Projets et candidats lauréats

Bien que le virus de l'hépatite E (HEV) soit la première cause d'hépatite aiguë dans le monde, et ait été classé très récemment par l'OMS dans la liste des pathogènes les plus à risque, son cycle infectieux est encore très mal caractérisé. Dans notre laboratoire, nous nous intéressons depuis plusieurs années à la protéine de capside du HEV, nommée ORF2. En effet, nous avons montré qu'au cours de son cycle infectieux, le HEV produit au moins 3 formes de sa protéine de capside ORF2 : l'ORF2 infectieuse (ORF2i), l'ORF2 glycosylée (ORF2g) et l'ORF2 clivée (ORF2c). Ces formes ORF2 remplissent des fonctions distinctes dans le cycle infectieux du HEV. La protéine ORF2i est le constituant structurel des particules infectieuses tandis que les protéines ORF2g/c ne sont pas associées à du matériel infectieux mais agissent probablement comme des leurres immunologiques. Les protéines ORF2g/c sont sécrétées en grandes quantités dans le surnageant de culture et sont les antigènes les plus abondants détectés dans le sérum des patients.

Récemment, nous avons étudié les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la biogenèse, la localisation subcellulaire et les fonctions des différentes formes de l’ORF2. Nous avons notamment montré qu'au moment de la traduction, la protéine ORF2 est massivement transloquée dans la lumière du RE, par un processus dépendant du translocon. Elle suit ensuite la voie de sécrétion classique où elle subit des modifications post-traductionnelles (maturation des N-glycanes, O-glycosylation, sialylation et maturation par des protéases) pour générer les formes solubles ORF2g/c. L'ORF2i est quant à elle produite par une voie différente d'adressage puisqu'après traduction elle reste ancrée du côté cytosolique des membranes. En effet, nous avons montré qu'il existe un mécanisme de régulation fine de l'expression de l'ORF2 reposant sur la présence d'un motif présent à l'extrémité N-terminale de la protéine. Ce motif riche en résidus Arginine, nommé ARM, régulerait l'adressage subcellulaire des formes ORF2 en modulant la topologie et la fonctionnalité du peptide signal de l'ORF2.

De manière intéressante, nous avons obtenu des résultats préliminaires suggérant que la production de la protéine ORF2i pourrait être dépendante de l'EMC (ER-membrane complex), qui est un complexe impliqué dans la traduction, le repliement et l'insertion membranaire de certaines protéines cellulaires et virales. C'est pourquoi, dans ce projet de recherche, nous proposons de démontrer qu'en plus du translocon, l'EMC serait impliqué dans le processus de traduction de la protéine ORF2 en prenant en charge et en régulant l'intégration dans les membranes de la protéine ORF2i. Pour cela, différentes approches méthodologiques et expérimentales seront développées. Au-delà du mécanisme de traduction de la protéine ORF2 du HEV, nous proposons également d'analyser par profilage ribosomique (Ribo-seq) le traductome de cellules infectées ou non par le HEV afin d'établir une cartographie des modifications de l'expression des protéines cellulaires induites par l'infection, ainsi que des mécanismes de détournement de la machinerie cellulaire par le HEV.

Le développement de notre projet devrait apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes du cycle infectieux nécessaires à la lutte contre l'hépatite E ainsi que pour la compréhension générale des stratégies virales de détournement de la machinerie cellulaire.

L'infection par le virus de l'hépatite C (VHC) peut entraîner des hépatites chroniques et des maladies hépatiques mortelles telles que la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Le développement d'agents antiviraux a permis une meilleure prise en charge des patients mais ces traitements sont coûteux et ne sont pas accessibles à toutes les populations. Les protéines impliquées dans les interactions entre le virus et son hôte constituent de nouveaux candidats thérapeutiques prometteurs et nous proposons d'étudier l'une de ces protéines : HELZ2. La littérature récente relie HELZ2, un gène stimulé par l'interféron, à la réponse contre les infections virales. Ainsi, HELZ2 a été décrit comme supprimant la réplication du VHC, mais les détails de son mécanisme d'action manquent. Ce projet vise donc à décrypter le rôle de HELZ2 lors de l'infection par le VHC.

Nos analyses récentes ont révélé que HELZ2 possède des activités ribonucléase et hélicase. Ainsi, notre hypothèse de travail est que HELZ2 interfère avec le VHC en dégradant les ARN de l’hôte et/ou du virus. Nous avons généré des lignées cellulaires HeLa et Huh7 knock-out pour HELZ2 par CRISPR/Cas9 et les utiliserons pour étudier l'impact de HELZ2 sur le transcriptome cellulaire en comparant les niveaux des ARN dans les cellules sauvages ou HELZ2-/-, avec ou sans stimulation par l’interféron. Cela nous permettra d'identifier les gènes hôtes et les voies contrôlées par HELZ2 lors de son induction. Pour tester l’impact de HELZ2 sur le VHC, nous utiliserons un réplicon, dans lequel les protéines structurales virales ont été remplacées par un gène rapporteur. Puisque HELZ2 contient des domaines interagissant avec l’ARN, l’interaction entre la protéine et l’ARN viral sera étudiée biochimiquement. De même, les interactions entre HELZ2 et les protéines hôtes ou virales seront évaluées par des expériences de co-immunoprécipitation. L'inactivation de HELZ2 dans les cellules Huh7, qui peuvent supporter les infections par des réplicons basés sur le VHC, nous permettra de suivre la réplication virale en mesurant l'activité du gène rapporteur et/ou les niveaux d'ARN viral dans des cellules sauvages ou HELZ2-/-. L'induction de HELZ2 par l'accumulation d'ARN viral dans les cellules infectées sera analysée et des méthodes de séquençage des ARN à haut débit qui identifieront les ARN endogènes et viraux affectés par HELZ2.

Au total, ces expériences visent à confirmer l'implication de HELZ2 contre le VHC et donneront un aperçu du rôle de HELZ2 au cours de la réponse immunitaire innée qui pourrait être transposable à d'autres infections virales.

Contexte : Les différentes enquêtes VESPA ont permis de fournir des premières données sur l’existence d’inégalités sociales vis-à-vis du VIH et de leurs répercussions sur la vie des personnes, une perspective jusque-là peu documentée. Depuis la dernière enquête VESPA 2, en 2011, le contexte de la prévention et de la prise en charge du VIH a énormément changé. Les caractéristiques des personnes vivant avec le VIH (PVVIH) ont aussi continué d’évoluer, notamment via un vieillissement de la population vivant avec le VIH. Ces changements variés conduisent à de nouvelles questions de recherche et de nouveaux enjeux auxquels VESPA 3 se propose de répondre en France hexagonale en 2024. Les particularités des départements d’outre-mer justifient d’enquêter spécifiquement dans ces territoires.

Objectif : VESPA 3-DROM a pour objectif de décrire de façon fine la situation actuelle des PVVIH prises en charge dans les départements d’outre-mer. Elle s’appuiera sur un socle commun avec les enquêtes précédentes et avec VESPA 3 en cours en hexagone, en investiguant les conditions de vie avec le VIH, sous l’angle comportemental (sexualité, prévention, etc.) et thématique (observance, discrimination, relations avec les professionnels de santé, etc.).

Méthode : Afin d’être comparable avec les autres enquêtes VESPA, la méthode utilisée sera identique. Il s’agit d’une enquête transversale, prospective et multicentrique, permettant de réaliser un échantillon aléatoire représentatif, en Guadeloupe, en Martinique, en Guyane, à la Réunion et à Mayotte, de la population ayant connaissance de son statut VIH et suivie en milieu hospitalier en 2026.

L’enquête sera réalisée auprès de 1 000 patients vivant avec le VIH, vus lors de leur consultation ou à l’hôpital, le jour de l’enquête. Pour être éligible, les patients devront connaître leur séropositivité depuis au moins 6 mois, être âgés d’au moins 18 ans et résider dans le département ultramarin où ils sont pris en charge. Les données seront recueillies auprès des patients par un questionnaire standardisé administré en face à face (CAPI). Un questionnaire médical permettra de décrire des informations sur les caractéristiques principales de la maladie VIH ainsi que sur d’éventuelles comorbidités. De même que VESPA 3 se distingue de ses prédécesseurs d’un point de vue méthodologique, en intégrant une approche qualitative, des études qualitatives seront développées sur les territoires pour approfondir les connaissances sur des populations spécifiques.

Résultats : Les particularités des PVVIH résidant dans les DROMs, leurs conditions de vie et comportements seront mesurées et mises en perspective avec les changements survenus ces dernières années dans l’épidémiologie, la thérapeutique et les pratiques de prévention. Les résultats pourront être comparés à ceux produits par l’étude VESPA 3 en France hexagonale. Connaitre les spécificités des différents territoires devrait être utile pour éclairer les décideurs de santé publique afin d’affiner les dispositifs de prise en charge et de prévention.

Échéancier : L'enquête est prévue sur 36 mois. L'année 1 sera dédiée à la préparation de l'enquête (construction des outils de collecte de données ; sélection et formation des enquêteurs ; mise en place de l'enquête) et aux démarches éthiques et règlementaires. Les collectes de données (quantitatives et qualitatives) seront réalisées au cours de l’année 2, pendant 6 à 8 mois selon les territoires. La constitution de la base de données, les premières analyses et la communication des premiers résultats seront réalisées sur 12 mois (Fin d’année 2 et année 3).

l est désormais bien établi que la communication bidirectionnelle entre les systèmes immunitaire et nerveux joue un rôle clé dans l'initiation et le développement des réponses de l'hôte aux infections et autres signaux de danger. Le rôle du système nerveux dans la réponse de l'hôte à la tuberculose (TB) n'a pas encore été élucidé. Nous avons récemment fait l'observation que des cellules b3-tubuline (TUBB3)+ (un marqueur pan-neuronal) sont présentes dans les poumons de souris infectées par Mycobacterium tuberculosis (Mtb) à proximité des granulomes. Leur présence corrèle avec l'incidence de l'inflammation tissulaire. Grâce à un contrat d'initiation (ANRS CI ECTZ242543), nous savons maintenant que des cellules neuronales TUBB3+ sont également présentes dans les granulomes pulmonaires chez les primates non humains infectés par Mtb et chez les patients atteints de TB. De plus, nous pensons que ces cellules sont d'origine nerveuse sympathique autonome en raison de la colocalisation, au moins en partie, avec la tyrosine hydroxylase (TH), un marqueur des neurones sympathiques. Ces cellules neuronales TUBB3+ modifient-elles la progression de la TB ? Ou est-ce que la présence de ces cellules dans les lésions tuberculeuses sont le reflet d'un rôle physio-pathologique inexploré et insoupçonné du système nerveux sympathique autonome dans cette infection pulmonaire ? Ces questions nous encouragent aujourd’hui à poursuivre nos recherches sur ce sujet passionnant. Ainsi, le projet proposé visera à (i) caractériser ces nouvelles neuronales pulmonaires TUBB3+, notamment in situ dans les granulomes tuberculeux chez les souris infectées, grâce à différentes approches de pointe ; (ii) préciser l'origine, le recrutement et le processus de différenciation de ces cellules dans le poumon au cours de l'infection, en se concentrant sur deux hypothèses basées sur la manière dont le système nerveux sympathique infiltre les tumeurs solides, à savoir la neurogenèse et l'axonogenèse ; (iii) étudier les conséquences de la déplétion ciblée, par des approches chimiques et génétiques, des cellules TUBB3+ sur la dynamique des granulomes, la réponse immunitaire antimycobactérienne et la pathogénèse de la TB dans le modèle murin ; et (iv) établir une corrélation entre la présence de cellules neuronales TUBB3+ et la sévérité de la maladie dans des échantillons de poumons provenant de primates non humains infectés par Mtb et de patients tuberculeux. Ces résultats pourraient ouvrir une voie de recherche entièrement nouvelle dans le domaine de la neuroimmunologie de la TB, un domaine largement inexploré à ce jour.

Parmi les personnes vivant avec le VIH (PVVIH), un groupe rare de personnes (<1%) contrôlent spontanément la réplication virale au long cours sans traitement antirétroviral (TARV) : les HIV controllers (HIC). Ces PVVIH ont un taux d’ADN viral très bas, et la connaissance des mécanismes de contrôle immunologique est importante pour l’établissement de stratégies thérapeutiques innovantes. Parmi les caractéristiques des HIC, nous avons observé que les femmes sont plus représentées, tant dans la cohorte française de l’ANRS (CODEX) que dans d’autres groupes. L’impact de cette prévalence plus importante de femmes sur les mécanismes de contrôle du VIH n’est pas déterminé.

La réponse immunitaire innée joue un rôle important dans le contrôle de la réplication virale dès la primo-infection. La production d’Interféron (IFN) de type I, notamment l’IFNα, en est un des reflets. Il est principalement produit par les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) en réponse à l’activation des motifs de reconnaissance antigéniques (PRR) comme le TLR7. L’IFNα joue cependant un rôle complexe, dépendant de la temporalité de sa production : en primo-infection, un défaut de réponse IFNα est associé à un moindre contrôle antiviral, mais en phase chronique, sa persistance est associée à l’activation immunitaire persistante. La modulation de la voie des IFN fait partie des pistes stratégiques dans une optique de réduction des réservoirs.

Le rôle du sexe biologique est important dans la régulation de la voie des IFN. Les pDC des femmes expriment des taux de la protéine TLR7 (liée au chromosome X) plus importants que les hommes et ont des réponses fonctionnelles différentes aux antigènes viraux. Certains polymorphismes de TLR7, dont le rs179001 (c.32A>T), ont été décrits comme étant fonctionnels mais associés à une moindre production d’IFNα en réponse à la stimulation TLR7. Ce polymorphisme a été étudié dans le contexte de l’infection par le VIH par les équipes impliquées dans ce projet, montrant que l’expression des SNP c.32A/T ou T/T est associée une charge virale (ADN/ARN) diminuée et un taux sérique IP-10 plus bas chez les femmes de la cohorte ANRS PRIMO. Les liens entre ces réponses immunitaires chez les femmes et le contrôle du réservoir viral, ainsi que l’activation immunitaire, restent à explorer, la majorité des études publiées ayant été effectuée dans le contexte de l’infection par le VIH sous TARV.

Dans ce projet, l’hypothèse de travail est de déterminer le rôle bénéfique ou délétère de la réponse IFNα dans la dynamique du réservoir du VIH-1 en étudiant les femmes de la cohorte CODEX, contrôlant spontanément la réplication virale sans TARV. Nous prévoyons d’étudier la prévalence des polymorphismes de TLR7 (rs179008 et rs3853839) et de CXorf21 (rs887369) à partir des culots secs disponibles de la cohorte CODEX (n=300). Après cette étape de génotypage, une analyse fonctionnelle de stimulation des pDC par agoniste de TLR7 (CL097) afin de mesurer la fréquence des pDCs IFNa+TNFa+ en cytométrie en flux par marquage intracellulaire sera effectuée. Cette manipulation permettra d’évaluer chez 40 femmes HIC l’impact du polymorphisme AA (n=20) vs AT (n=20) sur la production d’IFNa et de TNFa. Enfin, nous analyserons les liens entre ces polymorphismes et les caractéristiques des PVVIH de la cohorte ANRS CODEX (statut « indetectable » ou « blipper », évolution des taux de LT CD4, du ratio CD4/CD8, de la charge virale ARN ultra-sensible et de l’ADN VIH/PBMC, ainsi que des paramètres d’activation immunitaire disponibles dans les données de suivi).

Nous espérons que cette étude sur 12 mois apportera des éléments importants dans la réponse IFNα des pDC des HIC. En fonction des résultats obtenus, nous envisageons une étude approfondie afin d’analyser fonctionnellement les réponses IFNa de l’ensemble des cellules immunitaires en lien avec l’activation immunitaire et son évolution au cours du temps, pour déterminer les facteurs associés aux risques de perte de contrôle immuno-virologique ou la survenue de comorbidités inflammatoires.

Le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre la tuberculose passe par une compréhension plus approfondie de la biologie de Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agent de la tuberculose humaine. Mtb possède une enveloppe cellulaire atypique comportant deux membranes : une membrane interne et une membrane externe appelée mycomembrane. La mycomembrane, principalement composée de glycolipides, joue un rôle clé dans les interactions hôte-pathogène et la résistance intrinsèque de Mtb aux antibiotiques. De façon notable cette structure est la cible de plusieurs antituberculeux. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans son assemblage pourrait donc conduire à l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. A ce jour, les mécanismes associés au transport des lipides de la mycomembrane à travers l’enveloppe cellulaire depuis le compartiment cytoplasmique où ils sont synthétisés, restent très mal caractérisés. Ce projet vise à combler cette lacune en apportant des informations sur la composition et l'organisation de la machinerie moléculaire impliquée dans le transport de ces lipides chez Mtb.

 Il a été montré qu’une famille de transporteurs appelés MmpL (Mycobacterial membrane protein Large) joue un rôle clé dans le transfert des lipides de la mycomembrane à travers la membrane plasmique. Nous faisons l'hypothèse que d'autres protéines coopèrent avec les MmpL pour transporter ces lipides à travers et au-delà la membrane plasmique. Des données antérieures suggèrent que des protéines membranaires de la famille Gap et les lipoprotéines de la famille LprG pourraient être impliquées dans ce processus, mais leur rôle dans le transport reste à confirmer. En outre, nous avons récemment identifié diverses protéines interagissant avec un transporteur MmpL qui pourraient potentiellement être des composants de la machinerie d'export des lipides. Dans ce contexte, nos objectifs visent : 1) à étudier le rôle des protéines de la famille Gap et des lipoprotéines de la famille LprG dans le transport des lipides ainsi que leur organisation au sein de l’enveloppe et leur association avec les MmpL, 2) à examiner le rôle dans le transport de protéines candidates interagissant avec les transporteurs MmpL pour découvrir de nouveaux composants de la machinerie de transport.

 Pour aborder ces questions, nous proposons d’étudier le rôle de ces protéines dans l’export de deux familles modèles de glycolipides de la mycomembrane de Mtb, les di- et polyacyltréhaloses (DAT/PAT) et les sulfolipides (SL). Les études seront réalisées dans un premier temps chez la mycobactérie modèle Mycobacterium smegmatis (Msm) qui produit une famille des glycolipides, les polyphléates de trehalose (TPP), dont la structure et la voie de biosynthèse sont similaires à celles des DAT/PAT et SL de Mtb. Les connaissances acquises chez Msm seront ensuite validées chez Mtb. Nous générerons une collection de mutants Msm exprimant les protéines des familles Gap et LrpG de Mtb pour étudier leur rôle dans le transport, avant de valider leur fonction chez Mtb. Nous utiliserons également diverses approches biochimiques pour caractériser la topologie et l’organisation supramoléculaire de ces protéines ainsi que leur localisation dans l’enveloppe et leur interaction avec les MmpL. En parallèle, nous mettrons en place une approche globale basée sur la technologie CRISPRi pour identifier, parmi les protéines interagissant avec les MmpL, celles associées au transport des glycolipides.

Ce projet apportera des informations fondamentales sur l'organisation des machineries de transport des DAT/PAT et SL chez Mtb. Celles-ci serviront de guide pour l’étude des voies de transport d’autres lipides de l’enveloppe de Mtb mais également l'assemblage de la mycomembrane chez d'autres mycobactéries. En outre, compte tenu de l'importance des lipides de la mycomembrane dans la survie et la virulence de Mtb, l'identification de nouvelles protéines impliquées dans leur export pourrait conduire à la découverte de nouvelles cibles pharmacologiques pour traiter la tuberculose qui reste un problème majeur de santé publique.