Projets et candidats lauréats

La tuberculose (TB), causée par la bactérie Mycobacterium tuberculosis (Mtb), reste l’une des maladies infectieuses les plus meurtrières au monde. TB est responsable de 1.6 million de décès par an au niveau mondial. Cette situation est aggravée par l’augmentation constante et alarmante du nombre de cas de tuberculose multi- et ultra-résistante, avec près d’un demi-million de cas de ce type en 2021 selon le rapport de l’OMS (Global Tuberculosis report 2022). La force de Mtb réside dans sa capacité à survivre dans un état dormant dans les macrophages et dans les granulomes de l’hôte, puis à se réactiver dans des conditions favorables. Dans cet état dormant, la plupart des fonctions biologiques de Mtb sont ralenties, expliquant en partie la perte d’efficacité des antibiotiques. Dans ce contexte, il est urgent d’identifier de nouvelles cibles, pertinentes dans les états actif et dormant de Mtb, pour le développement de nouveaux traitements contre la TB. Les protéines contenant des centres fer-soufre (Fe-S), protéines essentielles dans divers processus biologiques (régulation de la transcription, réparation de l’ADN, métabolisme central, bioénergétique, synthèse de cofacteurs,…), constituent une famille de cibles attrayante. Le génome de Mtb contient environ 60 cadres de lecture ouverts codant pour des protéines Fe-S putatives, ayant des fonctions importantes dans les états actif et dormant de Mtb. Parmi ces protéines, les protéines WhiB utilisent leur centre Fe-S comme senseur redox pour détecter les signaux de stress rencontrés au cours de l’infection et ajustent le métabolisme de Mtb pour survivre aux conditions difficiles dans les macrophages et les granulomes, permettant de rentrer en dormance. Un moyen intéressant de cibler toutes les protéines Fe-S de Mtb en même temps serait de cibler la voie responsable de la biogenèse des centres Fe-S chez Mtb. En général, les bactéries ont plusieurs systèmes de biogenèse des centres Fe-S (ISC, SUF et/ou NIF). De façon intéressante Mtb a un seul système, le système SUF. Ce système est absent chez l’homme, où l’assemblage des centres Fe-S est réalisé par d’autres machineries. Le système SUF de Mtb est essentiel à la croissance in vitro de Mtb dans des conditions normales et a été montré comme étant un point de vulnérabilité de Mtb. De plus, le système SUF est induit dans des conditions de carence en fer, situation rencontrée par le pathogène lors de l’infection. De même, le système SUF de Mtb est régulé à la hausse dans des conditions de stress nitrosant et oxydant, facteurs de stress de la réponse immunitaire innée. Collectivement, ces données soulignent l’importance de la biogenèse et du métabolisme des centres Fe-S pour le cycle de vie de Mtb et renforcent l’hypothèse selon laquelle cibler le métabolisme des centres Fe-S dans Mtb via le système de leur biogenèse (SUF) est pertinent pour le développement de nouveaux médicaments anti-TB. Cibler le système SUF par des inhibiteurs aura d’abord un effet pléiotropique sur la capacité de Mtb à synthétiser les 60 protéines à centre Fe-S. Ensuite, cette approche désarmera Mtb en altérant sa capacité à synthétiser des centres Fe-S pour détecter les signaux de stress environnementaux, via les protéines WhiB. L’inactivation de WhiB empêchera la bactérie de s’adapter pour entrer en dormance. Le projet « FeSMtb » propose d’explorer la faisabilité d’utiliser la voie SUF de Mtb comme cible pour lutter contre la tuberculose. A cette fin, une partie du projet « FeSMtb » consistera à valider le caractère essentiel du système SUF dans la pathogénicité de Mtb. Une autre partie sera dédiée à la caractérisation structurale et fonctionnelle des protéines SUF. Une troisième partie se focalisera sur l’identification d’inhibiteurs du système SUF de Mtb, par le biais d’une approche de criblage sur cellules entières de mycobactéries ; inhibiteurs qui serviront de bases pour le développement futur de médicaments. Le projet sera réalisé en utilisant une combinaison d’approches expérimentales comprenant la génétique et la physiologie des mycobactéries, la biochimie, la spectroscopie, la biologie structurale, les modèles in vitro et in vivo de l’infection par Mtb.

De par leur localisation, les cellules dendritiques (DC) représentent des cibles préférentielles précoces de microbes transmis par voies sexuelles ou sanguines. Ainsi, ces cellules expriment différents facteurs de restriction virale spécifiques permettant de limiter toute infection ou transmission microbienne. Néanmoins, quelques pathogènes, comme le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), se sont adaptés au cours de l’évolution pour contrecarrer ou détourner ces défenses cellulaires afin d’échapper aux mécanismes de dégradation et de surveillance immunitaire et ainsi faciliter la dissémination de l’infection. La caractérisation de SAMHD1 comme étant un puissant facteur de restriction de l’infection par le VIH-1 a été une découverte majeure. Alors que cette restriction SAMHD1-dépendante a été démontrée sans ambiguïté dans la plupart des DC de lignage myéloide, l’influence de ce facteur de restriction dans les cellules de Langerhans (LC) n’est pas connue. L’impact de notre étude s’avèrerait d’autant plus important que ces cellules, principalement présentes au niveau de l’épithélium de revêtement des muqueuses et de la peau, contribueraient activement aux évènements précoces de la transmission virale. Nos données, publiées très récemment, démontrent l’existence d’une activité antivirale inconnue présente dans les LC et induite par la voie de signalisation du TGF-b. En effet, alors que le récepteur lectine de type-C langerin (exprimé spécifiquement dans les LC et aussi nommé CD207) et SAMHD1 peuvent partiellement restreindre l’entrée et l’infection virale, nous avons pu observer que ces facteurs ne sont définitivement pas les seuls acteurs de restriction du VIH-1 dans ces cellules. Le facteur beta de croissance de transformation (TGF-b de l’anglais transforming growth factor beta), une cytokine par ailleurs essentielle au développement des LC, est le facteur limitant induisant une activité antivirale forte dans ces cellules. Cette forte activité antivirale induite par le TGF-b est transposable à d’autres cellules myéloides et visibles après 24 à 48h de traitement, suggérant une régulation transcriptionnelle TGF-b-spécifique du ou des facteur(s) de restriction du VIH-1. En se rapportant à notre hypothèse d’une régulation transcriptionnelle TGF-b-dépendante de l’expression d’un facteur antiviral dans les LC, nous avons donc développé des approches ambitieuses menées sur des cellules humaines primaires et basées sur des technologies innovantes de criblage à haut-débit (IlluminaSeq, criblage par interférence ARN…) afin d’établir un transcriptome différentiel permettant, notamment, d’identifier certains facteurs cellulaires dont la fonction pourrait être reliée à l’immunité intrinsèque. Cette approche nous a permis de caractériser différentes protéines dont l’expression est fortement accrue dans les LC et en présence de TGF-b. Parmi celles-ci, la protéine S100A9 s’est révélée comme un potentiel facteur de restriction du VIH-1 majeur dans les LC. En effet, nos données montrent que la diminution d’expression de S100A9 dans les LC rend ces cellules fortement susceptibles à l’infection alors que l’expression exogène de S100A9 dans différents types cellulaires limite la réplication virale. De même, nous avons pu aussi observer que l’expression et la localisation de S100A9 sont régulées de manière TGF-b-dépendante en corrélation avec la résistance à l’infection. La restriction virale exercée par S100A9 semble se dérouler entre les étapes tardives de la reverse transcription (RT) et l’intégration du provirus. Nos résultats révèlent donc l’existence d’une nouvelle activité antivirale présente dans les LC et pour laquelle nous souhaitons maintenant caractériser le mécanisme d’action. Nos données préliminaires nous orientent pour l’instant vers 2 mécanismes possibles que nous souhaitons analyser par des approches biochimiques et génétiques. Il est d’ores et déjà clair que cette étude génèrera des données biologiques sur de nouvelles cibles et leurs mécanismes impliqués dans les évènements précoces de l’infection par le VIH-1.

Les carcinomes hépatocellulaires (CHC) sont les tumeurs hépatiques primitives du foie les plus fréquentes devant les cholangiocarcinomes. L’infection par le Virus de l’Hépatite B (VHB) est un facteur de risque majeur des CHC. Néanmoins, la co-existence fréquente d’autres facteurs de risque associés au CHC, comme l’infection par le VHC, le VHD, ou la consommation d’alcool, rend difficile l’étude de l’impact du VHB sur le CHC et, en particulier sur le microenvironnement immunitaire tumoral. L’infection par le VHB est un problème de santé publique majeur en Asie notamment, car la prévalence y est beaucoup plus importante. L’observatoire global des cancers a évalué qu’au Vietnam, le CHC est le second cancer en fréquence et la première cause de mortalité par cancer en 2022.

Au cours de nos récents travaux sur des modèles expérimentaux, nous avons émis l’hypothèse que l’expression intra-tumorale d’ARN épissées du VHB, exprimant la protéine HBSP (ARNSP1), pourrait moduler la composition et l’activité des sous populations immunitaires infiltrantes du CHC. L’impact de l’expression de l’ARN prégénomique (ARNpg) et ARNSP1 du VHB dans la tumeur n’a que très peu été étudié. Cette expression dépend notamment du degré de différentiation mais elle est indépendante de l’intégration du génome viral dans le génome cellulaire. La présence de l’ARNpg du VHB dans la tumeur a notamment été associée à une réduction de l’invasion vasculaire et à une meilleure survie. De plus, nos récents travaux suggèrent que l’infiltrat immunitaire intra-tumoral puisse varier en fonction de l’expression de l’ARNpg et de l’ARNSP1 dans la tumeur de CHC de patients, pouvant ainsi influencer l’évolution clinique et la réponse thérapeutique.

L’objectif de notre projet de recherche est d’évaluer l’impact de l’expression intra-tumorale et péri-tumorale du VHB, et en particulier de l’ARNSP1, sur le microenvironnement et l’infiltrat immunitaire (TIME) du CHC réséqué de patients Vietnamiens

Nous avons établi une collaboration avec le service de recherche clinique de l’Hôpital National du Cancer à Hanoï. Cette collaboration va nous permettre d’établir une cohorte prospective de CHC de patients sur une courte période, compte tenu de la forte incidence du CHC au Vietnam. Dans une recherche non interventionnelle, avec nos partenaires vietnamiens, cette cohorte de CHC nous permettra de caractériser le TIME de ces patients par des analyses par cytométrie en flux spectrale et par des immunohistofluorescences multiparamétrées. Cette étude sera complétée par l’exploration du contenu tumoral par des approches transcriptomiques pour analyser l’expression virale et cellulaire de façon globale et, pour certains échantillons, de façon spatiale. Enfin, les données obtenues dans ce projet de recherche pourraient soulever de nombreuses questions qui feront l’objet d’études ancillaires, explorer dans le futur avec nos partenaires vietnamiens. 

A terme, ce projet de recherche pourrait ouvrir la voie à l’intégration des données d’expression virale intra-tumorale dans le développement d’une classification multi-dimensionnelles des CHC. Il pourrait également conduire à une amélioration de la prise en charge des CHC au Vietnam.

Comprendre comment le VIH-1 est transmis et s’établissent les premières étapes d’une infection chez le nouvel hôte est crucial à des fins thérapeutiques. Les analyses génotypiques de virus isolés au stade de la primo-infection (PHI) et de virus transmis/fondateurs (T/F) ont montré que la transmission de VIH-1 est généralement le fait d’un seul variant. Il n’est cependant pas clair s’il est transmis aléatoirement ou sélectionné, et dans ce cas quelles propriétés lui ont permis d’être transmis et de s’installer chez le nouvel hôte. Dans 95 % des cas, les virus T/F et ceux de la PHI ont un tropisme R5. Il a été proposé qu’ils présentent un avantage sélectif et/ou que les virus utilisant CXCR4 comme corécepteur (virus X4 ou R5X4) sont contre-sélectionnés au moment de la transmission. La forte prévalence des virus R5 dans les premiers stades de l’infection, et implicitement l’idée que les virus X4/R5X4 ne sont probablement pas « équipés » pour être transmis, ont conduit à ne considérer que des virus R5 dans les études sur les propriétés des virus transmis. En fait, même si un certain degré de contre-sélection des virus utilisant CXCR4 a pu être rapporté (notamment des virus X4 dans le contexte d’une transmission par voie sexuelle), la littérature montre que la faible fréquence de la transmission des virus X4/R5X4 est en premier lieu le fait que leur proportion chez les individus VIH+ est faible. Des faits de transmission de virus X4/R5X4 ont en fait été rapportés, notamment quand la proportion de ces virus chez le donneur est élevée. Le suivi longitudinal de patients chez lesquels des virus X4/R5X4 ont été identifiés au stade de la PHI suggèrent aussi que ceux-ci sont compétents pour accomplir les premières étapes de l’établissement d’une infection. Ces données suggèrent donc que les virus X4/R5X4 sont transmissibles, bien que jusqu’à quel point ils le sont comparativement aux virus R5 reste incertain. Il n’est pas non plus connu si les propriétés des virus X4/R5X4 présents chez les individus nouvellement infectés diffèrent de celles des virus chroniques et dans quelle mesure elles ont contribué à installer l’infection. Enfin on ne sait pas si ces propriétés s’apparentent à celles des virus R5 T/F ou isolés lors de la PHI.

     Pour répondre à ces questions, et mieux comprendre la transmission et l’établissement d’une nouvelle infection chez l’hôte, nous étudierons des virus X4 ou R5X4 isolés du plasma d’individidus diagnostiqués au stade de la PHI, comparativement à des virus R5 du même stade ou T/F et des virus chroniques. Nous contrôlerons le relation monophylétique et la diversité restreinte des séquences d’Envs dans ces plasmas afin de déduire qu’elles ont pour origine un variant unique. Nous étudierons l’hypothèse que les virus X4/R5X4 de la PHI sont pourvus de propriétés ayant pu favoriser leur installation chez le nouvel hôte. Quatre objectifs secondaires seront poursuivis à cette fin : i/ Nous étudierons si les virus X4/R5X4 de la PHI se distinguent par la manière dont ils utilisent CD4, CCR5 et CXCR4 et leur degré de dépendance à l’expression de ces récepteurs pour l’entrée virale. Des simulations de dynamique moléculaire permettront d’obtenir une description à l’échelle atomique des interactions Env/corécepteurs. ii/ Nous étudierons si ces propriétés d’interaction avec les récepteurs s’accompagnent d’un tropisme accru pour les cellules résidentes des sites de transmission et de dissémination des virus, i.e. lymphocytes T CD4, cellules dendritiques et macrophages et iii/ résultent de modifications de propriétés structurales des Envs (séquence, conformation). Des tests de neutralization des virus par des anticorps seront réalisés à cette fin. iv/ Nous étudierons enfin si l’installation de ces virus chez l’hôte s’est faite à la faveur de leur résistance aux interférons de type I (IFN-I) et/ou, comme cela a été montré pour d’autres ligands de CXCR4, de la capacité des Envs X4/R5X4 à réprimer leur production dans les cellules dendritiques plasmacytoides. Cette étude novatrice sur des virus encore trop peu étudiés devrait enrichir notre connaissance de l’établissement de l’infection VIH et des moyens de la prévenir.

La tuberculose (TB) causée par Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est un enjeu mondial de santé publique, dont l’importance sera accentuée par la crise sanitaire de la COVID-19. Des stratégies innovantes sont nécessaires pour améliorer l’efficacité des traitements antituberculeux actuels. Le décryptage de la réponse immunitaire anti-Mtb pourrait guider des approches dirigées vers l’hôte (HDT), afin de renforcer les traitements antibiotiques dont nous disposons. Les lymphocytes T spécifiques de Mtb sont essentiels pour la guérison des patients tuberculeux. Dans ce projet nous proposons une approche translationnelle pour caractériser le répertoire des récepteurs, les fonctionnalités et les spécificités antigéniques précises des lymphocytes T spécifiques de Mtb chez les patients traités pour la TB. Ce projet d’intitiation vise à mettre au point un flux de travail innovant basé sur l’utilisation des techniques de séquençage sur cellules uniques. Pour ce faire, les lymphocytes circulants spécifiques de Mtb seront sélectionnés de manière exhaustive et non-biaisée avec un large panel de peptides Mtb couplés aux molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH), multimérisées et marquées avec des code-barres oligonucléotidiques. Chaque panel sera personnalisé en fonction des allèles du CMH du patient (au cours de ce projet l’allèle  fréquente A2 sera exploré) et de l’isolat clinique de Mtb correspondant. Par cette approche de médecine personnalisée de la TB nous allons promouvoir la détection d’antigènes rares de Mtb et de lymphocytes T spécifiques de Mtb rares, mais pertinents pour la réponse immunitaire protectrice contre la TB et pour des futurs vaccins.

Une fois mis au point et validé, ce flux sera appliqué afin d’explorer une plus large cohorte de patients. L’accomplissement d’une telle étude permettra de caractérises des lymphocytes T protectrices anti-Mtb et de nouveaux peptides immunogènes de Mtb, offrant ainsi de nouvelles perspectives de développement de HDT dans la tuberculose.

L’intégration rétrovirale est catalysée par une structure oligomérique et dynamique appelée intasome, composée de l’intégrase et de l’ADN viral, associés à des partenaires viraux et cellulaires. L’association finale intasome/chromatine régit l’efficacité de l’intégration du génome viral. Par ailleurs, l’environnement chromatinien du site d’intégration proviral détermine l’expression des gènes viraux. Ainsi, il est crucial de mieux comprendre le processus engagé dans cette étape de la réplication virale pour développer de nouvelles thérapies antivirales originales, ou de nouvelles approches permettant de réorienter l’intégration vers des régions moins favorables de la chromatine.

Malgré les données structurales récemment acquises sur les intasomes rétroviraux, aucune structure de complexe formé entre l’intasome du VIH-1 et son substrat chromatinien n’est disponible contrairement à PFV. Nos données récentes indiquent qu’une raison probable de cet échec est liée à un ancrage différent de cet intasome sur la chromatine qui l’engagerait dans une structure spécifique encore inconnue.

L’originalité de notre projet est d’aborder ces questions encore obscures sur l’association entre l’intasome du VIH-1 et le site d’intégration sur la chromatine de l’hôte en visant à obtenir des informations inédites sur la structure fonctionnelle du nucléo-complexe impliqué dans l’interaction entre les génomes (viral et cellulaire) ainsi qu’à élucider la question du rôle de cofacteurs cellulaires dans ce processus. Le but principal est d’obtenir les premières structures à résolution atomique du complexe intasome/chromatine du VIH-1 validées fonctionnellement.

Dans ce projet, nous i) déterminerons le substrat de chromatine optimal pour l’intégration du VIH-1 en utilisant des tests d’intégration in vitro et des approches d’assemblage de la chromatine maîtrisés par l’équipe partenaire 2 (Parissi, MFP Bordeaux). ii) Le substrat nucléosomal optimal ainsi identifié sera ensuite caractérisé dans des approches biophysiques et structurales de cryo-microscopie (CryoEM) dans l’équipe coordinatrice 1 (Ruff, IGBMC, Strasbourg), experte du domaine, afin d’identifier les déterminants moléculaires de l’interaction intasome/nucléosome et les interfaces fonctionnelles intasome/nucléosome. iii) Ces interfaces seront ensuite validées fonctionnellement par mutagenèse dirigée de l’intégrase (IN) réalisée sur des vecteurs lentiviraux dérivés du VIH-1 afin de suivre leur rôle dans l’efficacité d’intégration et son ciblage vers les différentes régions chromatiniennes par des tests d’infectiosité et séquençage des sites d’intégration réalisés dans l’équipe partenaire 3 (Negroni, IBMC, Strasbourg). iv) L’impact des variations génétiques de l’IN sur ces interfaces sera étudié en comparant différentes formes circulantes et différents sous-types du VIH-1 afin d’obtenir des données sur l’évolution des souches virales ainsi que de prévoir les prochaines émergences de variants possibles (équipe 3). Enfin, v) les données de structure/fonction obtenues dans ce projet serviront de base à la sélection et à la conception rationnelle de nouveaux composés chimiques inhibiteurs ciblant ces interfaces intasome/nucléosome afin de bloquer et/ou de recibler l’intégration (équipes 1, 2 et 3).

Les objectifs de notre projet s’organisent en quatre principaux volets interconnectés qui pourront être développés en parallèle. Les données fonctionnelles viendront enrichir les approches biophysiques et structurales en permettant la sélection des meilleurs candidats pour ces analyses. Les données structurales acquises serviront pour réajuster les études fonctionnelles afin d’affiner nos résultats. L’ensemble de ces données servira de base pour le design de drogues ciblant spécifiquement les interfaces intasome/nucléosome fonctionnelles ainsi définies.

Notre projet permettra ainsi de mieux définir l’environnement chromatinien du site d’intégration dont dépend l’expression du génome viral, de mieux contrôler le ciblage des complexes d’intégration vers ces sites et ainsi définir de nouvelles voies de contrôle de l’intégration lentivirale et de la latence virale (stratégie block and lock).