Projets et candidats lauréats

La coévolution entre les lentivirus et les primates au cours de millions d’années a entrainé une « course aux armements » entre les deux entités. En particulier, les protéines aux interfaces virus-hôtes et essentielles pour la survie de chaque protagoniste ont évolué rapidement et portent les traces de ce conflit génétique, comme des accumulations de mutations non-synonymes ou des variations de nombre de copies de gènes. Ces signatures sont typiques des gènes de primates codant pour les facteurs de restriction et les cofacteurs essentiels du VIH et autres lentivirus. Notre objectif général est ainsi de caractériser de nouvelles protéines cellulaires interagissant avec le VIH et engagées dans une course aux armements évolutive avec les lentivirus de primates (dénotant donc de leur importance in vivo). De façon originale, nous utilisons des analyses évolutives et des tests fonctionnels afin d’identifier de tels candidats et caractériser de nouvelles interfaces virus-hôte.

Grâce à un financement précédent de l’ANRS, nous avons notamment développé un pipeline de bioinformatique automatisé et extrêmement flexible, appelé DGINN, destiné à la Détection des INNovations Génétiques. Nous avons validé de manière robuste notre méthode sur des gènes connus et divers, y compris sur des facteurs de restriction anti-lentiviraux portant des signatures de « course à l’armement moléculaire » (un manuscrit est en préparation et la méthode sera librement disponible). Dans des travaux préliminaires supplémentaires, nous avons utilisé DGINN pour cribler 76 gènes candidats, issus de la signalisation interferon et uprégulés dans des macrophages résistants à l’infection par le VIH (à partir d’une expérience transcriptomique). À partir de ce « double criblage » transcriptomique et évolutif, nous avons identifié treize gènes d’intérêt, dont SAMD9. SAMD9 et son paralogue SAMD9L sont des gènes stimulés par l’interféron, suppresseurs de tumeur, à l’origine d’immunodéficiences rares (MIRAGE), et décrits comme des facteurs de restriction des poxvirus. Cependant, leur rôle cellulaire est peu connu et leur implication dans la réplication lentivirale n’a encore jamais été décrite. Ici, nous avons trouvé (i) que SAMD9 et SAMD9L portent des signatures de conflit génétique notables chez les primates (indépendamment des poxvirus), (ii) que SAMD9 est un cofacteur des lentivirus/VIH dans les phases tardives de réplication, et ce de manière spécifique de lignées lentivirales, alors que (iii) SAMD9L inhibe l’infectivité lentivirale.

Le projet est donc de, tout d’abord, caractériser le rôle fonctionnel de SAMD9 et SAMD9L dans la réplication lentivirale et de déterminer comment les lentivirus ont influencé l’évolution de ces gènes chez les primates (Objectif 1). Nous combinerons tests bioinformatiques/phylogénétiques et expérimentations pour avoir un regard bidisciplinaire sur ces protéines potentiellement impliquées dans le cycle lentiviral. Ensuite, nous identifierons d’autres gènes de la voie interféron qui influencent la réplication lentivirale et qui sont évolutivement pertinents (Objectif 2) : d’abord, parmi les douze candidats restants de notre « double crible » transcriptomique et évolutif, puis en criblant l’Interferome à l’aide de notre nouvelle méthode DGINN.

Ce projet est très novateur dans son approche, et sa faisabilité est soutenue par des méthodes et des résultats préliminaires clés. Il est également très significatif, car il permettra l’identification de nouvelles interfaces VIH-cellules essentielles et révèlera notamment comment le VIH usurpe même les gènes de la voie interféron à son propre avantage.

Ce projet vise à explorer pour la première fois le rôle de sous-populations de cellules T CD8+ non décrites auparavant dans l’immunité contre la tuberculose (TB) chez la souris et les modèles de primates non humains. Il s’agit donc d’un projet de recherche fondamentale, avec un potentiel préclinique, qui s’inscrit parfaitement dans le cadre du CSS11.

Les maladies pulmonaires infectieuses sont un défi majeur de santé publique. A l’exception de 2020/2021 et de la crise de la COVID-19, la tuberculose reste la maladie infectieuse la plus meurtrière au monde et le seul vaccin disponible, le BCG, n’est pas suffisamment efficace. L’un des principaux défis, tant pour l’infection naturelle (c’est-à-dire pour diagnostiquer, prévoir et suivre l’évolution de la maladie) que pour la prophylaxie (c’est-à-dire pour générer une réponse vaccinale appropriée), est de comprendre les caractéristiques d’une réponse immunitaire protectrice contre la TB.

Notre compréhension de la réponse protectrice contre la TB est dominée par des études démontrant l’action des cellules T CD4+. Sur la base de preuves d’une prédisposition accrue des patients présentant des déficiences immunitaires génétiques (voie IL-12/IFN) ou acquises (SIDA), et étayées par des modèles animaux, la réponse Th1 en particulier semble essentielle dans la protection immunitaire contre la TB. Cependant, ces connaissances ne sont pas suffisantes pour fournir des outils prédictifs, diagnostiques et thérapeutiques permettant de lutter efficacement contre la TB, et il est clair que la mesure de cette réponse ne fournit pas un corrélat de protection permettant de comprendre l’efficacité de l’immunité naturelle ou de soutenir le développement de nouvelles stratégies vaccinales. Il apparaît donc que d’autres paramètres immunologiques doivent être pris en compte.

De nombreuses études chez l’homme et dans des modèles animaux ont établi le rôle clé de des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) CD8+ dans l’immunité anti-TB et cette population apparaît clairement comme l’une des populations non-CD4 les plus intéressantes à étudier dans ce contexte. Les connaissances récentes en immunologie fondamentale ont établi l’existence d’une diversité significative de sous-populations de cellules T CD8+ effectrices et mémoires mais cette information a été peu exploitée dans le contexte de la réponse anti-TB. Or, une étude en cours chez le macaque démontre la nécessité d’une étude approfondie des sous-populations de CTL impliquées, dont seules certaines sont corrélées à la protection. L’objectif principal du projet KILL-TB est d’explorer le rôle des sous-populations CTL dans l’immunité anti-TB chez la souris, et de fournir des outils moléculaires uniques pour le suivi des réponses CTL. Le projet sera divisé en 4 axes :

– la détection qualitative et quantitative des sous-populations de lymphocytes T CD8+ spécifiques au bacille de la tuberculose pendant l’infection chez des souris déficientes et compétentes en SP140

– le positionnement dans les poumons (par rapport à l’architecture pulmonaire et aux cellules voisines) et la dynamique des sous-populations de lymphocytes T CD8+ les plus pertinentes en utilisant des approches d’imagerie intravitale avancées

– l’évaluation des propriétés fonctionnelles des sous-populations de cellules T CD8+ les plus pertinentes à l’aide d’approches in vitro et in vivo

– la détection et le positionnement des sous-populations de cellules T CD8+ les plus pertinentes dans les poumons de primates non humains (PNH) infectés par M. tuberculosis

Le projet, basé sur de nombreuses données préliminaires, implique deux partenaires : l’équipe d’Olivier Neyrolles, IPBS, CNRS, Toulouse (chef de projet : Denis Hudrisier) spécialisée dans l’immunité anti-TB, en particulier dans le modèle murin, et l’équipe de Roger Le Grand, CEA, Fontenay, spécialisée dans les modèles infectieux chez les primates non humains. Le projet bénéficiera de l’expertise combinée de ces groupes et des infrastructures uniques offertes dans ces instituts pour étudier l’immunité anti-TB in vivo, en exploitant les équipements de premier ordre (imagerie, tri cellulaire) de nos animaleries BSL3.

La protéine TRBP est une protéine impliquée dans divers mécanismes biologiques, tels que la réplication du virus HIV, ou en tant que co-facteur de la protéine Dicer, une RNase cytoplasmique de type III impliquée dans l’une des étapes de maturation des miARNs. Au cours de l’infection cellulaire par le virus HIV, TRBP favorise notamment la propagation virale en bloquant le caractère inhibiteur de l’ARN TAR viral sur la traduction des protéines virales, ou encore en interagissant directement avec les protéines PACT ou PKR, deux facteurs favorisant la multiplication du virus. Récemment, nous avons mis en évidence au laboratoire une interaction inédite entre la protéine TRBP d’une part, et la protéine RPAP3 d’autre part, qui appartient au complexe d’assemblage R2TP. Ce complexe multiprotéique joue le rôle de chaperon pour l’assemblage de diverses particules ribonucléoprotéiques, telles que les petites particules nucléolaires ou l’ARN polymérase II. Son implication et son rôle au cours du cycle viral du HIV ou de la maturation des miARNs n’a toutefois jamais été décrite. Notre mise en évidence d’une interaction directe entre la protéine TRBP et la protéine RPAP3 nous permet de proposer ce projet dans lequel nous tenterons de déterminer quels sont les fonctions possibles de la protéine RPAP3 et du complexe R2TP, en connexion avec TRBP, dans la réplication du virus.

     L’intégrase (IN) catalyse l’intégration d’une copie d’ADN complémentaire du génome rétroviral dans l’ADN de la cellule hôte. Cette enzyme est impliquée dans d’autres étapes essentielles du cycle de réplication du VIH-1 et représente une cible thérapeutique importante.

     Ainsi, la liaison directe de l’IN du VIH-1 avec l’ARN viral (ARNv) a été récemment décrite comme étant essentielle au processus de morphogénèse virale. Cette interaction IN-ARNv est nécessaire pour l’incorporation de l’ARNv au sein de la capside après maturation protéolytique du VIH-1 et détermine le devenir du génome rétroviral après infection d’une nouvelle cellule.

     Aucune information moléculaire et structurale n’est actuellement disponible sur cette interaction IN-ARNv. Notre projet vise à caractériser l’assemblage d’IN dans le complexe ribonucléoprotéique viral (vRNP) au cours de la morphogenèse, par une approche de biologie intégrative associant des techniques de biologie structurale, moléculaire et cellulaire. Nous utiliserons des approches biochimiques et biophysiques, afin de mieux caractériser la liaison directe de l’IN à un élément connu de l’ARNv (caractéristiques structurales et/ou de séquence). L’étude structurale du complexe macromoléculaire sera menée par cristallographie aux rayons X et cryo-microscopie électronique à transmission. Les structures obtenues seront utilisées pour concevoir rationnellement une nouvelle classe de composés antirétroviraux, bloquant spécifiquement l’interaction IN-ARNv. Les molécules candidates seront identifiées par une approche in silico d’amarrage moléculaire et leur capacité d’inhibition sera validée par des tests in vitro et in cellulo. De plus, les mutants IN issus des études moléculaires et structurales seront caractérisés par des tests in cellulo d’infection au VIH-1.

     Au final, ce travail de biologie intégrative mené sur l’IN fournira des informations essentielles à la compréhension de son interaction avec l’ARNv. Elle permettra de mieux comprendre les déterminants moléculaires et structuraux guidant la dynamique de réarrangement du vRNP pendant la maturation du VIH-1.

L’étude ANRS-Prévenir a démarré en Mai 2017. Cette étude de cohorte, dont le but était de recruter 3000 individus sous prophylaxie pré-exposition (PrEP) en île de France, sur une période de deux ans, avait pour objectif principal d’obtenir une diminution d’au moins 15% des nouveaux diagnostics d’infection à VIH chez les hommes ayant des relations sexuelles avec les hommes (HSH) en Ile de France trois ans après le démarrage de l’étude (c’est-à-dire en comparant les données de diagnostics d’infection VIH en Ile de France fournis par Santé Publique France entre 2015/2016 et 2019/2020). Dans l’étude ANRS-Prévenir, les participants peuvent prendre la PrEP selon un schéma continu ou à la demande, et peuvent passer d’un schéma à l’autre en cours de suivi. Il s’agit de l’unique étude de grande taille, à l’échelle internationale, avec des données d’efficacité de la PrEP à la demande en vie réelle. C’est d’ailleurs sur les bases des premiers résultats de l’efficacité de la PrEP à la demande en vie réelle dans l’étude ANRS-Prévenir (qui confirment ceux de l’essai ANRS-IPERGAY) que l’OMS a recommandé, en juilet 2019, parmi les schémas possibles de PrEP, le schéma de PrEP à la demande (2+1+1).

Deux ans après le démarrage de l’étude, de nombreuses questions émergent (au-delà de l’évaluation du critère principal de jugement) :

– comment atteindre les plus jeunes (< 25 ans) ?

– au vu de l’augmentation significative de l’incidence des IST bactériennes, quelles interventions pourraient être proposées ?

– quelles stratégies face à l’incidence des hépatites C aigues ?

– au vu de la proportion importante de participants consommant des substances psycho-actives (« chemsex »), quelles interventions proposer afin de réduire ces consommations ?

– quelle sera la rétention dans la PrEP à long terme et quelle sera son efficacité individuelle et sa tolérance à long terme?

– quel sera l’impact de la PrEP sur l’incidence de l’infection à VIH à long terme au-delà d’un éventuel impact initial ?

– qui sont les utilisateurs de la PrEP en Ile-de-France ?

Ainsi, nous allons mettre en place plusieurs études, nichées dans la cohorte ANRS-Prévenir, pour apporter des réponses scientifiques à ces questions

– l’étude ANRS-TRUST, qui a obtenu un finacement de l’ANRS, va évaluer l’intérêt d’une stratégie RDS pour amener des jeunes de moins de 25 ans vers la PrEP.

– l’essai randomisé ANRS-Doxyvac, financé par l’ANRS, va évaluer, deux stratégies thérapeutiques visant à réduire l’incidence des IST chez les utilisateurs de PrEP, avec d’une part l’évaluation de la doxycycline en traitement post-exposition pour réduire l’incidence des IST à Chlamydia trachomatis et à T. pallidum (versus pas de doxycycline), et d’autre part, la vaccination contre le méningocoque B sur la réduction de l’incidence des infections à gonocoque (versus pas de vaccin)

– l’étude NOCO, financée et qui a démarré en Février 2020, va évaluer l’intérêt d’un test de dépistage de l’Hépatite C basé sur la détection d’antigène du VHC en termes de raccourcissement du délai de diagnostic d’hépatite C aigue par rapport à la sérologie standard qui ne détecte que les anticorps anti-VHC

– l’étude RdR/Chemsex va évaluer l’acceptabilité d’un programme innovant de réduction des risques (RdR) chez les utilisateurs de PrEp qui consomment du Chemsex.

– la mise en évidence de facteurs associés à la rétention sous PrEP à moyen – long terme grâce à la prolongation du suivi

Avec le temps, il est de plus en plus clair que la cohorte ANRS-Prévenir doit être considérée comme un observatoire prospectif permettant de conduire des études spécifiques dans le cadre d’une thématique générale sur la santé sexuelle des populations à risque et singulièrement chez les HSH. Dans l’état actuel des projets validés ou en réflexion avancée, la prolongation nécessaire est d’au moins 5 ans. L’ANRS a accordé une prolongation d’un an, c’est-à-dire jusqu’en mai 2021. La présente demande a pour objet d’obtenir une prolongation jusqu’en mai 2025, afin de mener à bien toutes les études qui permettront de répondre aux questions de santé sexuelle qui émergent suite à la mise à disposition de la PrEP.

Les interférons (IFN) de type I sont sécrétés par les individus infectés par le VIH-1 pendant la phase aiguë et la phase chronique de l’infection. Ils permettent de limiter la propagation virale par l’induction d’expression de gènes antiviraux et stimulent la réponse immunitaire, en particulier dans la phase précoce de l’infection. Les IFN sont impliqués dans la suractivation chronique du système immunitaire résultant en une réponse inflammatoire persistante lors de la phase chronique de l’infection au VIH-1 ; ils participent aussi à l’établissement des réservoirs cellulaires du VIH-1. Les cellules dendritiques (CD) sont à l’interface entre l’immunité innée et adaptative. Elles expriment les récepteurs permettant l’entrée du VIH-1 mais sont relativement résistantes à l’infection par le VIH-1 de par l’expression de facteurs de restriction tels que SAMHD1. Suite à la dégradation de SAMHD1 par la protéine Vpx (codée par le VIH-2 ; ou apportée expérimentalement pour étudier les mécanismes de détection du VIH-1 par les CD), les CD humaines s’infectent efficacement et peuvent détecter le VIH-1 par la protéine cGAS qui entraine la production d’IFN, la maturation des CD et la production de cytokines inflammatoires. Les CD peuvent alors déclencher la réponse adaptative médiée par les lymphocytes T dirigés contre le VIH-1. Nous avons montré que la protéine Tétraspanine 7 (TSPAN7), en impactant les dynamiques du cytosquelette d’actine dans les CD, est impliquée dans le transfert de virions du VIH-1 des CD aux des lymphocytes T CD4+.

Nos données préliminaires indiquent que TSPAN7 exerce un rôle de régulation de la production d’IFN de type I et de type III par les DC et de la maturation de ces cellules (modèle de CD dérivées de monocytes primaires). Nous aimerions tester si les CD circulantes conventionnelles de donneurs sains dépendent aussi de TSPAN7 pour la sécrétion d’IFN induite par le VIH-1. Nous proposons d’étudier l’ampleur de la fonction de TSPAN7 dans la réponse des CD à l’infection par le VIH-1. En particulier, nous étudierons l’impact de TSPAN7 sur la capacité des CD infectées à stimuler des lymphocytes T CD8+ spécifiques du VIH-1 et sur le comportement migratoire des CD. Nous examinerions les mécanismes moléculaires en jeu. Pour ce faire, nous testerons si TSPAN7 a un impact direct sur la détection du VIH-1 par les CD (axe cGAS/STING) et/ou si son rôle de régulateur de la nucléation de l’actine est impliqué. Pour ce projet, nous utiliserons des systèmes lentiviraux pour diminuer (shARN) ou augmenter (surexpression) l’expression de TSPAN7 (méthodes utilisées en routine dans notre laboratoire). Quant aux expériences permettant de préciser les mécanismes moléculaires en jeu, nous étudierons les CD de patients portant des mutations induisant une dérégulation de la nucléation de l’actine ou un suractivation de la protéine STING (protéine appartenant à la voie moléculaire permettant à cGAS d’induire la production d’IFN ; collaboration avec l’équipe de Frédéric Rieux-Laucat).

Une meilleure compréhension des interconnexions entre TSPAN7, la détection du VIH-1 par les CD, la sécrétion d’IFN et de cytokines pro-inflammatoires et la maturation des CD pourrait aider à développer de nouvelles stratégies pour limiter les symptômes des patients, la pathogénicité du VIH-1 et l’établissement de réservoirs cellulaires. Étant des actrices clés des réponses immunitaires innées et adaptatives, les CD sont reconnues comme de bonnes candidates pour de futures immunothérapies cellulaires. En tant que telles, une meilleure compréhension des voies moléculaires facilitant leur maturation et leur comportement inflammatoire pourrait aider à l’amélioration de ce type de thérapies pour aider à la lutte contre le VIH-1 mais aussi contre d’autres virus chroniques et certains cancers.

Les usagers de drogues (UD) constituent une population particulièrement à risque vis-à-vis de la transmission du VIH et des hépatites virales (VHC, VHB) Comme le VIH, le VHC se transmet essentiellement par le partage de seringues chez les UD. Néanmoins, le VHC se transmet plus facilement que le VIH, car il est plus résistant à la dessication, la prévalence du VHC est plus élevée chez les UD et il se transmet également par le biais du partage du petit matériel permettant l’injection tel que la cuiller/récipient, l’eau ou le filtre/coton. Au sein de la population des UD, la prévalence de l’hépatite C est encore aujourd’hui très élevée dans la majorité des pays pour lesquels des données de surveillance sont disponibles. L’hépatite C constitue donc un problème de santé majeur chez les UD et certaines populations comme les UD migrants sont particulièrement exposés. En France, les données de prévalence du VIH et du VHC chez les UD ont longtemps reposé sur des données déclaratives et porté sur des échantillons non aléatoires. L’enquête ANRS-Coquelicot constitue la seule enquête française réalisée à partir d’un échantillon aléatoire d’UD à l’aide d’un plan de sondage et du recueil de prélèvements biologiques, au niveau national. La mise en œuvre de cette méthodologie a permis d’améliorer les estimations de la séroprévalence du VIH et du VHC dans la population des UD pris en charge dans les dispositifs spécialisés.

 Les objectifs de l’étude sont les suivants :

• Estimer la séroprévalence du VIH, VHC et VHB chez les UD et l’incidence du VIH et du VHC.
• Capter une partie des UD habituellement non inclus dans les études en raison de leur non maitrise de la langue française, afin de pouvoir décrire les pratiques, les profils et l’état de santé des UD nés à l’étranger.
• Construire la cascade de prise en charge du VIH et du VHC pour la population des UD, à partir des données de dépistage, prise en charge, accès au traitement, guérison (pour le VHC) et charge virale indétectable (pour le VIH)
• Mieux connaître la perception, l’accès et l’observance vis-à-vis des nouveaux traitements de l’hépatite C chez les UD.
• Mieux connaître l’accès aux mesures de réduction des risques, identifier les éventuelles difficultés d’accès et les nouveaux besoins.
• Mettre en œuvre une approche biographique, afin d’identifier les moments les plus à risque pour l’entrée dans la consommation/dépendance et l’exposition aux risques VIH/VHC/VHB.
• Identifier les troubles de santé mentale auxquels est exposée la population des UD dans le but d’améliorer la connaissance des comorbidités psychiatriques, leur implication dans l’exposition au risque de transmission du VIH, VHC et VHB.  

Méthodologie : L’enquête ANRS-Coquelicot est une enquête épidémiologique transversale multicentrique et multisites, réalisée chez des UD ayant sniffé ou injecté au moins une fois dans leur vie. Une stratégie d’échantillonnage sera mise en œuvre afin d’accéder à une population d’UD représentative de la diversité des UD. Pour calculer un poids de sondage correct, la méthode généralisée du partage des poids (MGPP) sera utilisée. Un questionnaire socio-comportemental sera administré par un enquêteur et il sera proposé aux UD de réaliser un auto-prélèvement de sang au doigt sur papier buvard. Pour l’édition 2019, les UD migrants seront inclus dans l’enquête.

Retombées attendues : actualisation des connaissances en matière de comportements à risques, affinement des estimations de prévalence du VIH, VHC et VHB et d’incidence du VIH et du VHC chez les UD, accès aux traitements permettant d’ajuster les actions de prévention et de disposer d’indicateurs pour évaluer leur impact.

L’échec du traitement de l’hépatite chronique C par les antiviraux à action directe (AADs) est un évènement rare à l’ère de l’utilisation d’AADs de dernière génération. Cependant, les données les plus récentes portant sur la diversité génétique des variants du VHC circulant en Afrique de l’Ouest, en l’Afrique Centrale et dans certaines régions d’Asie du Sud-Est indiquent qu’un grand nombre de souches virales de sous-types « inhabituels » du VHC (tels que les sous-types GT-1l, GT-4r et GT-3b), sont caractérisés par la présence de polymorphismes naturels sur leur génome qui confère un haut niveau de résistance primaire à différents AADs. Cette variabilité génétique virale pourrait compromettre la réponse virologique à différentes combinaisons d’AADs menaçant les stratégies d’élimination du VHC dans les pays du Sud et au niveau mondial. A ce jour, les études de résistance primaire sur les gènes cibles des antiviraux NS3, NS5A et NS5B des sous-types de VHC circulant dans ces régions sont très rares et parcellaires.

Dans ce travail, nous proposons de caractériser en profondeur les polymorphismes naturels de résistance de souches virales du VHC circulant dans différentes régions d’Afrique et d’Asie du Sud-Est et d’en déterminer l’impact sur les niveaux de sensibilité aux AADs, à l’aide d’approches originales innovantes de séquençage des génomes viraux par métagénomique et d’analyse bio-informatique des données de séquence combinées à une caractérisation phénotypique permettant la mesure du niveau de résistance primaire des souches circulantes.

Cette étude est essentielle pour optimiser la prise en charge thérapeutique de première ligne de l’hépatite C dans la perspective d’une utilisation généralisée des AADs dans ces régions, ce d’autant que des résultats préliminaires indiquent que certaines combinaisons thérapeutiques seront suboptimales.

Ce programme de recherche s’inscrit dans la continuité des travaux menés depuis plusieurs années par l’équipe de recherche A concernant l’étude des quasi espèces virales et des mécanismes de résistance des traitements de l’hépatite C par AADs. L’expertise et l’ensemble des outils et systèmes expérimentaux permettant la réalisation pratique du projet sont disponibles et maitrises.

La réalisation de ce programme s’étalera sur deux années. L’échéancier prévu est le suivant:

Mois 1-12: constitution de la biothèque, caractérisation génotypique par technique Sanger, suivies par une analyse approfondie des variants « inhabituels » par métagénomique

Mois 12-24: réalisation des tests phénotypiques et analyse statistiques