Projets et candidats lauréats

Les traitements couramment utilisés contre l’hépatite B chronique (CHB) sont capables d’induire efficacement la suppression virale chez la majorité des patients. Cependant, à cause de l’incapacité de ces traitements à éliminer totalement le virus des hépatocytes infectés, une thérapie à long-terme est nécessaire pour maintenir l’infection sous contrôle. Cette persistance contribue considérablement au risque d’hépatocarcinogenèse et de décès dus à des affections hépatiques provoqués par le virus de l’hépatite B (VHB). De nouvelles approches thérapeutiques sont donc essentielles afin d’outrepasser la persistance du VHB dans les cellules infectées, ou du moins, de contrôler son activité transcriptionnelle et réplicative, afin de diminuer la sécrétion d’antigènes et de restaurer une immunité favorable. L’infection chronique par le VHB repose sur la persistance de son ADN viral, qui est circulaire et clos de manière covalente (ADNccc) au sein des hépatocytes infectés. Les histones, la protéine de capside virale (HBc) et l’ADNccc sont étroitement liés au sein d’une structure chromatinienne dynamique qui module l’activité biologique du virus. En utilisant une approche haut-débit combinant immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) spécifique de l’ADNccc, avec une analyse en spectrométrie de masse (MS-ChIP), nous avons identifié une liste de protéines interagissant avec l’ADNccc dans des hépatocytes primaires humains infectés.  Parmi les protéines identifiées, les protéines de la famille des hélicases ont été retrouvées significativement enrichies. Notre proposition de projet se focalise donc sur l’étude du rôle de deux hélicases particulières, DDX5 et DDX17, dans l’activité transcriptionnelle de l’ADNccc et dans la réplication virale in vitro et in vivo. En effet, ces hélicases ont été démontrées comme jouant un rôle déterminant dans la correcte initiation/terminaison transcriptionnelle ainsi que dans la régulation de l’épissage en modulant la topologie de la chromatine cellulaire. Des résultats préliminaires confirment la liaison de DDX5 et DDX17 à l’ADNccc par ChIP spécifique de l’ADNccc, et des co-immunoprécipitations révèlent l’interaction entre DDX5/DDX17 et la protéine virale HBc, au sein d’un complexe protéique contenant également les protéines architecturales CTCF et Matrin-3. De plus, l’extinction de l’expression de DDX5 et DDX17 inhibe fortement la sécrétion d’antigènes viraux sans affecter le niveau global d’ADNccc, ce qui suggère un impact de cette extinction sur la transcription virale et/ou la maturation des ARNm viraux. 

Dans ce contexte, l’objectif principal du projet est d’élucider les mécanismes impliquant DDX5 et DDX17 dans la régulation de la transcription du minichromosome viral et la maturation des ARNm viraux. Cela permettra de comprendre comment moduler les fonctions de ces deux hélicases pour spécifiquement détériorer l’activité de l’ADNccc, et pouvoir finalement « éteindre » le VHB dans les cellules infectées. Plus particulièrement, nous nous intéresserons aux points suivants :

• Le rôle de DDX5 et DDX17 dans la régulation de la transcription de l’ADNccc et la maturation des ARN viraux;
• L’interaction potentielle entre les protéines virales HBc et HBx avec les hélicases DDX5 et DDX17 ainsi qu’avec d’autres protéines hôtes connues pour être impliquées dans l’activité de DDX5 et DDX17;
• Le rôle de l’architecture de la chromatine dans la régulation de la transcription du VHB mediée par DDX5/17;
• la liason entre l’interaction DDX5/17 et l’ADNccc, l’epissage des ARNs viraux et la pathogenèse de l’hépatite B chronique

Globalement, ce projet apportera de nouvelles connaissances sur les mécanismes conduisant à la transcription de l’ADNccc et offrira de nouvelles stratégies pour étudier l’effet de traitements antiviraux sur l’activité de l’ADNccc. Améliorer la compréhension des partenaires protéiques hôte/virus impliqués dans la régulation du cccDNA est essentiel pour pouvoir adresser un traitement curatif fonctionnel contre l’hépatite B. En effet, actuellement, designer de nouveaux essais cliniques combinant des stratégies efficaces pour lutter à long-terme contre le VHB, représente un enjeu clinique majeur.

À ce jour, la greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques (allo-HSCT) demeure la seule intervention ayant démontré une réduction reproductible et profonde du réservoir VIH chez les personnes vivant avec le VIH (PVVIH). Dix cas ont été documentés de personnes ayant atteint une guérison ou une rémission durable de l’infection par le VIH en l’absence de traitement antirétroviral (ART) après allo-HSCT. Neuf d’entre elles ont reçu des greffes de donneurs homozygotes ou hétérozygotes pour la mutation CCR5Δ32. Cependant, une diminution substantielle du réservoir viral est également observée après allo-HSCT avec des cellules de donneurs CCR5wt/wt, mettant en évidence le rôle essentiel du conditionnement et de l’immunité allogénique dans la réduction du réservoir du VIH. Si certains cas antérieurs de PVVIH greffés avec des cellules de donneurs CCR5wt ont expérimenté un rebond viral après interruption de l’ART, le cas plus récent du « patient de Genève » a démontré qu’une rémission durable du VIH-1 était également possible dans ce contexte.

Nous proposons un essai clinique destiné à évaluer le contrôle du VIH lors d’une interruption analytique de l’ART en présence de deux anticorps largement neutralisants (bNAbs) chez des PVVIH ayant reçu une allo-HSCT avec des cellules de donneurs CCR5wt/wt. Il s’agit d’un essai clinique franco-espagnol multicentrique, à bras unique, de phase II, exploratoire et de preuve de concept. Un nombre prédéfini de participants se verront proposer l’arrêt de leur traitement antirétroviral, tout en recevant une immunothérapie transitoire, spécifique anti-VIH, utilisant les bNAbs à action prolongée  3BNC117LS et 10-1074LS.

Notre hypothèse est que l’administration de 3BNC117LS et 10-1074LS pendant l’interruption de traitement contribuera à maintenir un contrôle de la réplication virale en cas de réactivation du virus à partir de cellules infectées résiduelles persistant après allo-HSCT. Cet effet pourrait être obtenu par le renforcement de réponses immunitaires autologues et par l’élimination de ces cellules infectées grâce à des mécanismes cytotoxiques médiées par les anticorps. En synergie avec les effets bénéfiques de l’allo-HSCT, cette approche vise à favoriser un contrôle durable de la réplication du VIH après l’interruption de traitement dans le contexte d’une greffe CCR5wt.

Contexte et rationnel

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), bactérie causale de la tuberculose (TB), est l'agent bactérien le plus mortel au monde et associé à l'émergence de la multirésistance. Le granulome est central dans l'immuno-pathogénie de la TB, jouant le rôle d’incubateur de mycobactéries. Sa composition cellulaire et son microenvironnement déterminent sa trajectoire. Des données récentes indiquent que les cellules Natural Killer (NK) NK sont indispensables au contrôle de la TB, au carrefour de l'immunité innée et de l'immunité adaptative. En contexte hyper-endémique, il a été suggéré que les individus "résistants innés" ne développent pas la TB grâce à l'activité protectrice des cellules NK. Dans le contexte de TB active, le contrôle des mycobactéries dans les granulomes est associé à une réponse adaptative Th1-Th17 cytotoxique et une proportion in situ plus élevée de cellules T/NK. Les cellules NK sont donc des candidates intéressantes comme biothérapie adjuvante.

Objectifs

L'objectif du projet NaKiTi est d'utiliser un modèle organoïde humain pour étudier la composition cellulaire et le microenvironnement immunorégulateur du granulome infecté par Mtb chez les individus naïfs et présentant une infection tuberculeuse latente (LTBI). De plus, en tirant parti du cadre conceptuel de l'immunothérapie du cancer, nous testerons une intervention adjuvante basée sur le transfert adoptif dans le modèle de cellules NK activées. Les signaux produits par le microenvironnement du granulome Mtb qui régulent l'activité des cellules NK seront étudiés. Plus spécifiquement, l'infection par Mtb de PBMCs naïfs renseignera sur l'interaction primaire entre les agrégats de macrophages infectés et les cellules NK et permettra de déterminer si une biothérapie de cellules NK activées peut induire l'éradication de Mtb. L'infection par Mtb des PBMCs d’individus LTBI permettra de comprendre l'interaction dynamique entre les cellules NK et les cellules T, et de déterminer si une biothérapie de cellules NK activées stimule l'activité des cellules T en aval.

Methodes

Nous utiliserons un modèle optimisé de granulome spatio-temporel in vitro 2.5 dimensionnel basé sur les cellules mononuclées sanguine humaines (PBMC) formant une monocouche sur une matrice extracellulaire s’organisant en agrégats granulomateux microscopiques en réponse à la souche virulente de Mtb H37Rv et avirulente H37Ra. La charge mycobactérienne et la composition du microenvironnement des granulomes seront étudiées à différents temps par l’étude : (i) du morphotype des granulomes par un score microscopique. (ii) Du microenvironnement immunitaire par la mesure des cytokines Th1, Th17, Th2 et de chimiokines clés dans les surnageants, ainsi que de l'enzyme indoleamine 2-3 dioxygénase. (iii) Immunophénotypique des cellules NK et T par analyse en cytométrie spectrale des principaux marqueurs d'expression. (iv) Du contrôle de l'infection à Mtb par comptage des unités formant colonies après rupture du granulome et lyse cellulaire, ainsi que de la dormance de Mtb en cultivant des bactéries du même micro-puits avec ou sans surnageant de culture filtré de la phase logarithmique tardive pour ressusciter les mycobactéries dormantes.

Calendrier

Le projet NaKiTi durera 36 mois, comprenant une première phase d'optimisation du modèle (T0 à mois 12). Puis une deuxième phase consacrée à la collecte des résultats caractérisant l'immuno-régulation et la trajectoire des granulomes (mois 12 à 24), suivie d’une troisième phase consacrée aux expériences de transfert adoptif (mois 18 à 30). La dernière phase consistera à analyser, valoriser et diffuser les résultats de NaKiTi (mois 30 à 36).

Retombées

Ce modèle préclinique in vitro de granulome humain infecté par Mtb permettra de disséquer les voies immuno-régulatrices de l’activité des cellules NK dans le granulome et son micro-environnement. Le modèle permettra de valider si une biothérapie adjuvante par cellules NK activées augmente la clairance bactérienne et restreint la trajectoire des granulomes infectés par Mtb. Il s'agit de la première étape d'une stratégie de recherche visant à tester l'utilité d'une telle biothérapie dans la TB.