Projets et candidats lauréats

Le virus associé au sarcome de Kaposi (KSHV) est un herpèsvirus humain oncogène étroitement lié au virus de l’immunodéficience humaine (HIV). KSHV est l’agent étiologique du sarcome de Kaposi et du lymphome primitif des séreuses, deux tumeurs particulièrement agressives chez les sujets co-infectés par HIV. KSHV persiste pendant toute la vie de la personne infectée dans le noyau de la cellule hôte sous la forme d’un minichromosome. Dès son entrée dans le noyau de la cellule hôte, le génome KSHV est chromatinisé et les histones associées sont modifiées. Cette restriction/régulation est commune à l’ensemble des génomes viraux ADN entrant dans le noyau cellulaire et implique des mécanismes épigénétiques inhérents à la cellule. Ces mécanismes de restriction épigénétique sont très peu décrits, il est cependant probable qu’ils impliquent un contrôle multi-niveaux du génome viral, permettant le maintien des marques épigénétiques et de la structure chromatinienne à long terme. L’objectif du projet est d’identifier les protéines cellulaires impliquées dans les niveaux supérieurs de régulation épigénétique du génome viral, à savoir la répression épigénétique par les complexes structurant la chromatine, et de mettre en évidence leur rôle dans la répression du génome viral. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes permettant le contrôle du génome viral par la cellule hôte et les moyens mis en œuvre par le virus pour y échapper.

Les poxvirus sont des virus à ADN double brin qui infectent une grande variété d'animaux, y compris l'homme. Si des solutions vaccinales sont disponibles, il n'existe à ce jour pratiquement aucune molécule antivirale spécifique aux poxvirus. Nous nous intéressons particulièrement à la variole du singe ou «Monkeypox» (Mpox) qui est une maladie infectieuse causée par un orthopoxvirus, caractérisée notamment par de sévères éruptions cutanées. Début mai 2022, des cas de Mpox non directement liés à des voyages en Afrique Centrale ou de l'Ouest, où le virus est présent, ont été rapportés en Europe et dans le monde. Depuis, la maladie, qui est considérée une infection sexuellement transmissible, fait l'objet d'une surveillance renforcée en France et en Europe.

Nous avons précédemment montré que les nitrocorroles (des molécules cycliques) pouvaient être utilisées comme un puissant agent anti-hCMV sans toxicité aiguë chez la souris. Nous avons généré des dérivés nitrés et fluorés originaux et nous avons découvert que ces composés ont une bonne efficacité sur les poxvirus avec, qui plus est, une activité antivirale à large spectre.

Nous souhaitons maintenant nous concentrer sur une nouvelle approche, basée sur la nanomédecine, pour l'administration de corroles afin d'augmenter leur efficacité, mais toujours en toute sécurité. Pour atteindre cet objectif, nous proposons d'utiliser le virus de la mosaïque du tabac (TMV) comme nanovecteur. Ce virus végétal n'est pas pathogène pour l'homme et il a déjà été utilisé avec succès comme vecteur d'administration de médicaments. Pour ce faire, nous envisageons d'ajouter des corroles par encapsulation mais aussi par des liaisons chimiques à l'intérieur ou à l'extérieur de la capside du TMV. L'efficacité antivirale des nanoparticules TMV modifiées sera évaluée par la société NeoVirTech à Toulouse (https://neovirtech.com) dans le cadre d'une prestation

     L’intégrase (IN) catalyse l’intégration d’une copie d’ADN complémentaire du génome rétroviral dans l’ADN de la cellule hôte. Cette enzyme est impliquée dans d’autres étapes essentielles du cycle de réplication du VIH-1 et représente une cible thérapeutique importante.

     Ainsi, la liaison directe de l’IN du VIH-1 avec l’ARN viral (ARNv) a été récemment décrite comme étant essentielle au processus de morphogénèse virale. Cette interaction IN-ARNv est nécessaire pour l’incorporation de l’ARNv au sein de la capside après maturation protéolytique du VIH-1 et détermine le devenir du génome rétroviral après infection d’une nouvelle cellule.

     Aucune information moléculaire et structurale n’est actuellement disponible sur cette interaction IN-ARNv. Notre projet vise à caractériser l’assemblage d’IN dans le complexe ribonucléoprotéique viral (vRNP) au cours de la morphogenèse, par une approche de biologie intégrative associant des techniques de biologie structurale, moléculaire et cellulaire. Nous utiliserons des approches biochimiques et biophysiques, afin de mieux caractériser la liaison directe de l’IN à un élément connu de l’ARNv (caractéristiques structurales et/ou de séquence). L’étude structurale du complexe macromoléculaire sera menée par cristallographie aux rayons X et cryo-microscopie électronique à transmission. Les structures obtenues seront utilisées pour concevoir rationnellement une nouvelle classe de composés antirétroviraux, bloquant spécifiquement l’interaction IN-ARNv. Les molécules candidates seront identifiées par une approche in silico d’amarrage moléculaire et leur capacité d’inhibition sera validée par des tests in vitro et in cellulo. De plus, les mutants IN issus des études moléculaires et structurales seront caractérisés par des tests in cellulo d’infection au VIH-1.

     Au final, ce travail de biologie intégrative mené sur l’IN fournira des informations essentielles à la compréhension de son interaction avec l’ARNv. Elle permettra de mieux comprendre les déterminants moléculaires et structuraux guidant la dynamique de réarrangement du vRNP pendant la maturation du VIH-1.

Chez les eucaryotes, la traduction est un processus dynamique et rapide qui est régulé à la fois par la structure intrinsèque de l’ARN et de nombreuses protéines cellulaires qui se fixent sur l’ARNm. Contrairement au mécanisme de traduction procaryote, la sous-unité 40 S ne peut pas se lier directement sur l’ARN et l’attachement a lieu par le biais d’interactions ARN-protéines qui se mettent en place grâce à un ensemble de 12 facteurs d’initation (eIFs pour eukaryotic Initiation Factors). La sous-unité 40 S du ribosome associée à ces facteurs d’initiation constitue le coeur d’un vaste complexe macromoléculaire auquel se joint de nombreuses autres protéines de liaison à l’ARN pour former le complexe de préinitiation. Celui-ci a une composition variable en fonction de l’ARN considéré ce qui module sa fonction et lui permet de s’adapter aux contraintes structurelles que l’on trouve chez certains transcrits.

L’initiation de la traduction chez les eucaryotes, qu’elle soit opérée à partir de l’extrémité 5’ (coiffe-dépendante) ou en position interne (IRES-dépendante) consiste à attirer et lier le complexe de préinitiation sur l’ARNm afin qu’il puisse parcourir la région 5′ non traduite (5’UTR) pour accéder au codon AUG. Lorsqu’il arrive sur le site initiateur, ce complexe de préinitiation est dissocié pour permettre la liaison de la sous-unité 60 S du ribosome et constituer le ribosome 80S; celui-ci va ensuite parcourir la phase codante pour produire la protéine d’intérêt. L’étape d’initiation est l’étape limitante et elle détermine le taux de production protéique global de l’ARN concerné. A ce titre, l’initiation de la traduction est un processus extrêmement régulé et contrôlé à la fois par la structure de l’ARNm et la composition du complexe de préinitiation.

L’ARN génomique du VIH-1 est traduit dans le cytoplasme de la cellule infectée par la machinerie cellulaire de l’hôte et code pour les polyprotéines Gag et Gag/Pol. Il commence par une coiffe (guanosine méthylée-m7GTP) qui est suivie par une longue région 5′ non traduite (5’UTR) de 336 nucléotides qui contient de nombreux motifs complexes d’ARN dont la tige boucle TAR, le PBS, les signaux de dimérisation (DIS) et d’encapsidation (Psi). L’initiation de la traduction de l’ARNg est particulière puisqu’elle peut s’opérer à la fois à partir du 5′ de l’ARN (mécanisme coiffe-dépendant) ou sur 2 séquences IRES distinctes qui se trouvent dans la région 5’UTR (IRES1) et au début de la phase codante pour Gag (IRES2). Il est donc possible de recruter 3 complexes de préinitiation sur l’ARNg mais on ne sait pas si ces complexes peuvent se former simultanément ou si leur assemblage est mutuellement exclusif. On ne connait pas leur composition protéique ni leur dynamique d’assemblage au cours de la progression du cycle viral ou de l’état physiologique de la cellule hôte. En revanche, on sait qu’ils ont une composition variable en fonction de leur site de recrutement sur l’ARN.

Les objectifs de ce projet sont de cartographier et identifier la composition de ces complexes d’initiation sur leurs sites d’assemblage, c’est à dire à l’extrémité 5′ de l’ARN (coiffe/TAR) ou au niveau des 2 IRES afin de mieux comprendre comment s’articule la traduction du VIH-1. Pour ce faire, nous utiliserons la technique récente de biotinylation de proximité en combinaison avec un système d’édition de type CRISPR/Cas13 pour cibler des régions précises de l’ARNg. Cela permettra de cartographier les interactions protéines-protéines et déterminer le réseau complexe de ces interactants dans un rayon d’environ 10 nm autour des sites d’initiation.