Projets et candidats lauréats

L’Incidence des troubles neurocognitifs va augmenter avec le vieillissement des personnes vivant avec le VIH (PVVIH). Nous avons publié une étude transversale sur la prévalence des troubles neurocognitifs (TNC) chez les PVVIH sous contrôle virologique (taux de lymphocytes TCD4 >200/mm3 depuis plus de 12 mois, charge virale indétectable depuis plus de 24 mois), appariés sur l’âge (55 à 70 ans), le genre et le niveau d’éducation à un groupe contrôle issu de la cohorte en population générale CONSTANCES (ANRS EP58 HAND 55-70). Les TNC étaient mis en évidence dans 71 (35.5%) et 242 (24.2%) des PVVIH et contrôles. Après ajustement sur les facteurs de confusion, l’infection par le VIH était significativement associée avec les TNC. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer si la fonction neurocognitive chez les PVVIH vieillissantes déclinent plus rapidement par rapport à un groupe contrôle apparié sur l’âge, le genre et le niveau d’éducation 4 à 5 ans après l’évaluation initiale. Les objectifs secondaires seront de comparer la prévalence des TNC chez les PVVIH âgées entre 55 et 75 ans avec le groupe contrôle sur un échantillon et un intervalle d’âge plus large que l’étude transversale initiale, de déterminer les mécanismes sous-jacents des TNC chez les PVVIH (cardiovasculaires, associé à l’infection VIH et/ou dégénératif), et de constituer une biothèque sérique et plasmatique de biomarqueurs. Des études ancillaires évalueront l’incidence des comorbidités et de la fragilité dans les deux populations,  et la corrélation entre biomarqueurs seiques et prévalence/incidence des TNC.

Les données seront récoltées selon les mêmes procédures que la cohorte CONSTANCES (groupe contrôle). Les mêmes tests neurocognitifs réalisés dans l’étude transversale seront réalisés après 4 à 5 ans dans les deux populations exposées au VIH et non exposées de CONSTANCES. Les normes pour les tests cognitifs seront déterminées à partir de la cohorte générale CONSTANCES, par tranche d’âge, genre et niveau d’éducation, et les scores seront comparés grâce à l’utilisation d’un Z-score. Toutes les PVVIH incluses dans l‘étude transversale et toujours suivies seront invitées à participer à l’étude de suivi, quel que soit leur charge virale et taux de lymphocytes TCD4 actuels. Il est prévu de recruter des PVVIH supplémentaires entre 55 et 75 ans pour une meilleure estimation de la prévalence des TNC, et une comparaison par tranche d’âge avec les sujets appariés de CONSTANCES.

Le critère de jugement principal sera le déclin cognitif global. Les critères de jugement secondaire seront la prévalence des TNC selon la classification de Frascati, et d’autres classifications possibles. Un panel d’experts déterminera les causes impliquées dans les TNC, après analyse de l’ensemble des documents cliniques anonymes.

Un modèle mixte hiérarchique déterminera l’évolution du Z-score moyen de 5 domaines cognitifs chez les PVVIH et le groupe contrôle entre les deux évaluations cognitives. Un modèle multivarié testera si l’infection par le VIH est un facteur associé à un déclin cognitif. Une première analyse sera réalisée avec comme groupe contrôle des volontaires de CONSTANCES ayant eu deux évaluations cognitives, puis une deuxième analyse en utilisant le suivi des volontaires de CONSTANCES de l’étude initiale ANRS EP58 HAND 55-70. Une analyse de sensibilité exclura les PVVIH ne maintenant pas un contrôle virologique < 200 copies/mL entre les deux évaluations. 

Après une analyse préliminaire en aout 2020 des premiers 5213 volontaires de CONSTANCES âgés de 55 à 70 ans à l’inclusion avec un suivi neurocognitif à 5 ans, nous avons objectivé que 13% d’entre eux ont développé un HAND selon les critères de Frascati. En appariant une PVVIH avec 5 volontaires de CONSTANCES, et en estimant que les rapports de Côtes (Odds Ratio) de déclin seraient d’au moins 1.75 plus élevés chez les PVVIH, avec un risque alpha de 5%, la puissance de notre étude serait systématiquement supérieure à 80% si au moins 160 des 201 personnes initialement analysées dans l’étude ANRS EP 58 HAND 55-70 étaient réévaluées.

Lors des processus de réplication, de transcription et de réparation de l’ADN cellulaire, l’intégrité du génome est maintenue par l’insertion ou le réassemblage de nucléosomes sur de la chromatine préexistante. Durant l’infection rétrovirale, une copie ADN du génome viral transite vers le noyau pour y être intégrée. Cet ADN viral nouvellement synthétisé et initialement dépourvu d’histones doit être chargé en nucléosome de novo afin de permettre les étapes d’expressions ultérieures. Dans le cas du gammaretrovirus murin MLV, ce dépôt de nucléosome est rapidement effectué dès l’entrée nucléaire de l’ADN viral et avant l’intégration. Chez les lentivirus tels que le VIH-1, dont le mécanisme d’import nucléaire est différent des gammaretrovirus, aucune donnée sur la chromatinisation de novo n’est disponible, laissant en suspend des questions fondamentales sur la possible régulation du processus d’intégration ainsi que de la transcription provirale par ce mécanisme. Dans ce projet de recherche nous viserons à identifier les déterminants viraux et cellulaires impliqués dans cette chromatinisation de l’ADN viral. Nous caractériserons le rôle de ce dépôt de nucléosomes sur des phases clés de la réplication avec une emphase sur l’intégration ainsi que les phénomènes de transcription et latence du provirus. Ce projet mettra en jeu des approches biochimiques, de biologie moléculaire ainsi que cellulaires. Le suivi de la chromatinisation de l’ADN viral sera un élément clé dans l’appréhension des questions posées et bénéficie d’un système d’étude par Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) mis en place et opérationnel au laboratoire. Au cours d’une première année du projet, nous identifierons la cinétique de dépôt d’histones sur l’ADN viral ainsi que les chaperonnes d’histones ayant un rôle dans ce processus en utilisant les expériences de ChIP et nous suivrons, lors d’une deuxième année leur implication dans des modèles cellulaires sauvages et déplétés par siRNA ou KO. Nous utiliserons des systèmes d’infections permettant d’étudier spécifiquement les étapes précoces de réplication mais également de mise en latence de l’élément intégré. Des approches biochimiques et structurales seront enfin développées sur une 3ème année, en utilisant l’expertise du laboratoire sur les activités fonctionnelles des intégrases rétrovirales. Ceci impliquera des tests in vitro d’intégration utilisant des ADN viraux chromatinisés afin de mesurer l’impact de la compaction de l’ADN viral sur l’activité d’intégration. L’ensemble de ce projet permettra de mettre en lumière un étape non encore investiguée du cycle de réplication du VIH-1 et ainsi de dévoiler et caractériser de nouvelles cibles thérapeutiques.

La tuberculose est une maladie infectieuse chronique causée par Mycobacterium tuberculosis responsable de 10 millions de cas de maladie active et 1,4 million de décès en 2019. Le vaccin vivant atténué BCG dérivé de M. bovis par Calmette et Guérin il y a 100 ans, représente toujours le seul vaccin antituberculeux autorisé. Cependant, alors que la vaccination des jeunes enfants par le BCG les protège efficacement, elle ne prévient pas la tuberculose pulmonaire à l’âge adulte. Le développement d’un vaccin plus puissant est donc urgemment nécessaire pour contrôler l’épidémie mondiale.

En comparant le BCG à M. bovis et M. tuberculosis, nous avons montré que la région génomique de différence 1 (RD1) est absente de toutes les souches de BCG mais qu’elle est conservée dans tous les isolats virulents de M. bovis et MTB. Les protéines codées par le segment RD1 sont impliquées dans plusieurs processus biologiques et interactions hôte-pathogène importants. Elles comprennent les antigènes immunodominants ESAT-6 et CFP-10, qui concourent à la capacité de MTB à s’échapper du phagosome en rompant la membrane phagosomale du phagocyte hôte, ainsi que les composants structurels du système de sécrétion ESAT-6 (ESX)-1 qui participent à la sécrétion de ces deux antigènes. Nous avons construit des souches de BCG recombinantes capables d’accéder au cytosol comme MTB en clonant le système de sécrétion ESX-1 de MTB ou M. marinum dans le génome du BCG. L’insertion du locus esx-1 de M. marinum dans le BCG (BCG:ESX-1Mmar) a conféré une protection plus forte par rapport au BCG chez la souris, avec une immunogénicité et une efficacité similaires au BCG:ESX-1Mtb mais avec une virulence plus faible. L’expression d’ESX-1 a entraîné une signalisation cytosolique suivant l’axe cGas/STING/TBK1/IRF-3/interféron de type I et une activité accrue de l’inflammasome AIM2 et NLRP3, ainsi que l’augmentation de la fréquence des cellules T CD4+ et CD8+ spécifiques des mycobactéries.

Le BCG est connu pour ses effets protecteurs non-spécifiques qui reposent sur l’immunité entraînée, également appelée mémoire immunitaire innée. Les monocytes et les neutrophiles entraînés présentent une réactivité accrue, y compris des fonctions anti-mycobactériennes améliorées, qui participent aux effets protecteurs du BCG.

Nous évaluerons si le BCG:ESX-1Mmar peut reprogrammer fonctionnellement et durablement les cellules myéloïdes innées, de manière similaire ou différente du BCG, sachant que l’IFN-g et l’IL-1b produits en réponse au BCG et au b-glucan (un autre stimulus d’immunité entrainée canonique), respectivement, favorisent l’immunité entraînée, alors que les IFN de type I induits par MTB au contraire l’empêchent, et que BCG :ESX-1Mmar provoque la sécrétion d’IFN-b par les monocytes in vitro, contrairement au BCG mais à un niveau inférieur par rapport au MTB, et d’IL-1b de manière similaire au MTB mais à un niveau supérieur au BCG.

Nous comparerons BCG:ESX-1Mmar et BCG pour leur capacité à entraîner des monocytes in vitro et à induire une mémoire immunitaire dans le compartiment myéloïde inné in vivo en immunisant des macaques (n=5/groupe). L’hypothèse d’une contribution de l’inflammation systémique précoce et/ou de la présence du vaccin dans la moelle osseuse, qui devraient différer entre BCG:ESX-1Mmar et BCG, à la reprogrammation de la myélopoïèse et à la modification à long terme des monocytes et neutrophiles sanguins sera testée avec une analyse de corrélation multivariée, et in vitro en utilisant un modèle cellulaire basé sur la différenciation de progéniteurs hématopoïétiques en présence de plasma d’animaux immunisés et/ou de monocytes infectés in vitro autologues.

Ce travail collaboratif implique deux équipes aux expertises complémentaires dans le domaine des interactions de MTB avec les cellules immunitaires de l’hôte, de l’immunologie des vaccins, y compris l’immunité entraînée, et des modèles primates non humains. Il devrait accélérer le développement du BCG:ESX-1Mmar en tant que vaccin en élucidant davantage ses modes d’action. Il devrait aussi contribuer à mieux comprendre les mécanismes d’induction de l’immunité entraînée en utilisant BCG:ESX-1Mmar comme outil.

L’épitranscriptomique et son contrôle sur la réplication virale est un domaine émergent. Son rôle dans la réplication du VIH est indiscutable, mais ses modes d’actions restent inconnus. La méthylation des N6 des adénines (m6A) est l’une des modifications importantes de l’ARN affectant l’expression des gènes cellulaires et viraux. Il a été démontré que l’ARN génomique du VIH est méthylé principalement dans les régions 5 ‘et 3′ non traduites ainsi que dans le RRE et la région codante Gag. Des résultats préliminaires provenant du laboratoire de notre collaborateur R. Soto-Rifo suggèrent fortement que la méthylation des N6A et sa dynamique jouent un rôle important dans la transition de la traduction des polyprotéine Gag et Gag-pol à l’encapsidation de l’ARN génomique. En effet, contrairement à l’encapsidation de l’ARNg, ceux présents dans le cytoplasme sont méthylés dans le 5’UTR. Dans ce projet, nous suivrons une approche multidisciplinaire pour caractériser l’impact de la méthylation du N6 des Adenines sur différents aspects interconnectés du cycle de vie du VIH-1. Nous évaluerons l’effet de m6A sur la structure de l’ARNg, sa dimérisation pré-encapsidation ainsi que sur la synthèse des polyprotéines Gag et Gag-pol. Ceci sera réalisé de manière synergique à la fois in vitro et in cellulo. Pour ce faire, des outils (chimiques et biochimiques) seront développés pour reproduire in vitro la méthylation spécifique des adénosines en position N6, ainsi que pour suivre et caractériser la méthylation m6A dans les cellules. En effet, le procédé actuel permettant de détecter les m6A dans une séquence d’ARN est trop imprécis. Cette même technologie sera également utilisée pour caractériser les methylations dans le génome de l’hôte. La capacité à marquer enzymatiquement l’ARN in vitro permettra de préparer des séquences d’ARN du VIH-1 qui seront soumises à des essais de dimérisation, au sondage de la structure par SHAPE ou à des essais de traductions in vitro et in vivo. En parallèle, la méthylation N6A du VIH-2 in cellulo sera caractérisée pour doter notre étude d’un raisonnement phylogénétique. Suivant la même chimie, notre collaborateur M. Ethève-Quelquejeu aura pour objectif de développer des agents chimiques permettant de piéger des protéines spécifiquement assemblées sur les sites m6A de l’ARN génomique du VIH-1. Ces outils seront utilisés pour définir les complexes protéiques responsables du processus de régulation. Enfin dans les dernières étapes du projet nous utiliserons cette nouvelle méthodologie pour obtenir des ARN fluorescents, ce qui nous permettra de suivre les déplacements de l’ARN viral dans la cellule. Le succès du projet nécessitera la collaboration étroite des trois équipes qui apportent chacune des compétences spécifiques. L’agrégation des résultats définira l’influence de m6A sur les différentes étapes du passage de la traduction à l’encapsidation, l’objectif final étant de comprendre comment la méthylation des N6A régule cet aspect du cycle viral. Les résultats préliminaires sur l’encapsidation de l’ARNg, ainsi que sur les propriétés de structure et de dimérisation de l’ARN du VIH complètement méthylé, ne laissent aucun doute sur l’importance de m6A sur la réplication du VIH-1. Bien que certaines des étapes de recherche proposées soient novatrices, elles se situent dans la gamme des compétences de chacune des équipes et nous ne prévoyons pas de difficultés majeures. Pour les incertitudes identifiées, principalement concernant l’application in vivo des outils chimiques, elles sont étayées par une approche la plus sûre, partiellement in vitro. Au final, nous pensons que notre étude apportera des éléments de réponse sur une question importante concernant le cycle de vie du VIH-1 qui est resté ouverte depuis 40 ans : quelles sont les facteurs déclenchant le passage de la traduction à l’encapsidation de l’ARNg.

De nouvelles stratégies sont nécessaires pour réduire la mortalité des patients infectés par le VIH atteints de tuberculose (TB) méningée (TBM), qui atteint 50 à 70% malgré le traitement anti-tuberculeux (TAT). L’excès d’inflammation est un mécanisme important de sévérité de la TBM. Les corticoïdes sont recommandés à fortes doses pendant les 6 à 8 premières semaines du TAT chez les patients VIH-négatifs. Les anti- TNF ont été utilisés pour traiter le syndrome de restauration immune (IRIS) sévère chez quelques patients atteints de TB, mais aucun essai clinique n’a jusqu’ici évalué l’impact de cette stratégie sur la mortalité de la TBM au cours de l’infection à VIH.  L’adalimumab est recommandé pour traiter les maladies inflammatoires de l’intestin ou la polyarthrite rhumatoïde.

Notre objectif principal est d’évaluer l’impact sur la mortalité à 9 mois de l’ajout de l’adalimumab au TAT pendant 12 semaines chez les patients infectés par le VIH et atteints de TBM. Les objectifs secondaires incluent la comparaison des 2 stratégies en termes de survenue d’infections sévères sur les 3 premiers mois de suivi, de séquelles neurologiques et de morbidité sévère à 9 mois (effets indésirables de grade 3 et 4), d’évolution biochimique et microbiologique du liquide céphalo-rachidien (LCR), de succès virologique et immunologique sous antirétroviraux (ARV) à 9 mois, évolution des biomarqueurs inflammatoires et des cytokines dans le plasma et le LCR.

Tous les adultes infectés par le VIH, naïfs d’ARV, avec une TBM se verront proposer de participer à cette étude 0 à 3 jours après le début du TAT et des corticoïdes. Les principaux critères d’exclusion seront des infections neurologiques concomitantes, une TB résistante à la rifampicine et la grossesse.

Les patients seront randomisés (1 :1) pour recevoir un traitement standard (TAT aux doses standard avec de fortes doses de dexaméthasone),  ou un traitement standard + adalimumab (une injection sous-cutanée de 40 mg d’adalimumab toutes les 2 semaines de S0 à S10 ; 6 injections). Les ARV seront introduits après 4 semaines (et 8 semaines au maximum) de TAT dans les deux bras.

Les visites de suivi, seront organisées à S2, S4, S6, S8, S10 pour permettre les injections d’adalimumab puis à S12, M6 et M9 du TAT, et incluront une évaluation clinique, des prélèvements sanguins usuels (+ LCR à S0, S4 et S10), une biothèque (plasma+ LCR à S0, S4 et S10), des tests de grossesse chez les femmes en âge de procréer.

L’innocuité en termes d’infections sévères sera surveillée par la notification en ligne des événements indésirables graves avec observation clinique détaillée, la validation à distance par un comité international d’évaluation des événements, l’accès en temps réel du comité indépendant de surveillance (CIS) et revue des analyses intermédiaires par le CIS. Les inclusions seront temporairement interrompues après 40 patients pour permettre une analyse intermédiaire et la validation de la poursuite de l’essai par le CIS.

63 patients seront randomisés dans chaque bras pour tester l’hypothèse nulle d’une proportion de survie <50% contre l’hypothèse alternative d’au moins 70% de survie à 9 mois, avec une erreur de type I unilatérale de 10% et une puissance de 80% dans le bras intervention. La mortalité sera évaluée dans le bras contrôle avec une précision de 12%. Les données de tolérance seront analysées par le comité indépendant par tranches de 10 patients inclus dans le bras adalimumab de façon à pouvoir détecter des effets délétères du traitement.

Ce projet pourrait débuter mi 2020 au Vietnam, Brésil et Mozambique. Le projet dans son ensemble durera 3,5 ans pour une durée totale de l’essai de 27 mois (2,25 ans).

Cet essai clinique est une étude de preuve de concept d’une approche innovante pour réduire la mortalité chez les patients infectés par le VIH atteints de TBM. Cette étude randomisée de phase II permettra de valider l’approche proposée chez un petit nombre de patients avant d’envisager une étude de phase III qui permettra de confirmer les résultats. Le contexte de mise à disposition de biosimilaires des anti-TNF ouvre des perspectives d’accès à ce traitement dans de nombreux pays.