothèse que la dérégulation de CREB joue un rôle dans la fonction des cellules B par TLR9 et non chez les patients CHB. Notre groupe dispose également de données montrant que la perte de fonction des cellules NK chez les patients CHB peut dépendre de mTOR, une voie qui est essentielle à la réponse des cellules NK. Plus frappant, nous avons des données récentes montrant que les cellules NK des patients CHB expriment Lag3 et TOX qui sont des gènes associés aux cellules T lorsque ceux-ci deviennent sur-stimulés et épuisés. Nous émettons l’hypothèse que plusieurs changements moléculaires se produisent dans les cellules NK des patients CHB qui dépendent de la modification de la voie mTOR par le VHB et plus spécifiquement l’HBsAg. Notre objectif est de définir les signatures génétiques qui conduisent à la fonction des cellules B et NK afin de contribuer à la compréhension du dysfonctionnement immunitaire induit par le VHB.

Pour explorer nos hypothèses, nous prévoyons d’utiliser des modèles humains in vitro de VHB, des plateformes de séquençage, des écrans CRISPR / Cas9, la cytométrie en flux et les techniques de biologie moléculaire. Dans les études sur les cellules NK et B, nous explorerons les altérations génétiques qui se produisent au cours des différents stades chroniques de la maladie, ce qui nous amène à inclure des patients aux différents stades cliniques de la maladie. Bien qu’il s’agisse d’un défi ambitieux, nous sommes convaincus d’avoir accumulé les outils de purification cellulaire, de production virale de VHB, de cohortes cliniques et de plates-formes de séquençage au sein de notre centre et d’avoir consolidé nos différentes collaborations pour explorer nos nouvelles hypothèses. Nous pensons que nos découvertes permettront de comprendre la signature moléculaire des cellules NK et B dans le contexte d’une infection par le VHB. À la fin du projet, nous espérons exploiter nos résultats dans des perspectives cliniques qui permettront d’identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques et surtout de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients VHB.

Contexte : La protéine Rev, essentielle à la réplication du VIH-1, est responsable d’exporter – du noyau vers le cytoplasme – les ARNm viraux immatures, permettant l’expression de protéines virales tardives et constituant l'ARN génomique de nouveaux virions. Rev est importée dans le noyau par Importine β (Impβ) et ce processus est stimulé par Nucleophosmine 1 (NPM1). L'interaction directe de Rev avec Impβ ou NPM1 est cruciale, car son inhibition bloque respectivement son import nucléaire et inhibe l'infection et la réplication du VIH-1. Malgré leur importance dans le cycle viral, les bases moléculaires de ces interactions restent mal comprises.

Objectif : Ce projet vise à identifier et caractériser les mécanismes clés de l’import nucléaire de Rev dans les cellules infectées par le VIH-1, en étudiant ses interactions avec Impβ et NPM1. Nous utiliserons la cryo-microscopie électronique (cryo-ME) et la RMN pour obtenir des structures 3D à haute résolution des complexes Impβ/Rev et Rev/NPM1 déjà identifiés. Nous examinerons également la dynamique des interactions entre Rev, Impβ et NPM1 pour comprendre la régulation de leur formation. L'objectif est d’identifier et caractériser les interactions, stables ou transitoires, entre ces protéines et leur potentiel rôle régulateur dans les compartiments cellulaires lors de la réplication du VIH-1.

Approche méthodologique :

Complexe Rev/Impβ : Les données préliminaires indiquent que la fusion de Impβ avec le domaine de dimérisation de la protéine EsxA de S. aureus, permet de créer des homodimères stables d’Impβ (EsxA-Impβ)2 de plus de 200 kDa, capable d’interagir avec Rev. Nos résultats soulignent que la flexibilité intrinsèque à Impβ doit être réduite à l’aide d’un anticorps monoclonal pour renforcer l’interaction entre Impβ et Rev, garantissant ainsi la formation d’un ensemble de particules plus homogène pour l'analyse par cryo-ME.

Complexe Rev/NPM1 : Les données préliminaires obtenues par cryo-ME révèlent la structure du complexe pentamérique entre Rev et le domaine d’oligomérisation de NPM1, avec une résolution atteignant 3.4 Å. Cependant, nos résultats indiquent une certaine flexibilité des molécules de Rev au sein des complexes Rev/NPM1, suggérant l’existence de multiples conformations de Rev à la surface de NPM1. Pour affiner la classification 2D et obtenir les structures des complexes (Rev/NPM1OD)5 coexistants, nous utiliserons les prédictions d’interaction établies avec une forte confiance par AlphaFold. Pour mieux comprendre la fonction du domaine intrinsèquement désordonné de NPM1 (NPM1HBD) et étudier son comportement structurel et dynamique en présence de Rev, nous utiliserons la technique de RMN – adaptée à l’étude des bases mécanistiques des assemblages moléculaires désordonnés.

Régulation de l’import nucléaire de Rev par NPM1 et Impβ : Nous étudierons l’évolution des interactions au sein des complexes Rev/NPM1 et Rev/Impβ lorsque les trois protéines sont présentes dans un même environnement, in vitro, en utilisant une combinaison de techniques biochimiques, biophysiques et structurales. Les interactions identifiées seront ensuite analysées par cryo-ME. La localisation de ces interactions dans les différents compartiments cellulaires de cellules transfectées sera réalisée par microscopie, en utilisant des anticorps spécifiques et des protéines fluorescentes. Cette approche nous permettra d’étudier la dynamique des interactions impliquées dans l’import nucléaire de Rev dans un contexte cellulaire.

Résultats attendus : L'obtention de structures à haute résolution des complexes qui impliquent Rev, Impβ et NPM1 permettra d'identifier les résidus impliqués dans ces interactions cruciales pour la réplication virale. L'étude comparative des différents complexes contribuera à une meilleure connaissance du mécanisme moléculaire de l'import de Rev, qui devrait améliorer notre compréhension de cette étape mal comprise et non ciblée dans les traitements antiviraux disponibles.

La réplication rétrovirale se déroule grâce à une étape obligatoire, l’intégration, qui est essentielle pour une expression génique virale efficace et garantit une ségrégation égale du matériel génétique du virus aux cellules filles après la division cellulaire. Bien que l’intégration rétrovirale se produise dans tout le génome humain, elle n’est pas entièrement aléatoire. Les lentivirus tels que le VIH, par exemple, ciblent de préférence les gènes actifs. Des recherches effectuées au cours des dernières années ont révélé que le facteur cellulaire associé à la chromatine, LEDGF/p75, et, plus récemment, le facteur nucléaire CPSF6 jouent un rôle dominant dans l’intégration du VIH dans les gènes actifs. Comme le VIH ne nécessite pas de division cellulaire pour pénétrer dans le noyau, l’ADN viral pour accéder à la chromatine rentre dans le noyau à travers le complexe de pores nucléaires (NPC).

Les NPC jouent un rôle important dans l’organisation de la chromatine 3D, ainsi que dans la régulation de l’expression des gènes cellulaires et, probablement, des gènes viraux. De plus, des études récentes, dont la nôtre, ont montré l’implication de certains Nups dans l’infection par le VIH. Récemment, nous avons montré que l’environnement de la chromatine à proximité des NPC favorisait la réplication virale. Plus récemment, nous avons publié une étude montrant qu’un autre facteur nucléaire, le CPSF6, joue un rôle important dans la sélection des sites d’intégration dans la chromatine active et dans les régions à majeur densité génique. Cependant il est possible que Nups et CPSF6 coopèrent pour autoriser une réplication efficace du VIH.

Des études sur différents parasites qui s’intègrent en permanence dans le génome de l’hôte montrent qu’ils ont évolué pour cibler la chromatine de manière à optimiser leur coexistence avec les hôtes et à favoriser la libération de nouveaux descendants viraux. En revanche, les lymphocytes T infectés par le VIH-1 ne survivent généralement qu’un jour ou deux avant d’être tués par le système immunitaire cellulaire ou par la toxicité de l’infection. Ainsi, le VIH doit libérer des taux élevés de virus dans les quelques jours suivant l’infection. L’intégration virale dans les gènes actifs est généralement favorable à une transcription efficace expliquant potentiellement la préférence de ciblage. Cependant, le VIH peut également coexister pendant des périodes prolongées en tant que chimère dans le génome de patients infectés comme virus latent. Par conséquent, les mécanismes sous-jacents à ce phénomène sont encore à l’étude et il est fort possible que les facteurs de chromatine associés aux protéines d’entrée nucléaire puissent jouer un rôle critique sur la persistance du VIH dans les cellules infectées.

Dans notre laboratoire, nous avons récemment mis au point un nouvel outil d’imagerie qui peut permettre de visualiser en temps réel l’ADN viral une fois retrotranscrit jusqu’à son intégration dans la chromatine de la cellule hôte. Cette technologie révolutionnaire sera l’occasion d’élucider la dynamique de l’interaction entre le génome de l’ADN viral et les facteurs de l’hôte ou d’identifier les sites de la chromatine impliqués dans la transcription ou la latence virale.

Dans le projet proposé, nous explorerons le lien entre le NPC et les sites d’intégration du VIH pour caractériser le rôle intrigant et inconnu des nucléoporines, des facteurs nucléaires et des «topologically chromatin associating domains» ou des régions régulatrices comme les « super enhancers »  pour orchestrer la transcription virale.

La tuberculose (TB) est une maladie respiratoire hautement contagieuse qui affecte des millions de vies chaque année, comme l'a rapporté l'Organisation mondiale de la santé en 2023. Trouver des approches innovantes pour lutter contre Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est essentiel pour prévenir l'infection, la maladie et la transmission. Cependant, les réponses immunitaires spécifiques nécessaires pour prévenir la pathogenèse sévère de la TB ne sont pas entièrement élucidées. Il est de plus en plus reconnu que les phases initiales de l'infection jouent un rôle crucial dans le déterminisme du résultat final. Cependant, étudier ces événements précoces chez l'homme présente des défis, car ils se produisent profondément dans les poumons, et les premiers signes cliniques d'infection ne sont pas visibles.

Par conséquent, il est nécessaire de développer des modèles in vitro innovants qui reflètent avec précision les caractéristiques in vivo de l'infection à Mtb. Suite à l'inhalation, les bacilles tuberculeux colonisent finalement les macrophages, entraînant une réplication intracellulaire extensive. Notre projet vise à explorer si les bacilles pourraient potentiellement être transmis via une colonisation intermédiaire ou une adhérence aux cellules épithéliales pulmonaires. De plus, il n'est pas clair si la principale niche de réplication intracellulaire est les macrophages résidents, les monocytes recrutés, les cellules dendritiques ou les neutrophiles. Un modèle d'infection multicellulaire offre l'opportunité d'investiguer ces questions de manière opportune.

Le projet émane d'une collaboration entre deux équipes : l'équipe dirigée par Alexandre Grassart, spécialisée dans la technologie organ-on-a-chip (Ooc), et l'équipe dirigée par Priscille Brodin, avec près de 20 ans d'expérience dans les modèles cellulaires basés sur l'imagerie de l'infection à Mtb au Centre d'infection et d'immunité de l'Institut Pasteur de Lille. Notre projet vise à développer des plates-formes de puce pulmonaire personnalisées pour explorer comment les facteurs physiologiques influencent le comportement invasif de Mtb. Le projet est structuré en trois phases principales :

1. Conception et fabrication de dispositifs OoC immunocompétents mimant le tissu pulmonaire humain: la puce pulmonaire simulera l'interface alvéolo-capillaire intégrant une interface air-liquide et des macrophages cultivés dans l’épithélium. La faisabilité de cet objectif est prouvée par des résultats préliminaires obtenus par nos deux équipes reposant sur l’utilisation dun modèle « maison » similaire aux puces commerciales (EmulateTM) qui ont été récemment utilisé par nos collaborateurs McKinney et Thacker (Thacker et al., 2020 ; Mishra et al., 2023) au sein du consortium IMI2 ERA4TB. L’avantage de notre technologie OoC « maison » réside indéniablement dans son coût de fabrication (100 fois moins cher qu’une puce commerciale) et dans l’optimisation des capacités d’analyse par microscopie confocale à haute résolution.
2. Compréhension de la dynamique spatio-temporelle de l'infection à Mtb dans le poumon : Cette phase vise à déterminer les portes d’entrées cellulaires initiales de MTb au niveau d’alvéoles humaines biomimétiques par une analyse en temps réel de l'invasion à Mtb. Les questions clés incluent l'identification des premiers types cellulaires infectés par Mtb (cellules épithéliales type I , II , macrophages), les étapes dynamiques de la propagation de Mtb, de l’endiguement et de son élimination. Enfin, nous viserons à déterminer le rôle de la machinerie cellulaire hôte dans la colonisation épithéliale à Mtb.
3. Evaluation de la modélisation pathophysiologique des OoC par l’utilisation d'un panel de 10 isolats cliniques de Mtb isolés de patientes atteints de formes sévères de Mtb obtenus en collaboration avec le Professeur Dumitrescu et le Professeur Ader (Hospices Civils de Lyon ) pour les différentes caractéristiques décryptées ci-dessus.

Dans l'ensemble, ce projet abordera des questions biologiques fondamentales et apportera une nouvelle technologie pour améliorer le diagnostic de la TB.

Depuis près de 15 ans, des preuves ont montré que la prophylaxie pré-exposition (PrEP) du VIH est efficace pour protéger les hommes ayant des relations sexuelles avec des hommes (HSH) contre l’acquisition du virus. Cependant, son efficacité varie selon les études et dépend de l’adhérence et de l’usage régulier. Le déploiement de la PrEP a été inégal en Europe. La France a atteint une adoption significative, avec 72 % des HSH connaissant la PrEP et près de 100 000 l’ayant utilisée. En revanche, le Portugal affiche l’un des taux d’utilisation les plus faibles d’Europe occidentale, avec seulement 4 500 utilisateurs en 2022. Un obstacle majeur à l’adoption plus large de la PrEP est la crainte qu’elle ne modifie les comportements sexuels des utilisateurs et ne réduise l’usage d’autres mesures préventives, comme le préservatif. De plus, la PrEP a été associée à une hausse des infections sexuellement transmissibles (IST) et de la résistance aux antibiotiques. Ces préoccupations freinent son expansion, malgré des preuves mitigées et le rôle de la stigmatisation dans l’accès à la PrEP. Dans ce projet, nous aborderons ces questions en exploitant deux cohortes HSH au Portugal (the Lisbon MSM cohort et the Almada cohort) et une en France (ANRS PREVENIR). Nous mènerons ce travail en collaboration avec GAT, une ONG portugaise qui fournit des services de santé, du conseil et de l’activisme en direction de la communauté HSH depuis 2001. Tout d’abord, nous identifierons les liens entre l’adoption de la PrEP et l’évolution des comportements sexuels dans deux contextes contrastés, en quantifiant les relations causales : l’initiation de la PrEP entraînant des changements comportementaux, et inversement. Nous y parviendrons en nous appuyant sur des avancées méthodologiques récentes en inférence causale à partir de données observationnelles. Ensuite, nous construirons un modèle à agents, stochastique et spatialement explicite, pour projeter l’efficacité et la rentabilité des politiques actuelles et alternatives de distribution de la PrEP sur les deux prochaines décennies, incluant l’accessibilité, les critères d’éligibilité et les interventions comportementales. Le modèle simulera les interactions individuelles et à l’échelle de la transmission entre VIH et IST, l’efficacité des outils de prévention et les comportements individuels, afin d’analyser comment ces facteurs déterminent l’efficacité des politiques de prévention. Le consortium du projet regroupe des modélisateurs mathématiques, des statisticiens, des scientifiques en calcul numérique, des experts en santé publique et des acteurs engagés auprès des communautés HSH portugaises, ainsi que des chercheurs de la cohorte PREVENIR en France. Nos résultats permettront d’identifier et quantifier les relations causales entre l’adoption de la PrEP et les comportements sexuels, comblant ainsi une lacune majeure en matière de connaissances. Le cadre méthodologique développé pourra être appliqué à d’autres populations et contextes. Le modèle à agents sera librement accessible et applicable aux stratégies de prévention du VIH et des IST. Sur le plan des politiques, ces connaissances guideront l’amélioration evidence-based des strategies de prévention du VIH au Portugal, notamment dans le contexte de l’augmentation des taux d’IST et de la résistance aux antibiotiques. En France, elles contribueront à des politiques efficaces et efficientes en assurant un accès durable à la PrEP tout en atténuant les conséquences épidémiologiques indésirables. Enfin, notre collaboration avec GAT garantira que les résultats du projet soutiennent les efforts d’activisme, informent les actions de santé publique et orientent les politiques de prévention du VIH au sein de la communauté HSH.

Chaque année environ 4 500 cas de tuberculose maladie sont déclarés en France, avec une majorité de formes pulmonaires. Les données de surveillance épidémiologique disponibles grâce à la déclaration obligatoire recueillie par Santé Publique France ne permettent pas de décrire avec précision les caractéristiques des tuberculoses, les comorbidités associées, leurs formes cliniques ou leur sévérité. La déclaration des issues de traitement n’est disponible que dans 65% des cas. Lorsqu’elle est renseignée, l’issue de traitement est potentiellement défavorable dans environ 25% des cas. Les raisons expliquant le taux élevé d’issues défavorables ne sont pas parfaitement connues du fait des données de surveillance épidémiologique parcellaires et ne permettent pas d’analyser les facteurs associés à l’échec de traitement. Par ailleurs, les recommandations internationales pour le traitement de la tuberculose évoluent avec l’introduction de traitements de 2 ou 4 mois au total, plus courts que le traitement standard de 6 mois recommandé depuis 40 ans. Dans ce contexte, il est important de mieux comprendre les facteurs de risque d’échec thérapeutique, et de rechute pour pouvoir adapter les traitements au risque des patients, et aller ainsi vers un traitement personnalisé.

L’objectif général de la cohorte French TB est de décrire les caractéristiques socio-démographiques, cliniques, radiologiques et bactériologiques des tuberculoses maladie traitées en France, ainsi que décrire les comorbidités associées et leur impact sur les issues de traitement. Un certain nombre d’objectifs spécifiques sont prévus et permettront d’évaluer si certains facteurs sont associés à l’évolution sous traitement comme l’immunodépression, la sévérité de la maladie ou la durée du traitement antituberculeux. Le dépistage de séquelles pulmonaires post-tuberculose sera réalisé à la fin du traitement, et d’éventuels facteurs pronostiques (biomarqueurs, facteurs liés à la bactérie) pourront être étudiés grâce à des sous-études qui seront réalisées à postériori. Un volet sciences sociales permettra d’évaluer l’impact des déterminants sociaux, de la littératie en santé, des représentations de la maladie, sur la qualité du suivi et les issues de traitement.

La cohorte French TB est une étude prospective observationnelle non interventionnelle incluant des sujets âgés de 18 ans et plus, ayant une tuberculose maladie pour laquelle un traitement est débuté en hospitalisation. Le suivi et le traitement antituberculeux seront menés conformément aux recommandations en vigueur en France. Le critère de jugement principal est le succès du traitement antituberculeux, défini par la guérison certaine ou guérison probable à la fin du traitement, ou au plus tard 12 mois après l’inclusion (M12). Les participants fourniront des données socio-démographiques, cliniques, biologiques, radiologiques et bactériologiques à différentes visites prévues par le protocole à 2 jours, 1 et 2 semaines, 2 mois, à la fin du traitement, à 12 et 24 mois. Chez les participants qui y consentent, des prélèvements pour la constitution d’une biothèque seront réalisés suivant les visites prévues. Il s’agira de prélèvements sanguins, urinaires, respiratoires et de cheveux.

Il n’existe actuellement aucune cohorte de cette ampleur en France permettant de documenter quels sont les facteurs associés à des issues de traitement défavorables. Le dépistage des séquelles pulmonaires à la fin du traitement, de même que la collection biologique qui est prévue font l’originalité de ce projet. En effet cette collection permettra de réaliser des études pour mieux comprendre certains mécanismes immunologiques au cours de la tuberculose maladie, notamment les aggravations paradoxales sous traitement. Il sera également possible d’évaluer l’intérêt de biomarqueurs prédictifs de réponse au traitement. Dans le contexte de la mise en place de l’action coordonnée tuberculose (AC TB) de l’ANRS|MIE depuis 2019, la création de cette cohorte permettra de structurer la collaboration entre chercheurs impliqués dans la recherche fondamentale, la recherche clinique, la recherche translationnelle ou en sciences sociales.