Projets et candidats lauréats

La majorité des maladies émergentes infectieux (MIE) sont d’origine zoonotique et 70 % sont causés par des agents pathogènes provenant de la faune sauvage. L’épidémie actuelle de COVID-19 avec le virus SRAS-CoV2 illustre clairement les conséquences d’une seule transmission inter-espèce avec un coronovirus (CoV), infectant plus d’un million d’individus et conduisant à un blocage de 4 milliards de personnes dans le monde entier en quelques mois seulement. Les chauves-souris sont à l’origine de CoVs humains, soit directement, soit par un hôte intermédiaire. Les contacts entre l’Homme et les chauves-souris sont variés et augmentent avec les changements environnementaux et climatiques, comme l’exposition directe au sang ou aux tissus infectés par la chasse, ou l’exposition indirecte aux fruits contaminés par leur salive, leur urine ou leurs excréments. Une grande diversité d’espèces de chauves-souris sont chassées en Afrique de l’Ouest et centrale. Par conséquent, il est maintenant plus que crucial de documenter la prévalence et la diversité génétique des coronavirus chez les chauves-souris.

L’objectif général du projet est de documenter des coronavirus circulants chez les chauves-souris dans les pays africains avec une forte probabilité d’émergence d’infections zoonotiques à partir de chauves-souris. Les objectifs spécifiques sont (i) documenter la diversité génétique et l’évolution des coronavirus chez les chauves-souris Africains; (ii) développer un essai sérologique à haut débit pour étudier les anticorps à différents coronavirus et estimer la prévalence des coronavirus chez différentes espèces de chauves-souris et (iii) étudier la saisonnalité de l’excrétion de coronavirus chez les chauves-souris.

Par nos études antérieures menées en Guinée, au Cameroun, en République démocratique du Congo (RDC) et Zimbabwe, nous avons déjà des échantillons de >10 000 chauves-souris dans leur habitat naturel disponibles (sang sur papier buvard, écouvillons oraux et anaux et échantillons fécaux. Le dépistage rétrospectif de la présence de coronavirus se fera en amplifiant et en séquençant un fragment de 440bp de RdRp. Sur un sous-ensemble d’échantillons, des efforts supplémentaires de séquence seront faits pour obtenir des séquences dans les gènes qui sont importants pour les essais sérologiques (gènes S et/ou N) ou des génomes complets en utilisant la technologie MinION. Nous utiliserons un essai sérologique à haut débit (approche Luminex) pour détecter les anticorps contre les coronavirus (SRAS-CoV1, SRAS-CoV2, MERSV, ..). Des échantillons provenant de colonies de chauves-souris au Cameroun et Guinée, prélevés au cours d’un suivi mensuel sur une période d’un an seront analysés pour la présence d’ARN viral et pour les anticorps dans les échantillons de DBS pour documenter la saisonnalité de l’excrétion virale dans différentes espèces.

Dans l’ensemble, cette étude fournira rapidement des informations clés sur la diversité génétique des coronavirus chez les chauves-souris en Afrique et des estimations sur leur prévalence. Il s’agit de la première étude à grande échelle en Afrique qui utilisera les mêmes techniques moléculaires et sérologiques afin de pouvoir comparer les résultats par région géographique et par espèce. L’étude apportera des informations importants sur la proportion de chauves souris qui excrètent le virus, ceux qui ont éte infécté et sur les saisons qui sont les plus à risque pour les transmissions zoonotiques. Les informations obtenues par ce projet contribueront également à l’élaboration d’une plate-forme diagnostique qui peut inclure un panel d’antigènes couvrant autant que possible la diversité des coronavirus pour identifier rapidement la circulation des nouveaux coronavirus chez l’homme ainsi que le développement de vaccins à large spectre. De même, des renseignements supplémentaires sur les cibles des médicaments antiviraux pour une grande diversité de coronavirus ayant un potentiel zoonotique seront utiles pour identifier l’activité des antiviraux.

Contexte: L’infection chronique par le virus de l’hépatite C (VHC) est la principale cause de développement de la maladie hépatique, de la cirrhose ainsi que du cancer du foie (carcinome hépatocellulaire (CHC) dans le monde. Il existe aujourd’hui des antiviraux capables de guérir l’infection chronique par le VHC, les antiviraux à action directe (AAD). Cependant, les stratégies thérapeutiques pour éviter la progression de la maladie hépatique et du CHC sont absentes, ce qui est problématique puisque l’éradication du virus n’empêche pas le risque de la progression de la maladie hépatique surtout chez les patients ayant développé une fibrose avancée. Les stratégies thérapeutiques pour éviter ou soigner la maladie hépatique ainsi que le CHC sont insuffisantes, ceci étant due à la mauvaise connaissance de la complexité de la maladie.  De ce fait, l’identification de gènes associés au développement du CHC est essentielle afin de caractériser la progression de la maladie hépatique et du CHC et pour identifier des cibles thérapeutiques pour éviter et soigner le CHC.

Résultats préliminaires: En utilisant une signature d’expression génique de 186 gènes permettant de prédire le risque de développer un CHC dans un modèle cellulaire que nous avons développé, nous avons découvert que la protéine transmembranaire Claudin-1 (CLDN1) est un gène important pour la carcinogénèse hépatique dont le mécanisme reste encore peu connu. De plus, les changements induis par CLDN1 au niveau transcriptionnel peuvent êtres réprimés en utilisant un anticorps monoclonal spécifique anti-CLDN1 développé par notre équipe.

Objectifs: En se basant sur le risqué élevé de développer une maladie hépatique et ainsi qu’un CHC chez les patients infectés par le VHC et considérant la nécessité de comprendre les gènes et voies de signalisations impliqués dans le processus, nous aimerions déterminer les mécanismes moléculaires d’action induis par CLDN1 qui favorisent la carcinogénèse hépatique.

Méthodes: Pour comprendre comment une protéine membranaire telle que CLDN1 peut induire des changements transcriptionnel, nous devons déterminer les sont les voies de signalisations impliquées. Afin de répondre à cette question, nous aimerions identifier les protéines qui interagissent avec CLDN1 au niveau de la membrane basolatérale de l’hépatocyte par co-immunoprécipitation. Aussi, nous aimerions identifier le domaine protéique de CLDN1 impliqué dans la signalisation induite par CLDN1. Pour ce faire, nous allons générer des mutants de CLDN1 qui vont être utilisés pour établir des lignées cellulaires hépatiques portant une inactivation génique pour CLDN1. Ces cellules vont être utilisées pour étudier l’effet de l’inactivation de CLDN1 sur l’expression de la signature génique des 186 gènes mais également sur les voies de signalisation cellulaire impliquées dans le CHC ainsi que la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) des cellules. Pour déterminer si les voies de signalisation Ephrin et Hedgehog sont impliquées, nous allons effectuer des analyses immunoblots sur des foies de souris traités avec l’anticorps monoclonal spécifique anti-CLDN1 en plus d’un anticorps contrôle. De plus, nous allons également étudier l’effect de l’environemment tumorale hépatique en générant des sphères de tumeurs ou «tumorspheres» à partir de tissus hépatiques humains, tumoraux ou adjacent à la tumeur et préalablement traités avec l’anticorps monoclonal spécifique anti-CLDN1 ou avec l’anticorps contrôle, provenant de patients ayant développé un CHC. Ces sphères seront analysées par RNA-Seq. En dernier lieu, afin de déterminer le role de CLDN1 dans la TEM des cellules, nous allons évaluer par immunoblot et PCR quantitative l’expression de marqueurs spécique de la TEM in dans des cellules préalablement traitées avec l’anticorps monoclonal spécifique anti-CLDN1 ou avec l’anticorps contrôle.

Résultats attendus: Nous anticipons de découvrir les mécanismes moléculaires d’action de CLDN1 la carcinogénèse hépatique. De plus les résultats de cette étude vont permettre l’identification de cibles thérapeutiques pour traiter la maladie hépatique ainsi que le CHC ainsi par l’infection par le VHC.

Le virus de l’hépatite E (HEV) est le 1er agent viral d’hépatite à l’échelle mondiale. Il peut être responsable d’une hépatite E chronique, définie par la persistance du virus pendant plus de 3 mois, chez les patients immunodéprimés. Des virus recombinants ayant incorporé des fragments de gène humain dans la région riche en proline (PPR) de leur génome ont été décrits au cours des infections chroniques. Ces fragments de gène humain possédaient une origine variée : protéine ribosomale S17, S19, tyrosine aminotransférase, inter alpha trypsine inhibiteur et favorisaient la réplication du HEV in vitro. Les mécanismes conduisant à cet avantage réplicatif comparativement au virus dépourvu du fragment humain sont actuellement inconnus.

L’objectif de ce projet est d’étudier le(s) mécanisme(s) conférant un avantage réplicatif aux virus recombinants ayant incorporé un fragment de gène humain.

 Dans la première partie de ce projet (semestre 1 et 2), nous allons étudier l’impact de 7 fragments humains récemment identifiés par notre équipe à l’aide d’une technique de séquençage haut-débit (SMRT PacBio). Les différents fragments seront insérés dans la PPR du plasmide codant pour le virus Kernow, principale souche de laboratoire utilisée pour l’étude du HEV. Le plasmide Kernow sans fragment humain sera utilisé comme contrôle. Après transcription in vitro, l’ARN obtenu sera transfecté dans la lignée cellulaire hépatique HepG2/C3A. Le stock viral obtenu après transfection sera utilisé pour infecter la lignée cellulaire hépatique HepG2/C3A. La capacité réplicative de chaque virus recombinant sera évaluée par quantification par RT-qPCR de l’ARN viral dans le surnageant de culture. Le nombre de foyers infectieux à J5 sera déterminé par immunofluorescence. Ces résultats seront confirmés sur des cellules d’hépatocytes primaires. L’impact de ces fragments humains sur le franchissement de la barrière d’espèce sera également étudié en introduisant ces fragments de gène humain dans une souche de génotype 1, génotype strictement humain. La capacité de ces virus recombinant à infecter des lignées cellulaires animale LLC-PK (rein de porc) et OHH1.Li (foie de biche) sera étudiée.

La deuxième partie de ce projet (semestre 3 et 4) vise à identifier les protéines interagissant avec la PPR. La région codant pour la PPR des virus recombinants possédant un avantage réplicatif sera amplifiée en utilisant une amorce permettant d’ajouter un tag HA et introduite dans un vecteur d’expression. Le plasmide sera ensuite transfecté dans la lignée cellulaire HepG2C3A. La protéine PPR sera concentrée par immunoprécipitation à l’aide de billes magnétiques coatés avec un anticorps anti-HA. Les protéines interagissant avec la PPR seront séparées par migration sur un gel SDS-PAGE et identifiées par spectrométrie de masse. L’identité des partenaires d’interaction sera confirmée par des approches de knock-down et surexpression pour mettre en évidence la perte/le gain d’avantage réplicatif en l’absence ou en présence de la cible de la PPR.

Ce projet permettra :

• de décrire le rôle de la PPR dans le cycle de réplication du HEV
• de déterminer l’impact de ces fragments humains dans le franchissement de la barrière d’espèce
• de préciser les mécanismes conduisant à l’amélioration de la capacité réplicative du HEV en présence de fragments de gènes humains.

            La vaccination fait partie des moyens de prévention de certaines infections sexuellement transmissibles proposés aux hommes ayant des relations sexuelles avec des hommes (HSH). En raison des risques auxquels ils sont exposés, les recommandations vaccinales françaises préconisent que les HSH se vaccinent contre l’hépatite B, l’hépatite A et, pour les moins de 26 ans, contre les infections à papillomavirus humains (PVH). Les données de couvertures vaccinales et les études sur les déterminants du recours à la vaccination chez les HSH sont peu nombreuses en France, pays par ailleurs caractérisé par une défiance de la population générale envers les vaccins, alimentée par des controverses multiples.

     L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre les freins et leviers du recours à la vaccination chez les HSH en France. Il porte plus spécifiquement sur les vaccinations contre l’hépatite A, l’hépatite B et les infections à PVH. Les objectifs secondaires sont : 1) d’estimer les couvertures vaccinales déclarées pour ces trois vaccins et, parmi les personnes non vaccinées, la prévalence de l’intention de se faire vacciner ; 2) d’estimer la prévalence de l’hésitation vaccinale (i.e., avoir déjà refusé, retardé ou accepté un vaccin tout en ayant des doutes sur cette vaccination) dans cette population, la part des personnes hésitant vis-à-vis des trois vaccins considérés dans cette étude, et les motifs de cette hésitation ; 3) d’étudier les facteurs associés au fait d’être vacciné (ou d’avoir l’intention de se faire vacciner) et à l’hésitation vaccinale liée spécifiquement à ces trois vaccins, en s’intéressant plus particulièrement : i) à certaines connaissances, croyances et perceptions (vis-à-vis des vaccins, de la prévention diversifiée du VIH…) ; ii) aux antécédents médicaux et aux pratiques sexuelles ; iii) aux facteurs liés au système et aux professionnels de santé ; iv) aux caractéristiques démographiques, économiques et sociales ; v) au niveau de confiance accordé aux autorités de santé et à la médecine conventionnelle et au degré d’implication des individus dans les décisions de santé.

     Ce projet sera mené par une équipe pluridisciplinaire incluant des chercheurs en santé publique, en sociologie et des experts de Santé publique France.

     Ce projet repose sur une méthodologie innovante associant 1) une enquête quantitative administrée sur support digital (sites de rencontre gay sur internet, réseaux sociaux…) auprès d’environ 15 000 à 18 000 personnes, selon le retour d’expérience de précédentes enquêtes de ce type ; 2) une enquête qualitative par entretiens individuels semi-directifs menés auprès d’une trentaine de personnes ayant répondu à l’enquête quantitative ; 3) un recueil de données issues des carnets de vaccination auprès d’environ 800 personnes ayant répondu à l’enquête quantitative, ceci afin d’estimer la qualité des données déclarées de comportement de vaccination ou non. Ce projet sera réalisé sur une période de 36 mois. La 1ère année sera consacrée à l’élaboration du questionnaire de l’enquête quantitative et des demandes d’autorisations, à la définition de la stratégie de diffusion du questionnaire et à la réalisation d’une enquête pilote auprès d’une trentaine de personnes. La 2ème année du projet sera consacrée à la collecte des données quantitatives et qualitatives et à la préparation des bases de données. La 3ème année sera consacrée à la réalisation des analyses statistiques, à l’analyse des entretiens qualitatifs et à la valorisation des résultats de l’enquête.

     Les résultats de ce projet devraient permettre d’avoir une meilleure connaissance et compréhension des comportements et des processus de décisions vis-à-vis de la vaccination contre les hépatites B et A et contre les PVH parmi les HSH en France. Ces résultats sont essentiels pour guider les décisions et les choix des pouvoirs publics, des professionnels de santé et des acteurs impliqués dans la prévention auprès de ce public, en matière de stratégies d’intervention et de contenu des actions afin de promouvoir et faciliter l’accès à ces vaccins en tenant compte des besoins et attentes des personnes.

Les infections causées par le virus de l’hépatite C (VHC) sont toujours un problème majeur de santé publique, avec quelque 71 millions de personnes chroniquement infectées, causant la mort de 399000 d’entre elles en 2016. Des antiviraux à action directe ont été développés contre le VHC et permettent aujourd’hui des taux de guérison de 95%. Cependant, l’éradication du VHC sera difficile car l’infection est initialement asymptomatique, il n’ y a pas de vaccin et les traitements sont très coûteux. De fait, l’incidence de cancers associés au VHC continue à augmenter. Enfin, le VHC est devenu un excellent modèle de recherche fondamentale sur les virus à ARN, particulièrement les virus à ARN simple brin de polarité positive. Récemment, l’équipe de Volker Lohmann a publié une étude remarquable sur une souche de HCV de génotype 1b isolée d’un sérum à fort titre viral d’un patient ayant subi des transplantations de foie (German liver transplant 1, GLT1). Cet isolat post-transplantation a montré une haute efficacité de réplication en culture cellulaire. Après adaptation à la production de particules infectieuses in vitro, cette souche était toujours infectieuse in vivo, contrairement aux autres souches de HCV adaptées à la culture cellulaire.

De nouvelles données non publiées obtenues dans le cadre d’une collaboration entre les équipes Lohmann et Bressanelli ont identifié la protéine NS5A, et possiblement son interaction avec NS5B, comme étant à l’origine des propriétés particulières de GLT1. Nos résultats préliminaires ouvrent une toute nouvelle perspective sur les interactions établies par NS5A et pourraient contribuer à résoudre plusieurs énigmes sur la réplication du VHC. Ainsi, nos objectifs dans ce projet sont:

– Objectif 1 : une étude biophysique et structurale de peptides de NS5A définis à partir des résultats sur GLT1 et d’autres isolats post-transplantation et à partir de modélisations avancées utilisant AlphaFold.

– Objectf 2 : Des structures cristallographiques en phases cubiques lipidiques. Le construit envisagé a aussi été défini grâce à AlphaFold et devrait permettre à NS5A de s’assembler dans cet environnement mimant une membrane.

– Objectif 3 : La structure cristallographique en phases cubiques lipidiques du complexe NS5A-NS5B.

– Objectif 4 : Finalement, de nouvelles modélisations avancées de NS5A-NS5B de souches hyperréplicatives, modélisations appuyées sur les résultats structuraux des objectifs 1-3.

Contexte et objectif du programme ALSO : Le programme « Au labo sans ordo » (ALSO) a pour objectif d’augmenter la couverture du dépistage du VIH, afin d’améliorer le premier palier de la cascade de prise en charge du VIH. L’augmentation insuffisante du dépistage en laboratoires malgré les recommandations, la saturation du dispositif de dépistage dédié et communautaire conduisent à proposer cet élargissement de l’offre et la facilitation de l’accès. La mise en œuvre d’ALSO s’appuie sur l’hypothèse qu’une offre de dépistage du VIH gratuite, proposée dans tous les laboratoires de biologie médicale (LBM) de ville, sans rendez-vous ni prescription préalable et associée à une communication ciblée sur l’offre augmentera de manière significative la couverture du dépistage. Le programme est expérimenté pendant 12 mois à compter du 1/07/2019 dans les LBM des départements de Paris et des Alpes-Maritimes dans lesquels 50 000 et 15 000 tests supplémentaires sont attendus. L’offre s’adresse à toute personne majeure assurée (régime général et AME) quel que soit son lieu de résidence et à Paris également aux personnes non assurées. Assurée par une plate-forme de « navigateurs » des COREVIH partenaires, une offre de prise de rendez-vous immédiat est proposée aux personnes diagnostiquées positives.  

La présente demande porte sur l’évaluation, dans la perspective d’une décision des autorités sanitaires d’arrêt, de pérennisation et/ou de généralisation au territoire national. Le projet a été préparé dans le cadre du contrat d’initiation accepté par l’ANRS au premier semestre 2019. Il est financé par l’Assurance Maladie, les ARS concernées et les collectivités territoriales pour la communication.    

Méthodes 

L’évaluation est fondée sur la triangulation d’informations provenant de dispositifs statistiques ou de surveillance existants et d’enquêtes spécifiques.   

Pour documenter le fonctionnement et la contribution de ALSO à l’augmentation globale du dépistage dans chaque département, le programme comporte 5 études :   

ALSO_Activité s’attache à documenter l’évolution des recours au dépistage pour mesurer l’augmentation en volume et identifier les phénomènes de déplacement entre les offres. Cette étude recouvre un monitoring mensuel des tests en laboratoire rapportés par les laboratoires via une plateforme numérique (ALSO et prescrits) et la description mensuelle détaillée des tests remboursés par l’Assurance Maladie dans les deux régions. La PrEP, qui apporte une contribution majeure à la prévention et contribue à augmenter le volume des tests, sera également documentée par l’Assurance Maladie.  

ALSO_Usagers : une enquête réalisée sur une semaine, à 6 mois d’intervalle, auprès des personnes faisant un test VIH (ALSO, un test prescrit ou un test en CEGIDD) pour décrire le profil des usagers, l’historique du dépistage et les circonstances du test. Cette enquête reposera sur la passation d’un auto-questionnaire unique et simple.  

ALSO_Parcours : Les « navigateurs » documentent auprès des cliniciens les caractéristiques des personnes séropositives et les délais d’entrée dans le soin et d’initiation du traitement. 

ALSO_Laboratoires : Les laboratoires documentent en continu les événements indésirables survenant au cours de l’expérimentation ainsi que l’évaluation à 12 mois par les biologistes des différentes composantes, charges et contraintes de la réalisation d’ALSO.  

ALSO_ECO a pour objectif de calculer et de comparer le coût réel par test VIH positif (pour chacune des offres de dépistage du VIH (tests avec et sans prescription en laboratoire, CeGIDD et actions communautaires) dans les départements de Paris et des Alpes Maritimes. 

Aspects réglementaires 

Les études ALSO Usagers et ALSO Parcours sont en conformité avec la méthodologie de référence MR004. Les déclarations réglementaires sont en cours à la date du dépôt du projet à l’ANRS. 

Aspects statistiques 

Les analyses statistiques de chaque étude, stratifiées en premier lieu sur le département, seront menées selon des stratégies définies en commun.   

Les héparanes sulfates protéoglycanes (HSPGs) sont un des composant majeurs de la matrice extracellulaire et sont impliqués dans les infections de plusieurs virus où ils jouent un rôle pendant l’entrée et/ou le relargage. L’enzyme héparanase (HPSE) est la seule endo-bêta-D-glucuronidase capable de dégrader les chaînes d’héparane sulfate (HS) des HSPGs et est donc importante pour la régulation de l’homéostasie de la matrice extracellulaire. L’expression de l’HPSE est étroitement régulée car un clivage incontrôlé des HS peut entraîner une activation cellulaire anormale et des lésions tissulaires importantes. La surexpression de l’HPSE corrèle avec différents scénarios pathologiques (migration cellulaire, inflammation, angiogenèse) et est observée dans les cancers. Curieusement, l’HPSE a également été documentée comme étant impliquée dans de nombreuses infections virales, par exemple, HSV-1, HPV, RSV et même SARS-CoV-2. De plus, nous avons récemment démontré que le VHC induit une surexpression de l’HPSE qui de son côté favorise l’infection. En raison du rôle pro-cancérogène indéniable de l’HPSE, plusieurs inhibiteurs de cette enzyme ont été développés. L’un d’eux, l’oligosaccharide sulfaté PI-88, a même atteint les phases II et III dans des études cliniques.

Nous avons émis l’hypothèse que puisque la HPSE est également impliquée dans la réplication des virus, son inhibition par des composés spécifiques agissant sur la HPSE devrait entraîner une inhibition de l’infection. En effet, nous avons déjà montré que le PI-88 est capable de diminuer l’infection par le VHC de manière dose-dépendante. Avec le projet actuel, nous visons à étendre notre étude sur VHC à d’autres virus très importants pour la santé publique, tels que le VIH-1 et le VHB, afin de révéler si l’HPSE peut également jouer un rôle dans leur cycle infectieux mais aussi d’évaluer l’effet antiviral du PI-88. Nos résultats préliminaires ont montré une très forte inhibition de l’infection par VIH-1 par PI-88 en culture cellulaire. Une inhibition significative de l’infection par le VHB a également été observée. D’autres virus seront inclus dans l’étude pour montrer si le médicament a un effet pan viral.

 Si les résultats obtenus au cours du projet sont en faveur d’un puissant inhibiteur agissant sur différents virus, une réorientation rapide du PI-88 peut être envisagée. A cet égard, les inhibiteurs de l’HPSE peuvent être considérés comme de puissants antiviraux et pourraient être utilisés chez les patients atteints d’un cancer et d’infections virales chroniques (VHB, VIH-1) mais aussi chez les patients co-infectés VIH-1/VHB. A terme, le développement d’une nouvelle classe d’antiviraux ciblant une protéine cellulaire pourrait atténuer les problèmes de résistance avec les thérapies antirétrovirales actuelles.