Projets et candidats lauréats

Le virus de l’hépatite E (VHE) est l’une des premières causes d’hépatite dans le monde. Bien que l’infection par le VHE soit asymptomatique dans 70% des cas, des formes fulminantes, chroniques et des atteintes extra-hépatiques ont été décrites. En France, et dans les pays à haut niveau économique où le virus de l’hépatite E de génotype 3 (VHE3) prédomine, la transmission du VHE se fait essentiellement par la consommation de viande peu ou non cuite. De nombreux arguments sont également en faveur d’une transmission environnementale et notamment hydrique du VHE3. Dans l’environnement, le VHE circule sous une forme non enveloppée (nVHE), constituée de la protéine ORF2 de capside, tandis que les particules virales retrouvées dans le sérum des patients ou dans le surnageant de culture cellulaire sont associées à des lipides, bien que le génome du VHE ne code aucune protéine d’enveloppe. Ce type de particules est de ce fait qualifié de virus quasi-enveloppé (eVHE).

Notre travail vise à mieux comprendre les voies de transmission du VHE entre l’Homme et l’environnement (via l’animal, l’environnement extérieur). L’objectif de ce travail est de cultiver des souches natives d’origine humaine, animale ou environnementale sur des cellules hépatocytaires, les cellules PLC/PRF/5 qui présentent une bonne infectivité.

Les souches virales étudiées seront 1) des souches d’origine humaine, fécales (nVHE) ou sériques (eVHE), recueillies chez des patients suivis au CHRU de Nancy (DC-2016-2790), 2) des souches animales isolées de gibiers ou d’élevage, et 3) des souches environnementales prélevées en entrée de station d’épuration et dans des eaux de surface. Les cellules PLC/PRF/5, déjà entretenues au Laboratoire, seront infectées selon les protocoles optimisés disponibles dans la littérature. Après infection, les cellules seront cultivées en laboratoire de sécurité de niveau 3 comme l‘impose la réglementation. Le suivi de l’infection sera réalisé par la détection de l’ARN du VHE, la détection de la protéine ORF2 et par marquage des cellules infectées par immmuno-fluorescence. Les souches virales ainsi isolées seront caractérisées par des tests génotypiques.

L’étude de la capacité réplicative des différents isolats et de leurs caractéristiques moléculaires permettra de mieux comprendre les facteurs virologiques influençant la persistance et la transmission du virus à partir des réservoirs connus ou non encore explorés.

Comme la plupart des virus à ADN et certains virus à ARN, le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) se réplique uniquement dans le noyau et a donc développé tous les éléments nécessaires pour détourner la machinerie cellulaire pour son transport à travers le pore nucléaire. De manière intrigante, il semblerait que la capside virale, qui est un assemblage d’hexamères et de pentamères de CA, et dont on pensait à l’origine qu’elle était désassemblée dans le cytoplasme, joue en fait un rôle clé dans l’import nucléaire et entre dans le noyau avec le génome viral. Dans une publication récente, nous avons identifié un signal de localisation nucléaire (NLS) atypique dans une boucle exposée de CA qui est spécifiquement reconnu par la beta-karyophérine Transportin (également appelée TRN-1/nom de gène TNPO1) (Fernandez et al., Nat Microbiol 2019). La liaison de la TRN-1 aux hexamères de CA permet l’import nucléaire du VIH-1 et déclenche la décapsidation. Notre étude a identifié, à la fois sur CA et TRN-1, des résidus clés pour l’interaction. Par conséquent, en utilisant la modélisation informatique, nous avons passé au crible des chimiothèques enrichies en inhibiteurs d’interaction protéine-protéine pour trouver des molécules qui pourraient se lier à l’interface TRN-1::CA. Nous avons identifié 40 molécules que nous avons testées sur cellules indicatrices d’infection. Cela nous a permis d’identifier un inhibiteur potentiel de l’import nucléaire du VIH-1, appelé H27, ainsi que plusieurs analogues structuraux. L’objectif du projet est de caractériser les mécanismes d’action de H27 et de ses analogues en (1) examinant leur spécificité, (2) évaluant leur effet sur la stabilité et la décapsidation du VIH-1, (3) vérifiant que leur effet est dépendant de TRN-1 et (4) améliorant les molécules pour atteindre une meilleure IC50 et déterminer les relations structure-fonction. La capside du VIH-1 est depuis longtemps considérée comme une cible thérapeutique, et plusieurs inhibiteurs ciblant la protéine CA ont déjà été décrits. Si notre projet aboutit, nous identifierons une nouvelle classe d’inhibiteurs de la capside du VIH, qui bloquent l’interface TRN-1::CA. Nous espérons qu’ils pourront agir comme de puissants inhibiteurs de l’import nucléaire, soit spécifique du VIH-1, soit aussi d’autres virus qui dépendent également de TRN-1 pour leur désassemblage et/ou import nucléaire, tels que le virus de la grippe. Nous espérons également qu’en élucidant le mode d’action de ces molécules nous comprendrons davantage comment TRN-1 coordonne le transport nucléaire et le désassemblage de capsides virales en cellules infectées.

Les cellules myéloïdes, en particulier les cellules dendritiques (cDCs), jouent un rôle clé dans la mise en place des réponses immunitaires contre les virus. Il a été montré que l’infection par le SIV et le VIH-1 induisent des dysfonctions des cDCs, lors de la phase aigüe de l’infection aboutissant à une réponse immunitaire adaptative inefficace. Des études ex-vivo à partir d’échantillons de patients montrent que la modulation de l’interaction entre le récepteur inhibiteur LILRB2 et le CMH-I joue un rôle majeur dans les dysfonctions des cDCs induites par le VIH-1 et corrèle avec la vitesse de progression de la maladie. Les dysfonctions des cDCs induites par l’interaction de LILRB2 avec le CMH-I sont caractérisées par une atténuation de leur capacité de maturation (expression réduite des molécules de co-stimulations) et une inhibition de leur capacité de présentations antigéniques aux lymphocytes T. Il a été proposé que ces mécanismes de dérégulation des cDCs induits par une interaction exacerbée de LILRB2 avec le CMH-I se mettaient en place très tôt lors de l’infection par le VIH-1. A cet égard, des travaux de notre équipe montrent une expression exacerbée de LILRB2 et de ses ligands du CMH-I sur les cDCs du sang et des ganglions périphériques lors des phases précoces de l’infection de macaques cynomolgus par le SIV. En outre, nos données ex-vivo montrent que l’axe LILRB2 / CMH-I est également augmenté sur les cDCs de patients en primo-infection du VIH-1. Sur la base de ces études nous proposons que l’interaction exacerbée entre LILRB2 et le CMH-I induite par le SIV/VIH au cours de la primo-infection engendrerait une dérégulation précoce des réponses immunitaires conduisant à la persistance du virus et à la mise en place des mécanismes physiopathologiques de la maladie. Afin de valider cette hypothèse, nous avons généré des anticorps monoclonaux dirigés contre le récepteur LILRB2. Grace à plusieurs tests de criblages nous avons pu identifier un anticorps monoclonal capable de bloquer l’interaction de LILRB2 avec le CMH-I chez le macaque cynomolgus et l’homme. Des expériences in vitro indiquent également que cet anticorps favorise l’activation des cellules dendritiques dans ces deux espèces.

L’objectif principal de ce projet vise à modifier (humanisation/primatisation) puis à utiliser cet anticorps afin de déterminer l’impact de l’axe LILRB2/CMH-I, in vivo, sur la charge virale et les réponses immunitaires lors de l’infection par le SIV de macaques cynomolgus.

Nous espérons que le traitement avec l’anticorps anti-LILRB2 favorise le développement des réponses immunitaires dirigées contre le SIV plus efficaces et aboutisse ainsi à une amélioration du contrôle de la charge virale, dans l’espoir t’atteindre une rémission.

Les objectifs secondaires du programme, qui seront atteint sur financement complémentaire en dehors de la présente demande, visent à comparer les fonctions de LILRB2 sur des neutrophiles et/ou des monocytes de patients à différents stades de l’infection par le VIH-1 : (primo-infection ; infectés sous traitement cART ; HIV contrôleurs) et moduler leur fonction en présence de l’anticorps.

Au final, les résultats de ce programme pourraient valider l’axe LILRB2 / CMH-I comme nouvelle cible pour le développement de stratégies d’immuno-intervention chez l’homme visant à améliorer les réponses immunitaires contre le VIH-1, sur la base d’une connaissance approfondie des mécanismes de dysfonction observés chez l’homme d’une part et sur des observations précliniques d’autre part. Ces données apporteront également une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires qui induisent la dérégulation des réponses immunitaires lors de l’infection par le VIH-1/SIV.

Avec l’apparition de nouvelles classes d’antirétroviraux (ARV) l’espérance de vie des personnes vivant avec le VIH a considérablement progressé, et rejoint celle de la population générale. De plus, les causes de mortalité évoluent, puisque les cancers en constituent désormais la cause majoritaire. Une classe de traitements anticancéreux, les immunothérapies, en bloquant les récepteurs CTLA4 ou PD1 impliqués dans le rétrocontrôle négatif de la réponse immunitaire auraient le potentiel double avantage de pouvoir lutter contre les cellules cancéreuses, mais également contre le VIH présent à l’état de latence dans les lymphocytes T puisque l’activation lymphocytaire est associée à une réactivation virale. Ainsi en associant un agent réverseur de latence et un ARV, il serait possible de diminuer le nombre total de cellules contenant le génome viral (réservoir viral). C’est la théorie du « shock and kill », qui constitue l’une des principales stratégies d’élimination du virus.

L’objectif de ma thèse est d’étudier l’évolution qualitative du réservoir viral VIH-1 chez des patients traités par immunothérapie. Il s’appuie pour cela sur la cohorte ANRS CO24 OncoVIHAC, cohorte multicentrique de patients vivant avec le VIH traités par immunothérapie pour un cancer. Cette étude fait suite à des études qualitatives qui ont identifié pour une minorité de patients une diminution au moins transitoire de l’ADN proviral concomitamment à une majoration de la charge virale plasmatique (résultat en accord avec la théorie du « shock and kill »).

Ces résultats soulèvent de nouvelles questions, en lien avec la structure du réservoir viral. En effet, seuls 5% des provirus sont potentiellement réplicatifs, les autres possédant des délétions ou mutations les rendant non fonctionnels. Se pose alors la question de la part des virus réplicatifs dans la diminution parfois observée au cours de ces traitements puisqu’un réservoir bas est un facteur associé à l’absence de rebond de la charge virale à l’arrêt des antirétroviraux. Un effet sur la part « fonctionnelle » du réservoir ouvrirait donc la voie à des essais d’immunothérapies chez des patients VIH positifs sans cancer, à visée curatrice.

Du fait de la complexité du réservoir VIH, plusieurs techniques complémentaires ont été développées. Nous envisageons d’utiliser deux principales méthodes. La première, l’Intact Proviral DNA Assay, permet une estimation des différentes populations virales entre virus entier potentiellement réplicatif, virus possédant de larges délétions et virus muté par APOBEC (enzyme de restriction). Elle consiste en une digital droplet PCR, technique où l’échantillon à amplifier est fractionné en environ 20 000 gouttelettes dans chacune desquelles une réaction de qPCR s’effectue indépendamment. Puis chaque gouttelette est analysée séparément afin de déterminer si elle présente une ou plusieurs parties du virus, permettant ainsi une première estimation des proportions de virus réplicatif / non réplicatif. Cette technique a l’avantage d’avoir été validée après sa publication princeps sur plusieurs cohortes et, nécessite peu de cellules. Cependant, elle porte sur seulement deux régions du génome viral et peut surestimer la proportion de virus réplicatifs. Pour pallier ce problème nous envisageons également de réaliser une technique de dilution limite – séquençage de génome VIH. Elle consiste à diluer le prélèvement pour qu’un seul génome viral soit statistiquement présent par puits. Puis chaque génome viral est indépendamment amplifié et séquencé. La dilution est nécessaire car elle permet d’avoir une vision non biaisée de l’ensemble de la population virale : les provirus ayant de larges délétions, plus courts, seraient surreprésentés car plus rapidement amplifiables. L’inconvénient de cette technique est cette fois sa lourdeur, puisqu’elle nécessite de multiples PCR avant séquençage. Elle permet cependant une analyse plus fine des populations virales, et notamment leur évolution vis-à-vis des complexes majeurs d’histocompatibilités par des approches bio informatiques. Enfin, il est possible de coupler cette technique avec une recherche des sites d’insertion du génome viral.

Introduction : L’adolescence est une période cruciale durant laquelle de nombreux changements d’ordre physique, mental et social surviennent avec plus de comportements à risque que pendant les autres périodes de la vie. L’accroissement de l’accès au traitement antirétroviral a entrainé une réduction de la mortalité liée au VIH dans toutes les classes d’âge, à l’exception de celle des adolescents qui constituent une population particulièrement vulnérable. Cette sur-mortalité élevée chez les adolescents vivant avec le VIH (AVVIH) est essentiellement liée à des difficultés d’observance au traitement, lesquelles difficultés sont exacerbées par une annonce explicite de leur statut VIH faite souvent trop tardivement et dans de mauvaises conditions. Depuis 2016, l’accès à la mesure de la charge virale, indicateur clé de la surveillance thérapeutique s’améliore en Afrique de l’Ouest. Nous faisons l’hypothèse que l’amélioration des conditions d’annonce du statut VIH aux AVVIH avant l’âge de 12 ans améliorerait leur santé mentale, et leur observance, et que l’identification précoce de ceux ayant avec une charge virale détectable en cours du suivi permettrait de renforcer leur observance au traitement : ces interventions ciblées permettraient d’améliorer  la réponse virologique et de prévenir l’apparition de résistances aux antirétroviraux pour préserver leur capital thérapeutique. Il s’agit d’une priorité de santé publique, en particulier dans les pays à ressources limitées où les nouveaux traitements antirétroviraux sont rares.

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’acceptabilité sociale et familiale et l’efficacité d’un paquet d’interventions visant 1/ à améliorer la qualité et la fréquence de l’annonce complète du statut d’infection par le VIH (avant 12 ans), et 2/ à améliorer l’observance modulée selon la réponse virologique pour améliorer le taux de suppression virologique (charge virale indétectable) chez les AVVIH traités par trithérapie antirétrovirale dans des cohortes pédiatriques en Afrique de l’Ouest.

Méthodes : Nous conduirons un essai randomisé séquentiel en grappe « stepped-wedge » dans six sites de prise en charge différents en Afrique de l’Ouest niché dans la cohorte pédiatrique «International Epidemiology Databases to Evaluate AIDS (IeDEA)» West-Africa. La durée de cette étude sera de 36 mois. Tous les AVVIH âgés de 10 à 17 ans, entrés dans les soins avant l’âge de 10 ans (infectés par transmission mère-enfant) seront éligibles pour cette étude. A l’inclusion, le statut vis-à-vis de l’annonce du statut VIH sera évalué pour chaque adolescent et une charge virale sera réalisée. Notre intervention combinera un soutien à l’annonce complète du statut VIH avant l’âge de 12 ans pour ceux n’ayant pas encore eu l’annonce. Les adolescents avec une charge détectable bénéficieront d’un programme de renforcement d’observance personnalisé avec des agents communautaires et des pairs-éducateurs formés, et un suivi  virologique durant 6 mois. L’analyse de cette stratégie sera multicritère : acceptabilité sociale et familiale des interventions, efficacité globale sera évaluée : 1/ par la différence de proportion d’adolescents en échec virologique (charge virale supérieure à 1000 copies/mL) avant, et 12 mois, puis 18 mois après la mise en place du paquet l’interventions dans les sites, et 2/ par la différence de proportions d’adolescents de moins de 12 ans informés de leur statut d’infection à VIH avant et 18 mois après la mise œuvre de l’intervention ; analyse coût-efficacité.

Résultats attendus : Cette étude contribuera à évaluer une stratégie de soutien familial et professionnel à l’annonce complète et de renforcement de l’observance thérapeutique des AVVIH basée sur la charge virale, et adaptée au contexte de l’Afrique de l’Ouest qui soit efficace et pérenne. Si les résultats sont probants, il s’agira de disséminer ensuite cette stratégie aux autres sites de prise en charge des adolescents en Afrique francophone (réseau VIVRADO). Le projet permettra un plaidoyer pour obtenir des traitements de 3ème ligne, et constituera une plate-forme structurante pour le renforcement des capacités, y compris la formation de masters et doctorat.

L’objectif d’éradication du SIDA pédiatrique par l’utilisation des antirétroviraux durant la grossesse justifie une évaluation fine de la tolérance des traitements. Plus d’un million d’enfants sont annuellement exposés in utero aux antirétroviraux dans le monde. Une vingtaine de molécules antirétrovirales sont disponibles, dont les plus récentes commencent à être prescrites durant la grossesse, sans donnée solide de tolérance. La préoccupation sur la tolérance fœtale de ces traitements ne doit pas freiner mais accompagner et guider ce dynamisme thérapeutique. La base médico-administrative du Système National des Données de Santé que l’Assurance Maladie met désormais à la disposition des chercheurs intègre des données médicales de près de 7 millions d’enfants nés ces dix dernières années en France, dont plus de 10 000 nés d’une mère vivant avec le VIH et ayant reçu des antirétroviraux durant la grossesse. De façon complémentaire aux cohortes, essais et registres de pharmacovigilance, l’objectif du projet est d’apporter des informations sur la santé des enfants exposés à large échelle et à plus long terme que celui du suivi usuel des enfants nés de mère vivant avec le VIH. Dans un premier temps, le travail portera sur la description de la symptomatologie neurologique des enfants, sans préjuger de son étiologie. D’autres pathologies – infectieuses, dysimmunitaire, néoplasiques… – pourront être aussi analysées. Le rôle éventuel du traitement sera étudié par molécules ou par associations de molécules, en intégrant les biais possibles liés à la santé maternelle, sa situation sociale et le déroulement de la grossesse.  Des comparaisons au sein même du groupe d’enfants nés de mère vivant avec le VIH permettront ensuite de réduire les biais inhérents aux conséquences indirectes de l’infection maternelle. Ce travail sera mené en étroite collaboration avec la cohorte ANRS EPF 2, dont le travail sur le même thème pourra s’avérer synergique.