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Le virus de l’hépatite B (VHB) utilise le transporteur de sels biliaires NTCP comme récepteur d’entrée cellulaire. La longue protéine d’enveloppe du VHB (LHB) reconnaît sélectivement le NTCP humain à la surface de l’hépatocyte. Ce processus de reconnaissance moléculaire est au cœur du mécanisme d’entrée du VHB dans les cellules cibles, car il permet la spécificité hôte-virus, le tropisme hépatique et la fusion avec la membrane de la cellule hôte. De plus, le LHB exprimé à la surface du virus contient le domaine antigénique majeur ciblé par les anticorps neutralisants induits par la vaccination ou l’infection. Malgré le rôle clé du LHB dans les étapes d’entrée du cycle viral, ainsi que dans le développement de vaccins et d’immunothérapies, les mécanismes moléculaires précis impliqués dans la reconnaissance du NTCP et des processus de neutralisation par les anticorps anti-LHB restent mal compris.

Dans ce projet, nous visons à comprendre les mécanismes de reconnaissance du LHB par le récepteur NTCP et les anticorps neutralisants à un niveau moléculaire et atomique. Nous adopterons une approche multidisciplinaire qui combine des analyses structurales, biophysiques, fonctionnelles et de biologie cellulaire. En utilisant des techniques de cryo-microscopie électronique, nous déterminerons les structures de du LHB dans des complexes avec le NTCP, ainsi qu’avec des anticorps humains neutralisants le VHB clonés à partir de donneurs immuns. De plus, nous utiliserons des tests fonctionnels pour mieux comprendre et vérifier dans un contexte cellulaire les mécanismes identifiés à partir des structures tridimensionnelles.

La faisabilité de ce projet ambitieux repose sur un consortium de collaborateurs internationaux ayant des expertises complémentaires dans tous les aspects scientifiques et techniques du projet, ainsi que sur de solides résultats préliminaires qui démontrent notre capacité à surmonter d’importants jalons expérimentaux pour atteindre nos objectifs.

Les résultats de notre projet fourniront une compréhension au niveau atomique des premières étapes du cycle d’infection du VHB et du virus satellite de l’hépatite Delta. Il est important de noter que les structures du LHB dans des complexes avec des fragments d’anticorps neutralisants humains aideront à définir les sites/épitopes neutralisants et à identifier les mécanismes moléculaires précis de la neutralisation virale par ces anticorps. Ce projet, et les résultats qui en découleront ont donc des implications majeures pour l’optimisation des immunogènes et l’amélioration de l’efficacité des vaccins, ainsi que pour aider à la conception rationnelle de immunothérapies antivirales basées sur les anticorps monoclonaux.

Le virus de l’hépatite E (HEV) infecte près de 20 millions de personnes chaque année dans le monde, entraînant environ 3,3 millions de cas symptomatiques et jusqu’à 70 000 décès. Bien qu’il ait un impact considérable sur les systèmes de santé, le cycle de vie du HEV est mal compris. L’absence de systèmes efficaces de culture de cellules infectieuses explique en grande partie la difficulté d’étudier le virus, aux niveaux cellulaire et moléculaire. En effet, il n’existe pas de médicament antiviral spécifique pour traiter une maladie liée au HEV. Seule la ribavirine est actuellement administrée aux patients, mais elle est peu spécifique et entraîne plusieurs effets secondaires. Il est donc urgent d’accroître les connaissances sur la réplication du HEV afin de concevoir des médicaments spécifiques. La polyprotéine de réplication du HEV, codée par l’ORF1, est une cible thérapeutique intéressante car elle est essentielle à la réplication virale. En effet, elle contient la polymérase qui réplique le génome viral et elle est supposée contenir les éléments structuraux qui permettent la formation du complexe de réplication virale construit à partir des membranes endocellulaires de l’hôte. Cependant, la structure et les nombreux rôles de la polyprotéine ORF1 ne sont pas décrits.

En raison de sa taille (186 kDa), de son architecture multi-domaines et de ses régions hydrophobes associées à la membrane, la polyprotéine ORF1 de réplication du HEV est très difficile à produire par les systèmes classiques d’expression hétérologue, empêchant tout projet structural. Grâce à un contrat d’initiation financé par l’ANRS, nous avons démontré qu’en utilisant un système d’expression acellulaire atypique dans le domaine de la biologie structurale, nous sommes capables d’exprimer la polyprotéine du HEV sous une forme soluble. De plus, nous avons obtenu des résultats structuraux préliminaires solides par une approche de microscopie électronique en coloration négative.

Dans la continuité de ces travaux préliminaires, nous souhaitons maintenant résoudre la structure tridimensionnelle de la polyprotéine de réplication ORF1 du HEV, ainsi que plusieurs de ses conformations. De plus, nous voulons identifier les modifications post-traductionnelles potentielles de la polyprotéine qui pourraient réguler ses fonctions.

Pour atteindre ces objectifs, nous utiliserons une approche intégrative de biologie structurale, combinant des méthodes biochimiques et structurales innovantes. En particulier, nous utiliserons la méthode de cryo-microscopie électronique pour résoudre la structure de la polyprotéine, une technique de pointe en biologie structurale, particulièrement adaptée aux protéines de grande taille et à domaines multiples. Cette approche sera combinée à des méthodes d’analyse d’image et de reconstruction 3D. Enfin, nous utiliserons une approche in silico pour explorer la dynamique de la polyprotéine et ses éventuelles interactions avec les membranes au niveau atomique.

Avec ce projet, nous fournirons des données concrètes pour répondre à de nombreuses questions sur la structure et les fonctions de la polyprotéine de réplication ORF1 du HEV : description des domaines de la polyprotéine (limites, repliement, résidus catalytiques, sites de liaison aux ligands), description de la flexibilité de la polyprotéine (différentes conformations ou oligomérisations, signaux pouvant réguler la plasticité de la protéine), identification des régions susceptibles d’interagir avec les endomembranes de l’hôte. L’ensemble de ces résultats représentera une avancée considérable quant aux connaissances sur la réplication du HEV et ouvrira la voie à de nombreuses études fonctionnelles.

Plus de 25 millions de personnes dans le monde souffrent d’une infection chronique par le virus de l’hépatite D (VHD). Alors que l’évolution clinique de l’infection aiguë par le VHD ne se distingue guère de l’hépatite B aiguë, à l’exception d’un taux plus élevé d’hépatites fulminantes, l’infection chronique par le VHD aggrave les pathologies hépatiques causées par le VHB. Le VHD se réplique dans les hépatocytes et les altérations qu’il induit se limitent au foie, se caractérisant par une nécrose des hépatocytes et des infiltrats inflammatoires. Le virion du VHD est une particule enveloppée constituée d’une enveloppe lipidique contenant des protéines de surface du VHB (HBsAg) et enrobant une ribonucléoprotéine interne (RNP), composée d’un multimère de la protéine delta (HDAg) codée pour le VHD et associée à une copie de l’ARN viral circulaire monocaténaire.

Bien que la protéine HDAg ait été initialement considérée comme un nouvel antigène du VHB, il a été montré par la suite qu’elle était associée à un petit ARN en tant qu’agent transmissible et défectueux utilisant les glycoprotéines (GP) d’enveloppe du VHB pour sa propagation, reflétant ainsi la nature du VHD comme virus satellite du VHB. En effet, les particules du VHD utilisent uniquement le mécanisme d’enveloppement et de bourgeonnement fournis par les GPs du VHB, ce qui permet ensuite le ciblage et l’entrée des particules du VHD dans les hépatocytes humains via des mécanismes qui dépendent des facteurs d’entrée du VHB. Le VHB, un virus « furtif » qui induit peu d’activation de la réponse innée et même la supprime, est lui-même réprimé lors d’une co-infection par le VHD,viadivers mécanismes directs et indirects. En particulier, l’activation de la réponse innée par le VHD, laquelle a peu ou pas d’effet sur le VHD lui-même, peut affecter plusieurs paramètres du VHB.

L’origine du VHD est actuellement inconnue. Il est possible que son ARN provienne du transcriptome cellulaire, en accord avec la découverte selon laquelle les ARN circulaires sont abondants dans les cellules. Par conséquent, une possibilité pourrait être que l’ARN du VHD soit apparu dans des hépatocytes infectés par le VHB après évolution de formes d’ARN cellulaire circulaires devenant auto-réplicatives et pour lesquelles le ribozyme viral et les séquences d’ARN codant pour HDAg pourraient être issues du transcriptome humain. Alternativement, comme l’ARN du VHD peut s’auto-répliquer dans une grande variété de types de cellules et d’espèces, ceci pose la possibilité théorique qu’il puisse être transmis par des processus différent de ceux fournis par le VHB.

Une étude récente de notre laboratoire a montré la possibilité que le VHD peut être transmis dans des infections expérimentales in vivopar différents virus génétiquement non apparentés au VHB, notamment par le virus de l’hépatite C (VHC). Ces résultats suggèrent que le VHD interrogent sur les raisons pour lesquelles le VHD semble, en apparence du moins, avoir naturellement évolué avec le VHB et non avec d’autres virus hépatotropes tels que le VHC. Dans le cas d’éventuelles co-infections VHD/VHC naturelles, le VHD et le VHC pourraient soit se neutraliser mutuellement, via des interactions réciproques négatives, soit coexister simultanément, ce que nous proposons de modéliser et disséquer dans ce projet.

Ainsi, nous investiguerons dans des co-infections expérimentales VHD/VHC in vitroet in vivo: 1) comment le VHC, qui est génétiquement différent du VHB, pourrait fournir au VHD ses mécanismes d’enveloppement, de bourgeonnement, de sécrétion ainsi que ses fonctions d’entrée ou de transmission, 2) quelles seraient les conséquences d’une telle transmission sur la réplication et la propagation du VHD, ou vice-versa, et sur ses interférences directes ou indirectes (immunes) entre les deux virus. Ce projet devrait également permettre de mieux comprendre les mécanismes qui on permis au VHD de s’adapter naturellement au VHB.

L’infection chronique par le virus de l’Hépatite B (HBV) concerne environ de 250 millions de personnes dans le monde et représente la première cause de carcinome hépatocellulaire (HCC). Les traitements antiviraux actuellement utilisés en clinique, principalement des analogues de nucléosides, permettent de réduire de façon significative la virémie dans le sang des patients, en agissant au niveau de la reverse-transcription virale mais ne résultent que rarement dans un effet suppresseur à long terme lors de l’arrêt du traitement. En effet, la présence du génome viral (ADNccc) dans le noyau des cellules infectées et sa capacité à réactiver la transcription/réplication virale lors de l’arrêt du traitement garantit la persistance du virus dans l’organisme et constitue une source continue de protéines virales qui contribuent à progressivement modifier les fonctions de l’hépatocyte.

Nos recherches s’intéressent à l’étude des fonctions régulatrices nucléaires de la protéine Core (ou HBc) d’HBV. En effet, en plus de ses fonctions structurales dans le cytoplasme, la protéine HBc est également présente dans le noyau de l’hépatocyte où elle s’associe au cccDNA et aux  ARN viraux. Le projet de recherche que nous avons initié depuis 2 ans (financé par l’ANRS en 2017) nous a conduits à identifier plusieurs protéines de fixation à l’ARN (RBP) parmi les facteurs associés à HBc dans le noyau des hépatocytes humains. En particulier, 11 facteurs d’épissages dont la protéine SRSF10 étaient hautement enrichis parmi les partenaires d’HBc. SRSF10 est une protéine SR qui régulé l’épissage alternatif de nombreux gènes cellulaires de façon phosphorylation-dépendante et qui intervient lors de la différenciation cellulaire et dans la réplication du VIH-1. Nous avons montré que SRSF10 exerce une activité anti-virale vis-à-vis d’HBV en diminuant les ARN viraux sans altérer leur épissage. De plus, nous avons identifié un composé (1C8), précédemment caractérisé comme un inhibiteur de la phosphorylation de SRSF10 comme pouvant exercer un fort effet anti-viral pan-génotypique (brevet N° EP18306398–DURANTEL18126AF). Des analyses biochimiques ont permis d’identifier les kinases CLK1, 2 et 4, responsables de la phosphorylation des protéines SR, comme les plus fortement inhibées par 1C8.  Dans l’ensemble ces résultats suggèrent que la forme dé-phosphorylée de SRSF10, induite lors du traitement par 1C8, est responsable de son effet anti-viral. Ils suggèrent aussi que l’activité de certaines kinases nucléaires, en particulier celles ciblées par 1C8, contrôle de façon critique la réplication d’HBV en modulant l’activité pro- ou anti-virale des RBP interagissant avec HBc. Les objectifs de ce projet sont : 1) d’identifier la(les) kinase(s) ciblées par 1C8 dans des hépatocytes ; 2) de caractériser l’activité antivirale de composés inhibant l’activité de cette (ces) kinase(s) in vivo. 3) d’analyser son (leurs) effets sur la phosphorylation d’HBc et ses fonctions dans le noyau, et 4) d’identifier de nouveaux facteurs pro- ou anti-viraux ciblés par cette (ces) kinase(s) dans des hépatocytes infectés par HBV. Ce projet permettra de déterminer comment des kinases nucléaires inhibent la réplication d’HBV, en particulier en contrôlant les activités nucléaires d’HBc, et de fournir des informations critiques pour le développement de nouvelles stratégies anti-virales.

Le virus de l’hépatite E (VHE), un virus à ARN positif, est la principale cause d’hépatite virale aiguë. VHE est reconnu comme un problème de santé publique dans les régions en développement. Il existe peu de données sur le rôle de la réponse immunitaire de l’hôte dans la pathogenèse de l’infection par le VHE. Nouveaux résultats d’études cliniques et épidémiologiques, associés à des taux élevés d’hépatite et de taux de mortalité élevés, ainsi qu’aux effets de la morbidité et de la mortalité maternelles. La réponse immunitaire innée est cruciale pour le confinement précoce de virus et joue un rôle clef pour la mise en place de la réponse adaptative spécifique.

En début de la grossesse humaine, les leucocytes tissulaires maternels présents dans la decidua sont représentés par une population majoritaire de cellules dNK (70%) et des macrophages deciduaux (20%). Ces cellules immunitaires innées ont un rôle clef dans la mise en place de l’interface mère-fœtus et dans le développement du placenta et du fœtus ainsi que dans la mise en place de la tolérance fœtale. Elles assurent également un rôle antimicrobien canonique pour la protection du fœtus contre les infections venant de la mère. 

Le projet de recherche de notre équipe vise à comprendre l’infection virale par l’hépatite E et la plasticité fonctionnelle des cellules immunitaires innées de l’interface mère-fœtus. Nous caractérisons tout d’abord l’impact de l’infection par le VHE sur la fonction des cellules stromales (trophoblastes, macrophages, cellules mésenchymateuses) à l’interface mère-fœtus. Définirons ensuite les mécanismes intrinsèques de contrôle / exacerbation de l’infection VHE. Enfin, nous déterminerons la plasticité fonctionnelle des cellules NK au niveau cellulaire et moléculaire, et nous analyserons l’impact de l’infection sur le dialogue entre les cellules NK et les macrophages.

Pour mieux étudier la réponse immunitaire au VHE, nous avons donc mis au point un modèle cellulaire innovant capable d’exprimer les protéines ORF2 et ORF3 du génotype 1 ou 3 du VHE. Nos préliminaires résultats montrent que les cellules NK sont capables de détecter le signal de stress dû à l’expression des protéines virales, de s’activer et d’enclencher leur fonction effectrice cytotoxique via la formation d’une synapse immunologique. Dans notre modèle de grossesse, nous avons également établi et créé un nouveau système d’expression de lentivirus qui permet la transduction de cellules tissus primaires avec une grande efficacité. Ces outils précieux vont nous permettre de mieux appréhender les questions posées sur le dialogue NK-macrophages et passer outre la difficulté de faible taux d’infection par VHE ex vivo.

En conclusion, ce projet nous permettra de disséquer l’interaction entre les composants immunitaires de l’hôte au cours de l’infection par le VHE et apportera de nouvelles informations pouvant aider à la compréhension de la pathogenèse du VHE pendant la grossesse.