Winning projects and candidates

L’absence d’un modèle animal pleinement immunocompétent capable de soutenir la réplication du virus de l’hépatite C (VHC) et de reproduire la pathobiologie spécifique induite par ce virus a empêché l’étude approfondie des interactions complexes entre le virus et l’hôte, ainsi que des pathologies associées à la persistance virale tout au long de la vie.

Le présent projet tire parti d’un modèle animal de substitution basé sur l’infection de rats Sprague Dawley non consanguins par un hepacivirus de rongeur apparenté au VHC, que les équipes A, B et C ont récemment mis en place grâce au soutien du groupe de travail AC42 “métabolisme lipidique” et d’un contrat d’initiation attribué par ANRS|MIE. Les résultats préliminaires ont montré un taux élevé d’infections chroniques dans un petit groupe de rats et ont révélé des troubles métaboliques marqués 30 semaines après l’infection, notamment des troubles du métabolisme lipidique dans le foie des animaux présentant une infection chronique.

L’objectif de ce projet est d’utiliser ce modèle animal de substitution pour caractériser de façon approfondie ces troubles métaboliques induits par les hepacivirus au cours de l’infection chronique avec un groupe de rats plus important, et évaluer comment une combinaison de l’infection chronique par un hepacivirus et un régime riche en matières grasses et sucres (régime occidental) peut aggraver ces pathologies.

Ce projet est original car de telles études n’ont jamais été possibles avec le VHC. Le RHV-rn1 présente de nombreux atouts qui étayent sa pertinence en tant que modèle de substitution efficace pour le VHC chez l’homme, comme nous l’avons montré, ainsi que d’autres équipes. De plus, les collègues qui ont établi ce modèle d’infection par le RHV-rn1 en premier lieu aux États-Unis et qui ont généreusement partagé l’ADNc viral avec nous ne poursuivent pas d’études de pathobiologie utilisant ce modèle.

En collaboration avec deux autres équipes apportant une expertise complémentaire, nos objectifs spécifiques sont les suivants :

• Décrire les troubles du métabolisme des lipides survenant dans le foie des rats infectés chroniquement grâce à des investigations histologiques et biochimiques des sections/extractions de tissu hépatique, ainsi que par des analyses lipidomiques/métabolomiques détaillées et non ciblées des foies infectés par rapport aux foies non infectés. [WP1]
• Déterminer l’incidence du régime occidental en combinaison avec l’infection par l’hepacivirus sur le développement des troubles métaboliques du foie. [WP2]
• Identifier les voies hépatiques fortement dérégulées en réponse à l’infection par le RHV en utilisant le séquençage ARN haut débit comparatif des foies infectés par rapport aux foies non infectés. Utiliser la fluxomique pour comprendre comment le virus détourne le métabolisme des cellules hôtes. [WP3]
• Prédire la meilleure combinaison de molécules antivirales à action directe (AAD) du VHC qui soit susceptible d’être efficace contre la réplication du RHV par le biais d’analyses in silico, et évaluer son efficacité d’abord dans des modèles de culture cellulaire, puis in vivo, afin de préparer le terrain pour une analyse ultérieure de la persistance putative des troubles métaboliques après la guérison. [WP4]

Certains aspects de ces questions seront également étudiés, le cas échéant, en parallèle dans des cellules d’hépatomes de rat infectées par le RHV ou dans des hépatocytes primaires de rats infectés ex vivo.

Il est attendu que ce projet fournisse des informations précieuses sur les mécanismes moléculaires et les signatures des troubles du métabolisme lipidique associés aux hepacivirus et à la stéatose hépatique non alcoolique, ainsi que sur la possibilité que de telles comorbidités mixtes puissent se potentialiser. De plus, en utilisant ce modèle de substitution in vivo / ex vivo hautement pertinent, ce projet ouvrira la voie à d’éventuelles études ultérieures sur l’évolution de la pathologie hépatique dans le contexte de l’élimination de l’hepacivirus par les antiviraux actuellement prescrits, lorsqu’ils sont utilisés à un stade avancé de la maladie.

Les déficits immunitaires primitifs (DIPs) consistent en un large éventail de maladies héréditaires provoquant une susceptibilité infectieuse. Outre les infections, des manifestations dys-immunes mal-définies, telles qu’une lymphoprolifération chronique, la survenue d’une auto-immunité ou des manifestations inflammatoires de divers organes, y compris du foie, sont fréquentes. Ces hépatites chroniques représentent un problème médical sérieux, souvent diagnostiqués tardivement car évoluant de façon indolente. L’hyperplasie nodulaire régénérative (HNR) définie par une transformation nodulaire du parenchyme hépatique avec une infiltration fréquente de cellules T CD8+ intra-lobulaires fait partie du spectre des complications hépatiques dys-immunes dont la physiopathologie n’est pas bien définie. Elles surviennent de façon fréquentes chez les patients avec déficit humoral et en particulier les patients avec déficit immunitaire commune variable (DICV). Nous avons récemment décrit une pathologie hépatique similaire chez des patients atteints de déficit immunitaire combiné sévère ayant bénéficié d’une greffe de cellules souches hématopoïétiques (GCSH) ou d’une thérapie génique (GT). Par diverses études OMICs (séquençage métagénomique de nouvelle génération (mNGS), phénotypage par cytométrie de masse (CyTOF), séquençage de l’ARN en cellule unique), nous avons montré que cette pathologie était associée à i) une infection chronique à virus entérique (virus Aichi, Norovirus, Sapovirus) ii) une infiltration de cellules T CD8+ intra-lobulaire dans le foie et des images d’HNR iii) une expansion de cellules effectrices mémoires T CD8+ activées, non cytotoxiques, non épuisées iv) une forte signature interféron de type I et II retrouvées au niveau des leucocytes circulants et v) un déficit humoral persistant. Enfin, nous avons montré que cette pathologie, que nous avons appelée EVAH (enteric viral-associated hepatitis), était réversible après une seconde GCSH concomitante à l’élimination virale et la reconstitution immunitaire. Nous faisons l’hypothèse qu’un processus similaire pourrait expliquer les maladies hépatiques, y compris l’HNR, qui surviennent dans d’autres DIPs et en particulier dans les déficits en anticorps (DICV, agammaglobulinémie liée à l’X, déficits immunitaires combinés mais aussi déficits humoral acquis dans le cadre de thérapeutique immunosuppressive).  Dans le cadre du projet EVAHDAR, nous souhaitons apporter une description détaillée de l’EVAH avec 3 objectifs i) évaluer les patients à risque de développer cette complication dans les déficits humoraux héréditaires et acquis en recherchant les virus entériques à l’aide du mNGS (dans les selles, l’urine, le plasma et les biopsies d’organes le cas échéant), dans un grand groupe de patients présentant des signes compatibles d’EVAH et de patients asymptomatiques homologues (individus avec DIPs appariés EVAH-) ii) déterminer la relation de cause à effet entre la maladie hépatique et l’infection chronique par un virus entérique par la détection in situ du virus (hybridation in situ et/ou immunohistochimie) et l’évaluation de la spécificité des cellules T CD8+ anti-virales iii) caractériser les cellules T CD8+ et les autres sous-populations leucocytaires en réalisant un phénotypage immunitaire approfondi par CyTOF chez tous les patients EVAH+ et les individus EVAH- appariés et en réalisant un transcriptome sur lymphocytes T CD8+ triés de patients EVAH+, d’individus PIDs appariés et de contrôles sains. En conclusion, EVAHDAR aidera à décrypter la physiopathologie de la maladie hépatique chez les patients présentant des déficits en anticorps, à établir le lien avec l’infection chronique par un virus entérique et à ouvrir la voie à de futurs traitements.

La famille des Hepeviridae dont le virus prototype est le virus de l’hépatite E (HEV) comprend plusieurs espèces virales dont les spectres d’hôte ne sont pas encore bien définis. De par le nombre important d’espèces animales pouvant servir de réservoir à ce virus, le HEV est un virus à très haut potentiel zoonotique. L’émergence de cas d’hépatite aiguë ou chronique chez les humains suite à l’infection par le virus de l’hépatite E du rat est préoccupante et il est nécessaires d’acquérir de nouvelles connaissances sur le patho-territoire des virus HEV des rongeurs et d’évaluer leur potentiel zoonotique. Le projet ZORRO a pour objectif de caractériser et d’évaluer le potentiel zoonotique des virus de l’hépatite E (Rocahepevirus ratti) circulant en France chez les rongeurs dans des modèles de cellules humaines.

La sur-infection par le virus de l’hépatite delta (HDV) de patients chroniquement infectés par le virus de l’hépatite B (HBV) est l’une des formes d’hépatites virales les plus agressives. L’infection par HDV a été montrée comme activant les voies interféron (IFN) de types I et III via la reconnaissance par les récepteurs de l’immunité innée de la famille des RLR (RIG-I receptor like) : MDA5 et LGP2. Cependant, malgré l’induction de nombreux gènes induits par l’IFN (ISGs) suite à l’infection HDV, la réplication du virus n’est pas quasiment pas affectée. De plus les traitements des patients avec des IFN exogènes ont aussi des effets limités. Nous pensons qu’une caractérisation exhaustive de la réponse innée à HDV sera instrumentale pour l’amélioration des thérapies à base d’IFN qui restent une composante clef dans la prise en charge des infections chroniques HDV.

Nos résultats préliminaires nous ont menés à faire l’hypothèse que MDA5 et LGP2 ne sont pas les seules protéines impliquées dans la reconnaissance d’HDV par les hépatocytes mais que des interactions plus complexes, et non décrites encore, entre différentes protéines des voies de l’immunité innée sont mises en jeux. En effet, nos résultats suggèrent l’implication additionnelle de trois protéines, OAS-1, RNASEL et GBP3, dans la reconnaissance d’HDV et l’induction de la réponse IFN. L’objectif de ce projet est donc de comprendre exactement comment HDV est reconnu par les hépatocytes.

En utilisant des modèles pertinents, incluant des hépatocytes primaires humains, nous allons fournir un panorama exhaustif des voies de reconnaissance des ARN doubles brins dans les hépatocytes et mettre en lumière et les caractéristiques communes et spécifiques de la reconnaissance d’HDV comparée à deux autres virus à ARN (Sendaï et ECMV). Nous déterminerons l’importance relative de MDA5, LGP2, RIG-I, OAS-1, RNASEL et GBP3 dans la réponse innée induite par HDV et décortiquerons les mécanismes moléculaires menant à l’induction d’ISGs en réponse à l’infection HDV. Comme nous utiliserons les virus Sendaï et ECMV dans toutes nos expériences, comme contrôles pour l’implication de RIG-I et MDA5 respectivement, cela pourrait aussi permettre d’identifier de nouvelles fonctions de OAS-1, RNASEL et GBP3 dans la reconnaissance des virus à ARN de façon générale. Les résultats générés par ce projet poseront également des bases pour explorer l’effet de stratégies visant à limitées la réponse induite par HDV pour l’améliorer l’effet antiviral des IFN de type I et III exogènes. Les connaissances générées par ce projet pourraient ainsi éventuellement menées au développement de meilleures stratégies antivirales.

L’équipe de Gilles Travé a mis au point une protéine de fusion chimère ciblant simultanément deux surfaces d’interaction de E6. Cette construction bifonctionnelle composée du domaine PDZ fusionné au motif LxxLL est capable de se lier à toutes les protéines E6 avec une affinité proche du nanomolaire, et de provoquer l’apoptose des cellules infectées par HPV16 et HPV18. En utilisant toutes les données structurales et fonctionnelles issues des travaux de l’équipe de Gilles Travé, le projet consistera à caractériser et améliorer la spécificité et l’affinité de cette construction anti-E6, et à tester ces effets cellulaires par différentes approches. 1) D’une part, nous chercherons encore à renforcer l’affinité du motif LxxLL de E6AP pour E6, en fusionnant au peptide LxxLL une zone d’interaction potentielle secondaire à E6 qui a été révélée par des prédictions de repliement alpha. Différents peptides de fusion seront synthétisés, avec différentes tailles de linker séparant le motif LxxLL du site secondaire. Les affinités pour E6 seront déterminées par SPR-BIAcore et comparées aux affinités obtenues avec le peptide LxxLL. La construction présentant la meilleure affinité pour E6 sera retenue pour la suite du projet. 2) Ce nouveau peptide, e6ap(1-2), sera ensuite intégré dans les constructions chimériques, pour générer des fusions monomères et tétramères e6ap(1-2). Les affinités pour la protéine E6 seront mesurées par SPR-BIAcore et cFP. Sachant que l’affinité de la chimère PDZ-LxxLL initiale était d’environ 10 nM, nous espérons, avec ces nouvelles constructions, obtenir des affinités sub-nanomolaires, voire se rapprochant du picomolaire. 3) Ces nouvelles constructions chimériques seront testées pour leurs activités dans les cellules, dans différentes lignées HPV+. Ils seront délivrés soit sous forme d’ARN messagers. Les efficacités relatives de chaque construction à bloquer l’activité intracellulaire de E6 et à induire le processus d’apoptose dans les différentes lignées cellulaires seront suivies par des marqueurs appropriés et quantifiées.

Introduction
Entre 257 à 291 millions de personnes dans le monde sont chroniquement infectées par le virus de l’hépatite B (HBV), entraînant plus de 820 000 décès par an. Les décès sont principalement le résultat d’une inflammation du foie entraînant une fibrose hépatique, une cirrhose et un carcinome hépatocellulaire. Les traitements actuels sont limités aux inhibiteurs de polymérase (analogues de nuclos(t)ides) et à l’interféron alpha pégylé (PEG-IFN-a), qui contrôlent l’infection mais la guérison est rare. Par conséquent, de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le HBV son nécessaires. L’antigène de capside core du HBV est une cible antivirale pertinente en raison de ses nombreuses
fonctions dans le cycle viral. Notamment, les modulateurs d’assemblage de capside (CAM) se lient directement à core et inhibent l’assemblage des particules virales. Les CAM sont divisés en deux familles : la classe A et la classe E. Les composés de classe A (CAM-A) induisent la formation de structures aberrantes et l’agrégation de core, tandis que les composés de classe E (CAM-E) induisent la formation de capsides vides mais morphologiquement intactes. Nous avons observé que le traitement avec le CAM-A RG7907 induit l’élimination des hépatocytes exprimant core en induisant l’agrégation de core dans le noyau, l’apoptose des hépatocytes et la prolifération cellulaire dans un modèle murin AAV-HBV et dans différents modèles cellulaires. De plus, nous avons observé la modulation de la réponse immunitaire innée suite au traitement CAM-A. Nos observations préliminaires suggèrent un nouveau mode d’action des molécules de type CAM-A. Cependant, les mécanismes détaillés à l’origine de l’apoptose et de l’activation de la réponse immunitaire innée sont inconnus. Nous avons émis l’hypothèse que l’agrégation de core après le traitement par CAM-A module l’expression des protéines entraînant l’apoptose et induit la réponse immunitaire innée dans les cellules répliquant le VHB.

Méthodes
Nous tirerons parti des cellules HepG2 exprimant core permettant l’accumulation suffisante d’agrégats core lors du traitement CAM-A pour identifier les moteurs de l’apoptose. De plus, nous souhaitons confirmer l’apoptose et l’activation de l’immunité innée dans des cellules HepaRG différenciées infectées par le HBV lors du traitement à long terme par un CAM-A. Nous visons enfin à étendre nos observations à un panel de CAM appartenant à la fois aux chimiofamilles HAP et non-HAP, afin d’élucider si l’apoptose est liée à la structure CAM ou à l’agrégation de core en soi.

Objectifs
L’objectif de ce projet sera d’élucider ce mode d’action dans des modèles d’infection authentiques et d’identifier les moteurs de cette mort cellulaire dépendante de l’agrégation centrale après un traitement CAM-A. Concrètement, nos objectifs sont :
1) APOPTOSE. Validation de protéines candidates dérégulées en tant que moteurs de l’apoptose médiée par l’agrégation de core dans les cellules exprimant core et dans des modèles d’infection par HBV.

2) IMMUNITÉ INNÉE. Décrypter l’activation de l’immunité innée et le rôle des protéines candidates lors de l’agrégation de core en présence du génome du HBV.

3) PREUVE DE CONCEPT IN VIVO. Nous souhaitons valider ces résultats dans des souris chimériques infectées par le VHB.

Conclusions
Les résultats de notre programme feront progresser la compréhension de l’infection par le HBV en identifiant un nouveau mécanisme d’action antivirale pour les molécules CAM-A qui pourraient aider à adapter la durée du traitement, conduisant potentiellement à l’élimination des cellules infectées après in fine. Les résultats de ce programme ouvriront la voie à une approche multimodale pour éradiquer cette menace majeure pour la santé mondiale.