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Plusieurs transmissions zoonotiques indépendantes ont généré les différents groupes phylogénétiques du VIH-1. Cependant, ces groupes n’ont pas connu le même succès épidémiologique. A savoir, le groupe M du VIH-1 est responsable de la pandémie, et le groupe O est le deuxième VIH le plus abondant, bien que son succès épidémiologique soit largement inférieur. Les raisons de cette différence ne sont que partiellement connues à ce jour. Ce projet est basé sur notre travail récent qui montre l’existence de différences substantielles entre les intégrases (IN) des groupes M et O du VIH-1.

En exploitant la diversité génétique naturelle existant parmi les isolats des groupes M et O, nous avons généré des IN chimères entre les isolats de ces groupes et caractérisé leur fonctionnalité. Nous avons identifié, dans le domaine C-terminal de l’enzyme, un nouveau motif fonctionnel N222K240N254K273, (motif NKNK) présent spécifiquement dans l’IN du groupe M (Kanja et al, en préparation, joint). Le motif est essentiel pour l’intégration : si le K ou le N sont supprimés, aucune intégration n’est observée. Des défauts sont trouvés à différentes étapes du cycle infectieux, principalement l’import nucléaire et la catalyse. Le motif est absent des isolats du groupe O où le motif N/K222Q240K254K273 (N/KQKK) est trouvé en place. Lorsque le motif N/KQKK est utilisé pour remplacer le motif original dans les isolats M, il affecte gravement l’infectivité. Remarquablement, dans les isolats O, à la place, le motif N / KQKQ peut être retiré sans affecter l’infectivité, soulignant une différence fonctionnelle claire entre les IN M et O. Nous avons aussi mis en évidence des défauts significatifs dans le “processing” du précurseur Gag-Pol contenant une IN chimère pour le domaine catalytique central (CCD), suggérant que la façon dont dimérisent les IN dans le contexte du précurseur Gag-Pol diffère dans les deux groupes. Sur la base de ces observations, nous définissons deux objectifs.

Objectif 1 : caractérisation du motif NKNK. Cet objectif sera atteint en utilisant quatre approches. (1) Nous avons généré des virus où nous avons remplacé dans l’IN M, le motif original NKNK par le motif O NQKK. Ces virus se répliquent très mal en culture. Cependant, après plusieurs passages, ils ont atteint un niveau d’infectivité comparable à celui des virus sauvages. Nous voulons maintenant les caractériser par séquençage, puis en utilisant des tests fonctionnels. Le but est d’inférer, à partir de l’emplacement des mutations compensatrices trouvées dans ces révertants, quelles régions de IN ou quelles autres protéines virales sont fonctionnellement liées au motif NKNK. Ces résultats permettront également d’aider à comprendre les bases moléculaires qui permettent à IN O de contourner le besoin du motif NKNK, améliorant notre compréhension des différences existant entre les groupes M et O. (2) L’approche 1 sera complétée par la seconde approche où, en générant des chimères d’IN, nous allons chercher la région de IN O qui rend ces intégrases fonctionnelles même en l’absence du motif NKNK. (3) Etude de la stabilité de la capside chez les virus mutés dans le motif NKNK, puisqu’ils présentent un nombre accru de capsides résidant dans le cytoplasme après infection. Ce travail pourrait fournir la première démonstration d’une implication directe de l’IN dans la stabilité de la capside virale aidant à caractériser cette cible prometteuse pour une stratégie antivirale. (4) Nous rechercherons si le motif participe à l’établissement d’une interaction directe entre l’IN et la chromatine (certains résidus du motif NKNK étant adjacents à des résidus récemment décrits comme étant impliqués dans ce processus).

Objectif 2 : IN et maturation virale. Nous étudierons comment les acides aminés du CCD qui diffèrent entre IN M et O influencent la maturation. Ceci vise à améliorer notre compréhension de l’organisation architecturale de la partie intégrase du précurseur Gag-Pol. Cela peut aider dans la conception de stratégies antivirales ciblant cet aspect du cycle infectieux plus efficacement que les stratégies actuelles qui présentent une barrière faible pour la génération de mutations de résistance.

L’histoplasmose disséminée est une infection fongique qui touche principalement les patients immunodéprimés et particulièrement les patients VIH en stade avancé, avec un taux de mortalité élevé en l’absence de traitement (16,8% en Guyane). En l’absence de diagnostic et donc de traitement, l’histoplasmose est une maladie mortelle. En Afrique subsaharienne (SSA) et dans les pays d’Afrique de l’Ouest, cette infection est rarement diagnostiquée en raison d’un manque d’informations sur l’épidémiologie, de formation et de sensibilisation insuffisantes du personnel de santé de première ligne, mais aussi en raison de caractéristiques cliniques très similaires à celles de la tuberculose. Le spectre clinique de l’histoplasmose est varié, allant d’une infection pulmonaire isolée à une infection disséminée avec atteinte des poumons, de la peau, des ganglions lymphatiques et/ou de la moelle osseuse.

Les méthodes de diagnostic classiques sont l’observation microscopique d’une levure à la morphologie évocatrice dans un échantillon biologique et la culture. Cependant, l’examen direct requiert une pratique régulière et les levures peuvent être confondues avec d’autres agents pathogènes. La culture, quant à elle, nécessite une incubation prolongée (souvent de 2 à 4 semaines), et implique, quand elle est positive, une manipulation dans un laboratoire de sécurité de niveau 3.

La mise en place d’outils de diagnostic non invasifs permettrait d’améliorer le diagnostic de l’histoplasmose chez les patients les plus exposés mais aussi d’évaluer la prévalence de cette infection fongique dans les pays Africains où les données sont encore insuffisantes. Les tests de diagnostic rapides (TDRs) tels que le TB Urinary-Lam pour le diagnostic de la tuberculose ou le CrAg Lateral Flow Assay pour le diagnostic de la cryptococcose ont démontré leur impact sur la prise en charge des pathologies associées aux patients VIH. Ces TDRs reposent sur des procédures simples et réalisables pour la plupart des centres de soins de santé primaires ou pour une utilisation au lit du patient dans les pays aux ressources limités. Dans les zones à forte prévalence du VIH et de la tuberculose, nous pensons qu’il est essentiel de mettre en œuvre de nouvelles méthodes de diagnostic pour une meilleure prise en charge des patients atteints d’histoplasmose.

Notre objectif est donc de tester deux nouveaux TDRs basés sur la détection urinaire, pour évaluer leurs performances et la prévalence de l’histoplasmose, sur des échantillons récoltés en Afrique (Afrique de l’Ouest et SSA), où la prévalence de l’infection à VIH et de la tuberculose est élevée. Ces TDRs ont une sensibilité (Se ³ 93 %) et une spécificité (Sp ³ 95 %) élevées dans des études menées au Mexique et en Colombie, et semblent très prometteurs. Il n’y a pas encore de données disponibles dans les pays Africains.

Nous nous intéressons plus particulièrement aux patients et aux échantillons Ivoiriens et Camerounais, puisque les histoplasmoses diagnostiquées en France concernent majoritairement des patients originaires de ces deux pays. Suite à la demande d’accès à la bio banque du projet STATIS (ANRS_12290), nous souhaitons évaluer ces TDRs sur cette collection d’échantillons. Cette collection répond en effet à nos critères pour l’évaluation d’une cohorte de terrain (grille STARD) et particulièrement les échantillons de patients sans diagnostics définitifs de tuberculose et ceux associés à une mortalité inexpliquée malgré le traitement antituberculeux administré.

En combinant ces nouveaux outils de diagnostic, une formation appropriée des cliniciens et des équipes de laboratoire et l’accessibilité aux traitements, la mortalité liée à l’histoplasmose pourrait être réduite.

L’Afrique de l’Ouest présente une prévalence d’hépatite B chronique supérieure à 6% de la population générale adulte mais moins de 10% des personnes vivant avec le VHB (PVHVB) éligibles ont accès à un traitement. En 2017, l’OMS a publié un appel à l’élimination de l’hépatite B d’ici 2030. Ce projet s’inscrit dans cette perspective qui passe par l’accès à un traitement pour plus de 80% des patients éligibles. Nous proposons d’évaluer la faisabilité et l’acceptabilité (Phase 1) puis l’efficacité (Phase 2) d’une stratégie simplifiée d’initiation du traitement antiviral couplée à un support communautaire afin d’améliorer la rétention dans les soins et la couverture thérapeutique de PVVHB en Côte d’Ivoire. La proportion de PVVHB effectivement retenues dans les soins à 12 mois constituera notre critère de jugement principal.

En amont de la Phase 2, phase expérimentale reposant sur un essai en cluster destiné à tester l’impact de ces interventions en contexte décentralisé, nous proposons de conduire une première analyse situationnelle au travers de différentes activités réparties sur une période de 12 mois et incluant : 1) un état des lieux de la prise en charge actuelle des PVVHB en zone décentralisée, en Côte d’Ivoire, via des visites et évaluation des sites pressentis (centres de santé secondaires) à participer à l’essai. Cette étape permettra de confirmer la faisabilité des interventions panifiées, identifier et valider la capacité de ces sites à participer à la phase 2 du projet, 2) des ateliers de présentation et de discussion de la Phase 2 afin d’échanger avec les soignants, agents de santé communautaire (ASC) et les associatifs sur l’acceptabilité des interventions proposées 3) l’élaboration d’une intervention communautaire pertinente au contexte, s’appuyant sur l’implication des ASC et de leur tutelle dans la lutte contre l’hépatite B et la prise en charge de PVVHB. En marge des ateliers et visites de sites prévues, des méthodes classiques de la recherche qualitative en sciences sociales seront mises en œuvre incluant : l’analyse documentaire, les entretiens semi-dirigés et les observations participantes. L’analyse documentaire de la littérature grise permettra d’abord d’identifier les principales politiques de santé sur les hépatites virales en Côte d’Ivoire ainsi que ses principaux acteurs. Puis une série d’entretiens sera effectuée auprès des ceux-ci (environ 15). Enfin l’organisation, à la fin de la Phase 1, d’une journée de restitution et d’échanges, avec les partenaires institutionnels à l’échelle nationale (Ministère de la santé, Programme National de Lutte contre les Hépatites – PNLH, associations de patients, sociétés savantes) permettra d’améliorer l’acceptabilité des stratégies évaluées dans la Phase 2 par les pouvoirs publics et de favoriser leur mise en place en Côte d’Ivoire, si leur efficacité est démontrée.

Au-delà de documenter précisément la prise en charge actuelle de PVVHB et l’état de la lutte contre l’hépatite B en zone décentralisée en Côte d’Ivoire, cette phase 1 permettra de développer et proposer une intervention innovante d’implication des ASC dans la prise en charge de PVVHB mais aussi dans la prévention et la lutte contre l’hépatite B de manière plus générale; intervention qui pourrait inspirer des initiatives dans d’autres contextes à forte endémicité où le maillage des ASC sur le territoire est similaire à celui de Côte d’Ivoire. Cette phase 1 permettra également d’actualiser les données existantes sur les connaissances des soignants, et sur les représentations et le vécu de PVVHB en Côte d’Ivoire, issues, pour la plupart, de recherches conduites il y a plus d’une décennie, et/ou principalement centrées sur Abidjan, qui ne documentaient donc pas la situation actuelle en zone décentralisée. À terme, il permettra d’informer sur l’impact d’un traitement antiviral précoce et élargi dans l’amélioration de la prise en charge de PVVHB et apportera des éléments probants, supportant au même titre que pour l’infection à VIH, la gratuité du traitement antiviral pour les PVVHB (essai plaidoyer).

De nombreux aspects du trafic intracellulaire du virus de l'hépatite B (VHB) restent méconnus. La voie d'entrée du
virus, qui est l'un des axes principaux de l'infection est encore à l'étude. Bien que les récepteurs du VHB aient été
identifiés, les mécanismes moléculaires impliquant l'entrée du VHB par ses récepteurs restent inexplorés. Le lieu
d'interaction entre le VHB et NTCP n'est pas connu. Les mécanismes d'interaction du virus avec l'EGFR restent peu
clair. Nos expériences préliminaires ont établi que le virus modulait des filopodes pour atteindre la membrane
plasmique des cellules. Durant ce projet, nous utiliserons des techniques d’imagerie en temps réel utilisant des VHB
fluorescents, pour décrypter les premiers mécanismes d'entrée du virus à l'intérieur des hépatocytes. Nous déterminerons le rôle des filopodes dans les processus d'entrée du virus. A travers nos études identifierons les partenaires protéiques modulés par le virus qui conduiront à sa capture par les filopodes, nous
déterminerons le rôle de HSPG, NTCP ou EGFR dans la fixation des virus aux filopodes, de plus nous décrypterons
les mécanismes médiant l'internalisation du VHB au sein des cellules hépatocytaire.

Les récentes avancées en génomique, portées par des innovations algorithmiques en théorie des graphes, permettent la gestion, l’exploitation et l'intégration de données génétiques dans des pan-génomes de manière efficace. Cela permet la création d'outils bioinformatiques capables d’appréhender la complexité des génomes.

Les navigateurs de génomes (genome browsers) permettent d’organiser , diffuser et visualiser de grandes quantités de données omiques complexes, permettant aux chercheurs de bénéficier du partage des connaissances et de la collaboration grâce à des ressources informatiques efficaces. Les navigateurs de génomes sont généralement basés sur une séquence de référence unique. Toutefois, en raison de l'hétérogénéité génétique chez les virus tels que le virus de l'hépatite B (VHB), les chercheurs travaillent souvent indépendamment, se concentrant sur différents génotypes.

Les pan-génomes en graphe apportent une solution élégante à ce problème en permettant l’intégration de la diversité génétique d’une espèce. Ils offrent également plusieurs avantages, y compris une détection améliorée des variations rares dans les souches virales, une meilleure description des variations structurelles rares et une représentation précise des mutations au sein des populations.

Pour faciliter la recherche collaborative, nous proposons de développer des navigateurs de génomes personnalisés et performants en collaboration avec les biologistes spécialistes du VHB afin d’adjoindre les fonctionnalités et données les plus pertinentes.

Le projet est divisé en trois étapes, aboutissant à trois navigateurs de génomes différents d'un niveau de complexité croissant :

1. Un navigateur de génome linéaire pour le génotype D ayw, accessible via une interface web et incluant des données génomiques, transcriptomiques et autres données omiques pertinentes.

2. Un navigateur de pan-génome linéaire personnalisé fondé sur un pan-génome du VHB construit à partir de données de séquençage assemblées disponibles dans la base de données open source HBVdb. Ce navigateur sera complété par des données omiques compatibles et accessible via une interface web.

3. Un navigateur de pan-génome circulaire représentant la vue la plus proche possible du génome du VHB, complété par toutes les informations omiques pertinentes disponibles et compatibles.

En développant ces navigateurs de génomes, le projet entend relever les défis posés par l'absence d'une séquence de référence universelle et l'exploitation de données omiques disparates. Les outils résultants ont vocation à encourager la coopération et à harmoniser les connaissances acquises, améliorant ainsi les résultats de recherche dans le domaine du VHB.

Tout comme l’ADN ou les protéines, l’ARN est soumis à de nombreuses modifications chimiques, en particulier, les ARN viraux du VIH-1 contiennent les modifications m6A, m5C et 2′-O-Met. Même si une cartographie de ces modifications n’est pas établie de manière claire et précise, des modifications m6A et m5C sur l’ARNm du VIH-1 ont été préalablement identifiées au niveau du site de décalage du cadre de lecture entre Gag et Pol. Le VIH-1, comme beaucoup de rétrovirus, utilise un décalage du cadre de lecture programmé en -1, (-1 PRF) pour générer les protéines Gag et Gag-Pol, celui-ci est donc essentiel pour la réplication virale. Cependant, l’abondance des ribosomes sur l’ARNm est un facteur susceptible d’altérer l’efficacité du -1PRF. De manière générale, la distribution des ribosomes le long d’un ARNm, déterminée par la faible vitesse d’initiation par rapport à l’élongation, permet d’éviter les collisions. Néanmoins, des changements dans les vitesses d’initiation ou d’élongation peuvent altérer la fréquence de collisions, ce qui peut affecter de manière significative le frameshift programmé et donc l’expression de la polyprotéine Gag-pol. La modification m6A étant capable de ralentir ponctuellement le ribosome, il est possible que l’état de modification d’un ARNm soit un facteur de régulation de sa traduction.

Notre projet a pour but dans un premier temps de vérifier et caractériser la présence des modifications dans le génome du VIH en utilisant la technique de séquençage par nanopore qui permet de séquencer entièrement et de manière directe les molécules d’ARN. Afin de déduire la présence de sites portant des modifications, les molécules d’ARNm seront extraites de lymphocytes T CD4 + infectés par le VIH-1 et leur séquençage sera comparé à celui des mêmes molécules d’ARN mais transcrites in vitro et donc non modifiées. Dans un deuxième temps, afin de déterminer si les modifications de l’ARNm du VIH-1 peuvent jouer un rôle dans la vitesse de traduction et l’efficacité du frameshift, nous utiliserons la technique de ribosome profiling afin de comparer la densité des ribosomes et leur position sur les ARNm modifiés et non modifiés. Cela me permettra également de définir la phase de lecture de chaque ribosome en cours de traduction et son temps de résidence sur chaque codon. En complément nous utiliserons des systèmes rapporteurs afin de quantifier in vitro l’efficacité du décalage de cadre de lecture en -1 sur des ARNm modifiés et non modifiés. Afin d’aller plus loin dans la compréhension du rôle des modifications de l’ARNm sur la traduction, nous utiliserons une approche permettant l’étude de la traduction en molécule unique. Grâce à ce système, nous obtiendrons une quantification précise du déplacement du ribosome sur l’ARNm du VIH-1 avec ou sans modifications et en particulier au niveau du site de décalage du cadre de lecture en -1.

L’objectif de ce projet est donc d’étudier de manière complète le rôle des modifications de l’ARNm du VIH-1 dans l’expression des gènes viraux et dans la réplication du virus. Cela pourrait faire naître de nouvelles cibles thérapeutiques parmi les enzymes responsables de ces modifications capables d’impacter la pathogénicité du VIH-1.

De nombreuses études ont montré que le niveau de méthylation de certains marqueurs du génome de l’hôte était associé à la sévérité des lésions cervicales HPV-induites. Le projet MethAID vise à évaluer la faisabilité et la valeur prédictive de l’analyse de marqueurs de méthylation de l’ADN de l’hôte sur auto-prélèvements vaginaux (APV) dans le cadre du dépistage du cancer du col de l’utérus chez des patientes atteintes de maladies auto-immunes (MAI), souvent immunodéprimées du fait de leur pathologie ou de leurs traitements immunosuppresseurs.

Objectifs principaux et secondaires

L’objectif principal est de déterminer le caractère prédictif du niveau de méthylation de gènes spécifiques (FAM19A4, miR124-2) pour la sévérité des lésions cervicales précancéreuses.
Les objectifs secondaires incluent :

• l’automatisation de l’analyse des marqueurs de méthylation sur APV
• la caractérisation du niveau basal de méthylation dans cette population particulière
• la comparaison de la performance de ces marqueurs aux techniques conventionnelles (cytologie, typage HPV)
• l’évaluation de leur pertinence en dépistage primaire ou en outil de triage après test HPV

Contexte scientifique

Les femmes atteintes de MAI présentent un surrisque majeur de cancers HPV-induits. Ce risque est multiplié par 8,7 dans le lupus érythémateux systémique (LES) pour les lésions de haut grade et par 4 pour le cancer invasif. Des risques accrus sont également observés dans la polyarthrite rhumatoïde. Par ailleurs, l’adhésion au dépistage est souvent insuffisante dans cette population (≈ 50 % de patientes à jour).

Les APV représentent une alternative intéressante au frottis cervico-utérin (FCU) classique, en améliorant l’accessibilité et l’acceptabilité du dépistage. Toutefois, ils ne permettent pas d’analyse cytologique réflexe en cas de test HPV positif, générant un parcours plus complexe pour les patientes. L’ajout de marqueurs de méthylation automatisés sur APV constituerait donc une avancée majeure, permettant de limiter le recours itératif aux colposcopies tout en rassurant les patientes.

Hypothèses de travail

• Le niveau de méthylation mesuré sur APV est corrélé à la sévérité des lésions cervicales
• L’automatisation de ces tests est techniquement réalisable et indispensable à une intégration en dépistage de masse
• Les seuils de méthylation observés en population générale pourraient ne pas être applicables aux patientes atteintes de MAI, nécessitant une réévaluation spécifique

Méthodologie

L’étude MethAID est conçue comme une étude ancillaire de la cohorte APOSY (276 patientes, Hôpital Bichat-Claude Bernard), qui documente la prévalence et la persistance des infections HPV dans les MAI.

Au total, 381 prélèvements APV seront analysés :

• 276 à l’inclusion (dont 55 HPV-HR positifs),
• 50 en double analyse manuelle vs automatisée,
• 55 issus du suivi à 1 an pour évaluer la persistance virale et la dynamique des marqueurs de méthylation.

Les données de méthylation seront exprimées en log2(Ct ratio), comparées aux résultats virologiques et cytologiques, puis intégrées dans des modèles statistiques uni- et multivariés (tests de Wilcoxon, modèles de Cox).

Aspects éthiques

Le protocole respecte les dispositions approuvées par le CPP (NCT06302725, IRB Île-de-France XI), incluant la conservation des échantillons pour analyses ultérieures.

Retombées attendues

Le projet MethAID devrait :

• démontrer la faisabilité technique de l’automatisation de la méthylation sur APV
• fournir les premières données spécifiques aux patientes atteintes de MAI
• permettre de vérifier l’applicabilité des seuils de méthylation
• initier une stratégie innovante de dépistage personnalisé pour cette population à haut risque, réduisant les consultations inutiles et le stress lié aux résultats HPV positifs