Projets et candidats lauréats

Les métabolites sont des petites molécules biologiques qui participant a de nombreux processus cellulaires. Ils sont impliqués par exemple dans la glycolyse et la respiration mitochondriale (aussi appelée Oxphos), les deux principales méthodes de production d’énergie dans les cellules. Les particules virales de virus enveloppés comme le VIH se composent de protéines et d’acides nucléiques d’origine à la fois cellulaire et virale. Les composants provenant de la cellule sont incorporés dans la particule virale au moment de sa formation à la membrane de la cellule productrice. Il a été récemment montré que les particules virales peuvent également contenir une petite molécule ayant des propriétés de modulation de la réponse immunitaire : l’AMP-GMP cyclique (cGAMP). Lorsque ces virus contenant cGAMP entrent dans une nouvelle cellule cible, cGAMP se lie à son récepteur STING ce qui induit l’activation de la cellule qui produit alors des cytokines pro-inflammatoire et augmente son expression de gènes antiviraux. L’incorporation de cGAMP dans des particules virales utilisées dans un contexte de vaccination augmente l’efficacité du vaccin. Ainsi, une petite molécule incorporée dans une particule virale peut avoir un effet significatif sur l’organisme. Nous avons émis l’hypothèse que les particules virales peuvent également incorporer des petites molécules d’origine cellulaires et en particulier des métabolites. Des expériences préliminaires nous ont permis d’identifier des métabolites dans des préparations virales par une approche metabolomique semi-ciblée. Dans ce projet, nous souhaitons confirmer la présence de ces métabolites cellulaires dans les particules virales (« métabolites viraux »), développer des méthodes pour moduler les quantités de métabolites présents dans les particules virales et décrire les effets de ces métabolites viraux sur la cellule cible.

Les préparations virales contiennent à la fois les particules virales et des petites vésicules extracellulaires (sEVs) qui ont des caractéristiques morphologiques et physico-chimiques similaires aux particules virales. Dans un premier temps, nous testerons donc plusieurs méthodes de séparation des particules virales et des sEVs et nous identifierons la plus efficace par western blot et par microscopie électronique. Nous confirmerons ensuite que les métabolites identifiés dans nos expériences préliminaires sont présents dans les particules virales ainsi purifiées en utilisant des méthodes plus ciblées telles que des ELISAs, des tests enzymatiques in vitro et de la spectrométrie de masse ciblée. Ces métabolites viraux peuvent être incorporés soit de manière passive lors de la formation de la particule virale à la membrane cellulaire, soit par des processus actifs qui pourraient alors impliquer des protéines virales. L’existence de tel mécanismes viraux pour l’incorporation de métabolites spécifiques suggèrerait que ces métabolites sont importants pour la pathologie du VIH. Dans un second temps, nous identifierons donc des méthodes pour moduler l’incorporation des métabolites viraux en modifiant soit la cellule productrice, soit le virus. Cela nous permettra de produire des particules virales contenant des quantités plus importantes ou moins importantes de certains métabolites choisis. Nous utiliserons ensuite différentes méthodes pour étudier les effets des métabolites viraux sur le métabolisme de la cellule cible ainsi que sur la réplication virale et la réponse immunitaire a l’infection.

Ce projet décrira pour la première fois la présence de métabolites cellulaires dans les particules virales et montrera les effets de ces métabolites sur la réplication virale et la réponse immunitaire à l’infection dans les cellules cibles du VIH. Il révèlera ainsi un nouvel aspect de la relation hôte-pathogène et permettra d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes.

Alors que le VIH-1 est hautement pathogène et pandémique, le VIH-2 est moins pathogène et restreint à l’Afrique de l’Ouest. Le VIH-1 et le VIH-2 montrent une différence majeure dans leur capacité à activer les réponses immunitaires innées dans les cellules dendritiques (DCs) infectées. En effet, le VIH-1 n’active pas efficacement une réponse immunitaire innée dans ces cellules, alors que le VIH-2 infecte efficacement les DCs et active une réponse. La reconnaissance du VIH-2 par les DCs nécessite l’abrogation de SAMHD1 avec Vpx, et la reconnaissance de l’ADN viral par le détecteur de l’ADN cytosolique cGAS. Nous avons validé que le VIH-2 de type sauvage ou le VIH-1 + Vpx infectent efficacement et active la voie cGAS dans les DCs primaires DC2. Ainsi, l’infection des DCs par le VIH-2 et la reconnaissance du virus pourraient jouer un rôle majeur dans l’élaboration d’une réponse immunitaire puissante chez les patients, conduisant à un contrôle autonome de l’infection virale en l’absence de traitement. Cependant, notre capacité à tirer parti de cette voie dans le développement thérapeutique et vaccinal est actuellement entravée par notre compréhension limitée des mécanismes moléculaires correspondants.

Une question majeure dans ce mécanisme est le rôle de la capside du VIH. En plus de l’ADN viral, la protéine de capside virale, qui protège les acides nucléiques viraux, joue un rôle dominant dans l’activation de l’immunité innée dans les DCs. Même en présence d’ADN viral dans les DCs, la protéine de capside du VIH détermine si l’ADN peut être reconnu ou non par la voie cGAS. Ceci nous a conduit à proposer qu’un facteur hôte spécifique pourrait être impliqué dans la reconnaissance de la capside virale pour permettre une activation immunitaire innée.

Dans nos résultats préliminaires du projet, nous avons identifié la protéine nucléaire NONO comme une nouvelle protéine interagissant avec la capside. NONO se lie directement aux capsides du VIH, avec une plus grande affinité pour le VIH-2 que la capside du VIH-1. Dans les lignées cellulaires cancéreuses et les DCs, NONO n’est pas requis pour la réplication virale et n’est donc pas un facteur de restriction ni un facteur facilitant l’infection. En revanche, nous constatons que NONO est essentiel pour l’activation immunitaire innée en réponse à l’infection par le VIH-2 dans les DCs. Nous avons montré que NONO reconnaît la capside virale dans le noyau des DCs, révélant un important réservoir de matériel viral dans le noyau qui reste mal défini. De plus, nous trouvons que NONO s’associe à cGAS. Nous avons validé le rôle essentiel du NONO dans la reconnaissance du VIH en utilisant des DCs provenant de patients humains NONO-déficient.

Dans ce projet, nous proposons de dévoiler le mécanisme de reconnaissance du VIH par NONO-cGAS dans le noyau. Dans l’Objectif 1, nous étudierons comment l’ADN du VIH, la capside du VIH, NONO et cGAS interagissent pour activer l’immunité innée. Nous allons déterminer les domaines d’interaction et leur impact sur les localisations subcellulaires. Nous séquencerons l’ADN associé à cGAS et mesurerons l’activité enzymatique de cGAS en réponse au VIH. Nous déterminerons également le rôle possible de NONO et de la capside dans les mécanismes alternatifs de reconnaissance du VIH qui ont été récemment proposés dans la littérature. Dans l’Objectif 2, nous identifierons les cofacteurs cellulaires inconnus qui sont requis pour la reconnaissance du VIH. Nous testerons le rôle de facteurs candidats, sur la base d’une liste tirée de la littérature. Nous identifierons également de nouveaux cofacteurs pertinents pour la reconnaissance du VIH dans les cellules dendritiques en utilisant la spectrométrie de masse.

Dans l’ensemble, ce projet est fortement soutenu par notre identification innovante de NONO en tant que détecteur essentiel de la capside du VIH. Il révèlera les mécanismes moléculaires de la reconnaissance du VIH dans les DCs. Cela fournira des connaissances essentielles pour le développement potentiel d’approches précliniques et cliniques basées sur cette nouvelle voie de l’immunité.

Le développement d’approches innovantes pour lutter contre l’infection à VIH, y compris les vaccins prophylactiques et thérapeutiques, reste une priorité pour mettre fin à la pandémie du VIH/SIDA. La plateforme de nanoparticules lipidiques (LNP) d’ARNm présente un potentiel très prometteur pour la vaccination. Cependant, il est prouvé que son immunogénicité et son efficacité à long terme doivent être renforcées, ce qui est généralement obtenu grâce aux effets des adjuvants. Notre objectif ici est de développer et d’évaluer la réactogénicité et le potentiel d’induction d’une immunité efficace spécifique du HIV/SIV d’une plateforme vaccinale combinant ARNm-LNP et un agoniste de STING comme adjuvant. Les agonistes de STING sont de puissants inducteurs de la sécrétion d’interféron de type I (IFN) et représentent des immunomodulateurs prometteurs favorisant l’induction de fortes réponses cellulaires et humorales. Nous générerons et utiliserons des vecteurs LNP encapsulant des ARNm codant pour des antigènes modèles, VIH/VIS gag, et l’agoniste de STING cGAMP pour la délivrance d’antigènes et l’adjuvanticité respectivement. Des formulations associant ARNm-LNP avec ou sans adjuvant seront testées à l’aide d’approches d’induction de lymphocytes T spécifiques d’antigène in vitro, et après immunisation intramusculaire ou intranasale chez des souris standards ainsi que HLA-A2 transgéniques. La quantité et la qualité des lymphocytes T spécifiques de l’antigène et des anticorps seront analysées dans ces modèles. Enfin, nous caractériserons in vitro la réponse des cellules innées de primates non humains en réponse aux ARNm-LNP avec ou sans adjuvant, ainsi que leur capacité à stimuler des lymphocytes T mémoires spécifiques de SIV, expériences préliminaires à des essais in vivo chez le macaque.

Les muqueuses jouent un rôle central lors de la transmission et de la physiopathologie du VIH. Actuellement la transmission par voie sexuelle et l’allaitement constituent les modes principaux de nouvelles contaminations dans le monde. Par ailleurs, les muqueuses sont les sites clefs de l’initiation et du développement de la protection innée et adaptative suite à l’infection. Ce sont dans ces tissues que le VIH se réplique s’amplifie et persiste, et de ce fait, les muqueuses constituent la source de dissémination du VIH dans tout l’organisme. Au cours de cette dissémination, des études menées in vitro dans des explants de tissue d’intestin et de tissus génitaux indiquent que les cellules dendritiques sont des cibles privilégiées  du VIH. Ces cellules sont distinctes des DCs détectées dans le sang périphérique de par leurs marqueurs phénotypiques et de par leurs fonctions.

Afin de protéger les transmissions du VIH via les muqueuses, les nouvelles stratégies vaccinales devraient induire des anticorps capables d’inhiber l’infection et la dissémination du VIH dans les muqueuses.

Les anticorps neutralisants un large spectre de VIH (bNAbs) sont capables de prévenir l’infection dans des modèles de primates non humains. Pourtant, les mécanismes exacts permettant cette protection ne sont pas connus. En effet, les bNAbs ont démontré des activités inhibitrices multiples, qui en plus de la neutralisation, pourraient participer à cette protection. Parmi ces fonctions, les activités inhibitrices médiées par les récepteurs Fc pourraient jouer un rôle déterminant. Les cellules impliquées dans ces fonctions inhibitrices comme les DCs sont largement présentes dans les muqueuses, et pourraient de ce fait, participer à l’activité inhibitrice des anticorps.

Notre projet de recherche collaboratif impliquant trois équipes (C. Moog-U1109, M. Cavarelli-CEA et G. Sarclatti-OSR, Milan) a pour but de déterminer le potentiel inhibiteur des anticorps spécifique du VIH lors des premiers événements d’infection, de transmission et de dissémination du VIH dans les muqueuses.

Pour cette étude nous utiliserons des explants humains de tissus cervicaux vaginaux et de tissus du colon de personnes non-infectés, ainsi que deux modèles de cultures, largement développés aux laboratoires de C. Moog, M. cavarelli et G. Sarclatti. 1° Le modèle de culture in vitro de cellules dissociées d’explants de tissus nous permettra d’analyser l’activité inhibitrice des anticorps sur l’infection de co-cultures de cellules immunes issues des muqueuses. 2° Le modèle de culture d’explants de tissus polarisés et d’infection par des virus fluorescents nous renseignera sur la distribution et la transmission d’isolats fondateurs du VIH dans les cellules cibles des muqueuses en présence d’anticorps.

Ce projet permettra de caractériser les activités inhibitrices des anticorps dans des modèles complexes de muqueuses ex vivo qui contiennent les différentes cellules ciblées par le VIH lors de l’infection et la transmission. Ces études nous donnerons des informations précieuses sur les capacités effectives des anticorps à inhiber la transmission et la dissémination du VIH dans les muqueuses. De tels anticorps seront à induire par vaccination pour protéger les muqueuses lors des premiers évènements de transmissions sexuelles.

Le VIH-1 doit spécifiquement sélectionner et encapsider son ARN génomique (ARNg) parmi un vaste excès d’ARN cellulaires et d’ARN viraux épissés. L’encapsidation de l’ARNg est une étape clé dans la production de virus infectieux ; cependant, de manière surprenante, peu de choses sont connues sur la manière dont le VIH-1 reconnaît son ARNg. Élucider les mécanismes moléculaires gouvernant l’encapsidation de l’ARNg pourrait permettre le développement de stratégies antivirales novatrices et l’amélioration des vecteurs rétroviraux potentiellement utiles dans le traitement du VIH-1 et d’autres maladies humaines.

Il est généralement admis que l’encapsidation de l’ARNg est assurée par des interactions spécifiques entre le précurseur protéique Gag (Pr55Gag) et une région de l’ARNg appelée Psi. Malgré des progrès récents, les interactions permettant la reconnaissance spécifique de Psi par Pr55Gag restent méconnues. D’une part, la nature exacte de Psi a été l’objet de débats intenses et la région de l’ARNg requise pour la fixation spécifique de Pr55Gag n’a été déterminée que récemment à résolution nucléotidique. D’autre part, tandis qu’il est connu depuis longtemps que le domaine de nucléocapside (NC) du précurseur Gag lie l’ARN et est un déterminant essentiel de l’efficacité et de la spécificité de l’encapsidation de l’ARNg, nous (l’équipe Marquet-Paillart) avons montré que le domaine C-terminal p6 est un facteur clé de la spécificité de fixation de Pr55Gag à l’ARN. De plus, nous avons démontré que Pr55Gag est capable de discriminer entre l’ARNg et les ARN cellulaire ou les ARN viraux épissés de manière directe, lors de l’étape initiale de fixation, mais les mécanismes moléculaires gouvernant ce processus restent mal compris, principalement à cause de l’absence de structure tridimensionnelle du complexe Pr55Gag/ARN Psi. Il reste aussi à clarifier si d’autres facteurs, tels que des protéines cellulaires liant l’ARNg et/ou Pr55Gag affectent l’encapsidation de l’ARNg.

Le but de ce projet  est de disséquer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent l’encapsidation spécifique de l’ARNg du VIH-1 dans les particules virales par une combinaison d’approches structurales et fonctionnelles.

Nos objectifs spécifiques sont :

Objectif 1 : Quelle est la structure du complexe Pr55Gag/ARN Psi ?

Objectif 2 : Des protéines cellulaires et/ou virales liant le domaine p6 de Pr55Gag régulent-elles la spécificité de fixation du précurseur aux ARN ?

Objectif 3 : L’ARNg ou des protéines cellulaires promeuvent-elles l’assemblage des particules virales ?

 Pour atteindre le premier objectif, nous tenterons de  résoudre la première structure  du complexe Pr55Gag/ARN Psi par cryo-microscopie électronique et par cristallographie aux rayons X. Une telle structure révèlerait les contacts protéine-ARN qui assurent une reconnaissance spécifique de l’ARNg par Pr55Gag.

L’objectif 2 sera atteint en comparant la fixation de Pr55Gag à l’ARNg et à des ARN viraux épissés en absence et en présence de protéines se liant au domaine p6 de Pr55Gag (Alix, Tsg101, Vpr) dans des tests biochimiques et biophysiques. Il pourrait révéler pour la première fois, que la spécificité de fixation de Pr55Gag à l’ARNg est modulée par des facteurs cellulaires (Alix, Tsg101) ou viraux (Vpr).

Pour atteindre l’objectif 3, nous développerons le premier test quantitatif d’assemblage/encapsidation, de manière à comparer l’efficacité de l’assemblage viral en présence d’ARNg et/ou d’acides nucléiques hétérologues et d ‘analyser le rôle de ligands de p6 dans l’encapsidation de l’ARNg.