Projets et candidats lauréats

Contexte et rationnel

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), bactérie causale de la tuberculose (TB), est l'agent bactérien le plus mortel au monde et associé à l'émergence de la multirésistance. Le granulome est central dans l'immuno-pathogénie de la TB, jouant le rôle d’incubateur de mycobactéries. Sa composition cellulaire et son microenvironnement déterminent sa trajectoire. Des données récentes indiquent que les cellules Natural Killer (NK) NK sont indispensables au contrôle de la TB, au carrefour de l'immunité innée et de l'immunité adaptative. En contexte hyper-endémique, il a été suggéré que les individus "résistants innés" ne développent pas la TB grâce à l'activité protectrice des cellules NK. Dans le contexte de TB active, le contrôle des mycobactéries dans les granulomes est associé à une réponse adaptative Th1-Th17 cytotoxique et une proportion in situ plus élevée de cellules T/NK. Les cellules NK sont donc des candidates intéressantes comme biothérapie adjuvante.

Objectifs

L'objectif du projet NaKiTi est d'utiliser un modèle organoïde humain pour étudier la composition cellulaire et le microenvironnement immunorégulateur du granulome infecté par Mtb chez les individus naïfs et présentant une infection tuberculeuse latente (LTBI). De plus, en tirant parti du cadre conceptuel de l'immunothérapie du cancer, nous testerons une intervention adjuvante basée sur le transfert adoptif dans le modèle de cellules NK activées. Les signaux produits par le microenvironnement du granulome Mtb qui régulent l'activité des cellules NK seront étudiés. Plus spécifiquement, l'infection par Mtb de PBMCs naïfs renseignera sur l'interaction primaire entre les agrégats de macrophages infectés et les cellules NK et permettra de déterminer si une biothérapie de cellules NK activées peut induire l'éradication de Mtb. L'infection par Mtb des PBMCs d’individus LTBI permettra de comprendre l'interaction dynamique entre les cellules NK et les cellules T, et de déterminer si une biothérapie de cellules NK activées stimule l'activité des cellules T en aval.

Methodes

Nous utiliserons un modèle optimisé de granulome spatio-temporel in vitro 2.5 dimensionnel basé sur les cellules mononuclées sanguine humaines (PBMC) formant une monocouche sur une matrice extracellulaire s’organisant en agrégats granulomateux microscopiques en réponse à la souche virulente de Mtb H37Rv et avirulente H37Ra. La charge mycobactérienne et la composition du microenvironnement des granulomes seront étudiées à différents temps par l’étude : (i) du morphotype des granulomes par un score microscopique. (ii) Du microenvironnement immunitaire par la mesure des cytokines Th1, Th17, Th2 et de chimiokines clés dans les surnageants, ainsi que de l'enzyme indoleamine 2-3 dioxygénase. (iii) Immunophénotypique des cellules NK et T par analyse en cytométrie spectrale des principaux marqueurs d'expression. (iv) Du contrôle de l'infection à Mtb par comptage des unités formant colonies après rupture du granulome et lyse cellulaire, ainsi que de la dormance de Mtb en cultivant des bactéries du même micro-puits avec ou sans surnageant de culture filtré de la phase logarithmique tardive pour ressusciter les mycobactéries dormantes.

Calendrier

Le projet NaKiTi durera 36 mois, comprenant une première phase d'optimisation du modèle (T0 à mois 12). Puis une deuxième phase consacrée à la collecte des résultats caractérisant l'immuno-régulation et la trajectoire des granulomes (mois 12 à 24), suivie d’une troisième phase consacrée aux expériences de transfert adoptif (mois 18 à 30). La dernière phase consistera à analyser, valoriser et diffuser les résultats de NaKiTi (mois 30 à 36).

Retombées

Ce modèle préclinique in vitro de granulome humain infecté par Mtb permettra de disséquer les voies immuno-régulatrices de l’activité des cellules NK dans le granulome et son micro-environnement. Le modèle permettra de valider si une biothérapie adjuvante par cellules NK activées augmente la clairance bactérienne et restreint la trajectoire des granulomes infectés par Mtb. Il s'agit de la première étape d'une stratégie de recherche visant à tester l'utilité d'une telle biothérapie dans la TB.

Les co-infections HBV/HDV représentent la forme d’hépatite virale la plus agressive. La plupart des études expérimentales ont été réalisées avec des virus HBV de génotype D et HDV de génotype I. Cependant, les données épidémiologiques indiquent que certains génotypes sont associés à un risque plus élevé de chronicité et/ou d’évolution vers les maladies hépatiques. Afin d’étudier le rôle de la variabilité génétique d’HBV dans la réplication virale, l’interaction avec HDV et la réponse aux traitements, nous avons généré huit lignées de cellules HepaRG chacune exprimant de façon stable une séquence intégrée d’HBV de génotypes A à H (HepaRG-HBVy-intégré). La première partie de ce projet sera consacrée à la caractérisation des huit lignées de cellules en mesurant les paramètres HBV dans différentes conditions de culture pouvant influencer les niveaux de réplication. La seconde partie du projet permettra de déterminer si ces cellules HepaRG-HBVy-intégré peuvent être un outil utile pour tester l’effet de molécules antivirales (ciblant le virus ou des facteurs cellulaires) contre différent génotypes d’HBV. La troisième partie du projet permettra de déterminer si ces cellules HepaRG-HBVy-intégré peuvent être utile à l’étude de l’interférence négative de HDV (observée chez des patients) sur différent génotypes d’HBV, un projet que nous développons actuellement dans notre équipe.

La surinfection par le virus de l’Hépatite Delta (HDV) de patients chroniquement infectés par le virus de l’Hépatite B (HBV) induit une des formes les plus agressives d’hépatite virale chronique. Plus de 40 ans après sa découverte, cette surinfection reste énigmatique à la fois pour les chercheurs et les cliniciens. En particulier, en plus d’induire des effets secondaires sévères, l’efficacité des traitements à base d’IFN-α est limitée est limitée et les mécanismes liés à ces échecs ne sont pas connus. Si plusieurs gènes stimulés par l’interferon (ISGs) ont déjà été décrit pour inhiber HBV, le set complet d’ISGs nécessaire à l’effet de l’IFN-α n’a pas été décrit. De plus, le mode d’action et les ISGs responsables de l’effet antiviral de l’IFN-α sur HDV sont complétement inconnues.

Objectif. A partir de données préliminaires solides obtenues après séquençage ARN de cellules HepaRG et HuH7.5-NTCP différenciées (dHepaRG et dHuH7.5-NTCP), notre objectif est d’établir une carte complète des facteurs de restrictions pour HBV et HDV induit par l’IFN-α afin d’évaluer de nouvelles stratégies antivirales basée sur le remplacement de l’IFN-α.

Partie 1. Identification des sets d’ISGs responsable de l’effet antivirale de l’IFN-α sur HBV et/ou HDV. Après validation des données de notre analyse transcriptomique par nanostring et RTqPCR, des expériences de pertes et gain de fonction seront menées dans des cellules dHepaRG et dHuH7.5-NTCP pour identifier les sets complets d’ISGs responsable de l’effet antivirale de l’IFN-α sur HBV et/ou HDV. Des expériences seront ensuite effectuées dans des hépatocytes primaires humain (PHH) pour déterminer le mode d’action sur HBV et/ou HDV des ISGs identifiées.

Partie 2. Test de l’effet antiviral des ISGs identifées en combinaison avec des traitements anti-HDV. Des vecteurs AAV recombinants exprimant les ISGs les plus efficaces pour inhiber HBV et/ou HDV (identifiées en partie 1) seront produits et leur profil de toxiccité ainsi que leur efficacité antivirale seront testés dans des PHH, dHepaRG et souris humanisées pour le foie (HuHep). Des combinaisons seront effectuées avec des molécules approuvées ou en développement pour le traitement de l’hépatite comme le Bulevirtide ou le Lonafarnib. L’effet antiviral de ces combinaisons sera comparé à des combinaison avec l’IFN-α.

Perspectives. Notre programme permettra d’avancer sur notre compréhension des interactions entre les ISGs et les co-infections par HBV et HDV tout en identifiant des nouveaux facteurs de restrictions de l’hôte. La liste complète de ces ISGs ouvrira la voie vers le développement de nouvelles stratégies antivirales basées sur le remplacement de l’IFN-α. Nos résultats pourraient aussi permettre d’identifier des biomarqueurs de réponses aux traitements actuels chez les patients.