Projets et candidats lauréats

Les lymphocytes T CD4 + sont les principales cibles de l’infection par le VIH-1. Le virus est reconnu par les senseurs du système immunitaire inné dès son entrée dans les cellules cibles, conduisant à la production de cytokines antivirales et pro-inflammatoires. Cependant, l’infection des lymphocytes T CD4 + par le VIH-1 conduit à une production extrêmement faible d’IFN qui ne permet pas une activation suffisante de la réponse antivirale, suggérant que le virus est capable de bloquer cette réponse qui serait délétère pour sa réplication.

L’autophagie est une voie catabolique majeure impliquée dans plusieurs fonctions cellulaires importantes. Notamment, c’est un mécanisme d’immunité intrinsèque car il permet la dégradation des agents pathogènes après leur entrée dans les cellules cibles. De plus, l’autophagie permet la dégradation de plusieurs médiateurs de l’immunité innée permettant un retour à un état basal du système immunitaire après son activation suite à une infection. Par conséquent, les agents pathogènes ont développé des mécanismes leur permettant de bloquer l’autophagie ou de l’utiliser à leur propre profit afin de favoriser leur réplication. En particulier, de plus en plus d’études montrent que les virus utilisent l’autophagie pour bloquer la réponse IFN. Dans ce contexte, les mitochondries et les peroxisomes sont deux organelles cellulaires impliquées dans la réponse immunitaire innée et qui sont ciblées par l’autophagie au cours d’infections virales.

Nous avons montré que les protéines d’enveloppe du VIH-1 (Env) induisent l’autophagie dès la phase d’entrée du VIH-1 dans les LT CD4+ mais ce processus est rapidement bloqué et inhibé dans ces cellules lorsque l’infection devient productive, suggérant que le VIH-1 a développé des stratégies pour le contrôler. De façon intéressante, nos résultats préliminaires indiquent que l’autophagie, induite transitoirement à l’entrée du virus dans les LT CD4+, favorise sa réplication. Récemment, nous avons montré que les peroxysomes sont des cibles de l’autophagie induite par Env (mécanisme appelé « pexophagie »). De plus, nos résultats (non publiés) suggèrent que les mitochondries pourraient être ciblées par l’autophagie induite dans les phases précoces de l’infection des LT CD4+ par le VIH-1 (processus appelé « mitophagie »). Ces deux organelles, mitochondries et peroxysomes, sont d’important médiateurs de la réponse au stress oxydatif.

Notre projet a pour objectif de caractériser plus en avant les processus de mitophagie et de pexophagie induits dans les étapes précoces de l’infection par le VIH-1 et de définir leurs conséquences sur la réponse immunitaire contre ce virus. Il se décline en 3 grandes étapes :

– Etude de la dynamique de dégradation des mitochondries et des peroxysomes dans les premières étapes de l’infection par le VIH-1.

– Recherche des mécanismes d’autophagie sélective impliqués dans la dégradation des mitochondries et des peroxysomes.

– Effet de la dégradation des mitochondries et des peroxysomes sur l’état oxydatif de la cellule infectée et conséquences sur l’homéostasie cellulaire, la réponse immunitaire innée et l’inflammasome.

Plusieurs travaux font état du rôle de l’autophagie au cours de l’infection par le VIH-1 dans différents contextes cellulaires mais aucune étude n’a mis en évidence son rôle dans les 1ères étapes du cycle de réplication du virus dans les LT CD4+. Il est donc important de progresser dans cette compréhension afin de pouvoir proposer, à plus long terme, de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur la réponse cellulaire.

La mutation responsable de la dystrophie musculaire rare LGMD1F (limb girdle muscular dystrophy 1F) est une délétion d’un seul nucléotide dans le codon stop de la transportine 3 (TNPO3). Cette mutation conduit à une extension de la protéine en C-ter sur 15 acides aminés, produisant une protéine de fonction inconnue (TNPO3_mut) qui est co-exprimée avec la protéine TNPO3 sauvage (TNPO3_wt). TNPO3 a été impliquée dans le transport nucléaire de protéines riches en sérine / arginine, telles que les facteurs d’épissage alternatif, ainsi que dans l’infection par le VIH-1 en agissant sur la capside virale. Nos données préliminaires montrent que cette mutation génétique rare confère une protection contre le VIH-1 in vitro, faisant de cette mutation la deuxième anomalie génétique décrite jusqu’à présent qui confère une forte résistance à l’infection par le VIH-1. L’objectif du projet est d’approfondir notre compréhension de l’impact de TNPO3 sur le VIH-1 en se basant sur les patients LGMD1F. Premièrement, nous visons à comprendre le fonctionnement de cette forme mutante de TNPO3 et à évaluer son impact sur les fonctions cellulaires: examiner si TNPO3_mut a un effet dominant négatif sur TNPO3, la distribution cellulaire de TNPO3 et des facteurs d’épissage, la structure du cytosquelette et les modifications post-traductionnelles des microtubules dans les cellules de patient et en lignées cellulaires modèles de la maladie. Deuxièmement, en utilisant la mutation LGMD1F comme modèle, nous étudierons les mécanismes d’interférence sur l’infection par le VIH: identifier l’étape du cycle viral bloquée par TNPO3, examiner l’effet de la mutation sur le transport de la capside et l’induction de l’IFN, caractériser la localisation des provirus intégrés dans la topographie nucléaire et le paysage d’intégration dans les cellules TNPO3_mut. Si les objectifs du projet sont atteints, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’inhibition de l’infection VIH par la TNPO3 défectueuse chez les patients LGMD1F. D’un point de vue technique et translationnel, notre projet développera des techniques innovantes (BRET, CRISPR / Cas9 FISH de provirus intégrés) qui pourraient ouvrir de nouvelles possibilités de recherche.

L’intégration du génome du rétroviral dans la cellule infectée est une étape clé du cycle réplicatif permettant de pérenniser l’infection. L’interaction fonctionnelle entre l’intasome (complexe formé entre l’ADN viral et l’intégrase, IN) et le nucléosome, complexe final siège de l’intégration, constitue le premier point de contact entre le génome viral et cellulaire. Cette association représente, ainsi, une plateforme d’échanges moléculaires entre le virus et l’hôte. Notre projet vise par une combinaison d’approches biochimiques, fonctionnelles et cellulaires, à définir les interfaces entre le complexe d’intégration du VIH-1 et son substrat cellulaire nucléosomal afin de comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu au sein de cette plateforme d’échanges.

Dans ce travail, nous i) caractériserons les interfaces physiques et fonctionnelles entre l’intasome et le nucléosome humain dans un contexte de nucléosome isolé mais aussi dans le cadre de differentes structures chromatiniennes ; ii) déterminerons comment ces interfaces sont régulées par les facteurs cellulaires précédemment identifiés (cofacteurs de l’IN, structure et remodelage de la chromatine, machineries associées à la transcription) ; iii) développerons la première approche thérapeutique ciblant spécifiquement les interfaces intasome/nucleosome par la technique Alphascreen.

Ce projet permettra notamment de déterminer comment cette association intasome/nucléosome peut affecter le choix du site d’insertion de l’ADN viral, l’efficacité d’intégration et de réplication du virus ainsi que le développement d’approches thérapeutiques innovantes. Notre travail constituera ainsi la première caractérisation d’envergure du complexe intasome/nucléosome, intermédiaire central de l’intégration et de la réplication virale.

L’intestin est un compartiment clé pour la réplication du VIH-1, dès les stades précoces de l’infection, entraînant une déplétion profonde des lymphocytes T CD4+ dans la muqueuse intestinale, notamment les cellules productrices d’IL-17 (Th17, Th1Th17) qui jouent un rôle central dans l’homéostasie muqueuse.

Dans l’étude ANRS EP44, nous avons observé un défaut de reconstitution des lymphocytes T CD4+ dans la muqueuse intestinale sous traitement antirétroviral, en particulier des Th17 et Th1Th17, notamment du fait d’altérations du recrutement des lymphocytes T CD4+ du sang vers le compartiment intestinal.

La caractérisation virologique réalisée chez les individus de l’étude ANRS EP44 a révélé la persistance d’une fraction augmentée de T CD4+ hébergeant de l’ADN VIH-1 par rapport aux T CD4+ sanguins, la persistance d’une production virale résiduelle, et une compartimentation des populations virales dans l’intestin chez plus de 75% des individus étudiés.

Le projet proposé a pour objectif de mieux caractériser les cellules cibles du VIH-1 dans la muqueuse intestinale, notamment en fonction du tropisme d’utilisation des corécepteurs CCR5 et CXCR4. Nous avons développé un modèle d’histocultures de tissu intestinal humain permettant d’étudier l’infection des différentes sous-populations de T CD4+ dans le micro-environnement tissulaire muqueux. Nos résultats préliminaires montrent que les virus utilisant CCR5 infecteraient préférentiellement les T CD4+ CCR6+, en particulier les Th1Th17 et Th17, alors que les virus utilisant exclusivement CXCR4 cibleraient préférentiellement les T CD4+ CCR6-. Nous chercherons à mieux caractériser les sous-populations de T CD4+ ciblées par les virus utilisant CCR5, notamment les Th17, Th1Th17, Th22 ainsi que les sous-populations de Treg CCR6+ vs. CCR6-, et à comparer les cinétiques d’infection entre ces sous-populations. Nous chercherons également à préciser les sous-populations ciblées préférentiellement par les virus utilisant CXCR4, et à mieux comprendre les facteurs de susceptibilités à l’infection entre ces sous-populations T CD4+ en fonction du tropisme viral.

La caractérisation des cellules cibles du VIH-1 dans la muqueuse intestinale, et les différences de susceptibilités selon le tropisme viral pour CCR5 ou CXCR4 pourraient permettre de mieux comprendre le rôle de ce compartiment dans la sélection des virus utilisant CCR5 observée aux stades précoces de l’infection. Ce projet pourrait également avoir des implications concernant la persistance du VIH-1 sous traitement antirétroviral.

TLR7 et TLR8 sont des récepteurs Toll dont les gènes sont codés sur le chromosome X. Ils sont présents dans les endosomes et sont activés par des séquences d’ARN simple brin provenant de virus comme le VIH-1. Ils sont exprimés simultanément par les lymphocytes T  (LT) CD4+ et les monocytes, et l’interaction entre VIH-1 et TLR7 ou TLR8 peut avoir des impacts fonctionnels distincts sur les LT CD4+ humains ou les monocytes. En particulier, il a été récemment montré que la stimulation des LT CD4+ humains avec des ligands de TLR8 amplifie l’activation via le TCR, la production de cytokines pro-inflammatoires et promeut leur différenciation en cellules effectrices Th1/Th17. L’activation de TLR8 favorise la réplication du VIH-1 et induit la réversion de la latence dans les LT CD4+ de patients VIH+ avirémique. Nous avons établi que TLR8, comme TLR7, sous leur forme clivée active, sont bien exprimés dans les LT CD4+ d’hommes et de femmes. En visualisant les transcrits primaires en RNA FISH, nous avons démontré que le gène TLR8, comme TLR7, échappe à l’inactivation du chromosome X dans les LT CD4+ et les monocytes, et présentent également un profil d’expression distinct sur le chromosome X actif, co-dépendant chez les femmes, et mutuellement exclusif sur l’X des hommes. Par conséquent, à l’échelle unicellulaire les cellules exprimant les deux gènes simultanément sont 7-fois moins fréquentes chez les hommes comparées aux femmes. Ces résultats indiquent que les gènes TLR7 et TLR8 forment un cluster de gènes corégulés que nous avons appelé « X-linked Toll-like receptor locus » (Youness et al., soumis). La prise en compte du sexe dans l’analyse des interactions VIH-1/LT CD4 nous apparait donc essentiel, ce qui curieusement n’a jamais été pris en considération jusqu’à présent.

            Nos objectifs seront d’étudier 1) s’il existe un biais du sexe dans l’infection par le VIH-1 dans les cellules T CD4+ et 2) si l’expression bi-allélique de TLR8 dans les LT CD4+ de femmes leur donne un avantage dans l’infection et/ou la réversion de la latence des LT CD4+ infectées.

            Ce projet s’articulera autour de 3 objectifs spécifiques :

1) Impact de l’activation de TLR8 sur la permissivité à l’infection par le VIH-1 des LT CD4+ activés en fonction du sexe

2) Rôle de TLR8 dans l’infection VIH-1 dans les LT CD4+ provenant d’un tissu lymphoïde, les amygdales, en fonction du sexe

3) Impact de l’activation de TLR8 sur la réversion du VIH-1 latent dans les LT CD4+ en fonction du sexe.

            Notre hypothèse de travail est que le bais de sexe dans l’infection VIH-1 pourrait être lié à un biais de sexe dans la susceptibilité à l’infection productive des LT CD4+ et/ou à un biais de sexe dans l’établissement du réservoir latent. Cette différence liée au sexe pourrait être intrinsèque aux LT et dû à l’expression différentielle du récepteur TLR8 codée par l’X entre les cellules T CD4+ d’hommes et de femmes. Une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les facteurs biologiques liés au sexe impactent l’inversion de la latence et la persistance du VIH-1 pourrait promouvoir le développement d’approche thérapeutique spécifique à chaque sexe.

Le zinc est un oligo-élément essentiel utilisé comme cofacteur par de nombreuses enzymes qui peuvent se structurer en des motifs particuliers appelés doigts de zinc. Le zinc naturel se présente sous la forme d’un mélange de 5 isotopes stables avec des abondances relatives variables. Le fractionnement isotopique du zinc correspond à une modification des rapports de ces abondances. Ce phénomène a déjà été observé dans plusieurs conditions physiologiques et pathologiques tels que certains cancer ou les maladies neurodégénératives. Le HIV-1 code pour une protéine de nucléocapside (NCp7) de 7 kDa comprenant deux motifs à doigts de zinc avec une très haute affinité. Les atomes de zinc étant nécessaires à l’activité de NCp7 et au bon déroulement du cycle viral, ils ont été la cible de nombreuses stratégies antivirales. Cependant, aucune étude à ce jour ne s’est intéressée au fractionnement isotopique au cours de l’infection virale.

Dans cette étude, nous souhaitons atteindre 3 objectifs :

(1) Mesurer le fractionnement isotopique du zinc dans les particules virales

(2) Déterminer l’influence d’une dérégulation de la composition isotopique naturelle du zinc sur la production du virus HIV-1 et son caractère infectieux

(3) Déterminer et comparer les caractéristiques biochimiques de protéine NCp7 synthétique contenant différents isotopes du zinc.

Nos résultats préliminaires nous ont déjà permis de montrer un fractionnement isotopique du zinc dans les particules virales HIV-1 purifiées comparées au milieu intra et extracellulaire. Nous souhaitons donc dans un premier temps valider ces résultats dans différents modèles cellulaires (0-6mois). Ensuite les objectifs 2 et 3 pourront être menés de front et de manière indépendante. Nous comptons produire du virus dans des conditions où nous aurons modifié l’abondance naturelle des isotopes du zinc en ajoutant au milieu de culture un isotope enrichi disponible commercialement (6-24mois). En parallèle, la protéine NCp7 sera produite par la plateforme SFR Biosciences (0-6mois), puis des tests in vitro seront réalisés afin d’étudier ses propriétés biochimiques en présence de différents isotopes du Zinc (6-24 mois).

Ce projet est original et innovant et il pourrait mener à considérer les isotopes du Zinc comme biomarqueurs de l’infection par le HIV-1 et même ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Enfin, nous pourrions étendre ces études à d’autres modèles viraux ainsi qu’à d’autres cellules immunitaires (macrophages, cellules primaires, etc.).

L’utilisation des thérapies antirétrovirales (cART) est très efficace pour supprimer la réplication du VIH-1. Cependant, l’infection par le VIH ne peut pas être éradiquée car le virus persiste dans les réservoirs cellulaires, tels que les cellules CD4+T infectées de manière latente, contenant des provirus silencieux mais capables de transcription. Ces provirus latents ont la capacité de se réactiver lors de l’interruption des traitements, entraînant un rebond rapide de l’infection. Le développement de nouveaux agents thérapeutiques ciblant les cellules infectées de manière latente est donc crucial dans la course à la guérison de l’infection par le VIH-1.

La latence est un processus multifactoriel contrôlé par l’état de la chromatine au site d’intégration ainsi que par la disponibilité des facteurs transcriptionnels et post-transcriptionnels. L’une des étapes majeures contrôlant la modulation du provirus VIH-1 est la pause-redémarrage de l’ARN Polymérase II (ARNPII) dans la région proximale du site d’initiation de la transcription. Un blocage du redémarrage de l’ARNPII après la pause peut entraîner une terminaison prématurée de la transcription.

Nous décrivons ici deux activateurs transcriptionnels, SPT6 et BRD4, comme étant des répresseurs de l’expression du VIH-1. SPT6 est un facteur d’élongation de la transcription qui a été récemment décrit pour contrôler la terminaison de la transcription des gènes cellulaires. De même, BRD4 qui est une protéine connue pour interagir avec les régulateurs transcriptionnels et se lier aux promoteurs et enhancers actifs. Paradoxalement, ces deux facteurs exercent des rôles répressifs sur l’expression du VIH-1. Des études récentes ont montré que BRD4 recrutait des facteurs d’élongation, notamment SPT6 et la machinerie de terminaison en 3’ des ARNm, lors d’un point de contrôle de l’ARNPII. De fait, ce mécanisme moléculaire pourrait expliquer nos observations récentes sur le rôle de SPT6 et du complexe CPA dans la répression de la transcription du VIH dans les cellules latentes.

Nos données préliminaires confirment que SPT6 interagit avec BRD4 et la sous-unité catalytique du complexe de clivage et de polyadénylation (CPA) et inhibe l’expression du VIH dépendamment du signal de polyadénylation présent dans le 5’LTR. Nous montrons également que l’inhibition de ce complexe réactive de manière significative l’expression du VIH dans plusieurs modèles de latence. Ainsi, notre hypothèse est que dans les cellules infectées de manière latente, BRD4 et SPT6 s’associent à l’ARNPII en pause au niveau du 5’LTR et recrutent le complexe CPA pour induire la terminaison prématurée de la transcription du VIH. Ce mécanisme pourrait être directement ciblé par dBet6, un dégradeur rapide et spécifique de BRD4, pour induire la réactivation de l’expression du VIH.

Dans ce projet, nous utiliserons une combinaison d’approches biochimiques et moléculaires pour valider et caractériser le complexe SPT6-BRD4-CPA. Nous étudierons les mécanismes de recrutement de ces protéines au provirus. De plus, nous étudierons le rôle de ce complexe dans l’établissement de la latence du VIH-1 dans les lymphocytes T CD4+ humains primaires. Ce modèle de latence sera également utilisé pour déterminer si la terminaison prématurée de la transcription du VIH-1 nécessite la présence de SPT6 et de BRD4. Surtout, nous évaluerons le potentiel de dBet6 seul, ou en combinaison avec d’autres agents de réversion de la latence (LRA), sur la réactivation du VIH-1. Nous évaluerons l’effet de ces combinaisons dans des lignées cellulaires infectées par le VIH-1 et des modèles de cellules primaires d’origine lymphoïde T et myéloïde. Enfin, nous analyserons l’effet des combinaisons les plus prometteuses sur la réactivation de l’expression virale dans des cultures ex vivo de PBMC déplétées en CD8+ isolées du sang de patients VIH+ sous cART.

Notre projet révèle un nouveau mécanisme moléculaire impliqué dans la latence du VIH-1 et vise à fournir une preuve de concept selon laquelle la perturbation de la terminaison prématurée de la transcription pourrait conduire à la réactivation de provirus latents dans les stratégies de guérison du VIH.

Les populations de cellules dendritiques (DC) sont hétérogènes et jouent un double rôle en ce qui concerne le VIH-1: acteurs clés de l’établissement et de la propagation de l’infection par le VIH-1, les DC provoquent également des réponses immunitaires anti-virales innées et adaptatives. Récemment, le développement d’approches à haute dimension a permis l’identification de pré-DC, une nouvelle population de précurseurs circulants des DC. En dehors de leur rôle dans l’ontogenèse, les fonctions immunitaires des pré-DC restent à établir. Les pré-DC sont équipées d’une variété de récepteurs de type lectine, dont certains sont connus pour se lier au VIH-1. Le présent projet vise à définir précisément les altérations des fonctions pré-DC induites par le VIH-1 in vitro et chez les patients infectés en utilisant des approches à haute dimension.

Nos résultats montrent que les pré-DC sont la population de DC la plus sensible à l’infection par le VIH-1 et qu’elles permettent la dissémination du VIH-1 aux cellules T CD4 + in vitro. La capture du VIH-1 et l’infection des pré-DC sont dépendantes de Siglec-1 (CD169). Siglec-1 est un récepteur de type lectine qui est exprimé de façon unique par les pré-DC de manière constitutive. Lors de l’activation, les pré-DC deviennent résistantes à l’infection par le VIH-1. Elles deviennent alors capables de transférer le virus (sans être infectées) vers les lymphocytes T primaires activés. Ce mécanisme de transfert est également médié par Siglec-1. Fait important, le VIH-1 s’assemble à la membrane plasmique des cDC2 infectées de la même façon que dans les lymphocytes T. A l’inverse, les pré-DC infectées par le VIH-1 produisent et accumulent de nouveaux virions dans des compartiments internes en contact avec le milieu extracellulaire (similaires à ceux observés dans la macrophages).

Notre projet vise à comprendre la dynamique et les fonctions des pré-DC dans le contexte de l’infection par le VIH-1 in vivo et in vitro. L’objectif à long terme du projet est d’établir le rôle des pré-CD pendant l’infection par le VIH, de la population cellulaire jusqu’au niveau de la cellule unique, en étudiant leur pertinence dans la dissémination du VIH et la génération de la réponse immunitaire antivirale. Le projet s’articule autour de trois questions principales: i) Comment l’exposition au VIH-1 affecte-t-elle les fonctions immunitaires des pré-DC: détection virale, différenciation et capacité de migration? ii) Les pré-DC participent-elles à la physiopathologie de l’infection par le VIH-1? iii) Quels sont les déterminants moléculaires impliqués dans l’assemblage du VIH-1 dans les pré-DC?

En utilisant des approches à « haute dimension » réalisées en combinaison avec des méthodes phénotypiques et fonctionnelles, nous caractériserons les voies moléculaires induites par la détection et la réplication du VIH-1. Les effets du VIH-1 sur la différenciation des pré-DC et sur leur capacité de migration seront également évalués en utilisant des systèmes de culture établis. Nous déterminerons en outre si des pré-DC infectées sont présentes chez les patients infectés par le VIH-1. La dynamique et les fonctions des populations de DC seront évaluées dans différentes cohortes de patients infectés par le VIH-1. Enfin, nous utiliserons le modèle pré-DC / cDC2 pour identifier les acteurs moléculaires impliqués dans la formation et la régulation des compartiments contenant le virus.

Nos résultats concernant la susceptibilité pré-DC à l’infection par le VIH-1 et leur capacité à transmettre le virus aux cellules T CD4 + suggèrent un rôle potentiellement important des pré-DC dans la physiopathologie du VIH-1. Élargir nos connaissances concernant les pré-DC nouvellement définies pourrait également aider à la conception de nouvelles stratégies en immunothérapie.