Projets et candidats lauréats

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une tumeur agressive et représente à l’échelle mondiale la troisième cause de mortalité par cancer. Plus de 50 % des cas de CHC dans le monde sont liés à l’infection chronique par le virus de l’hépatite B (HBV), cependant les mécanismes mis en jeu restent mal compris et font intervenir des facteurs viraux et cellulaires. L’intégration des séquences virales, retrouvée très fréquemment dans les CHC, participerait à l’oncogenèse par mutagenèse insertionnelle et en induisant de l’instabilité génomique. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans développement tumoral ne sont pas élucidés.

Des études ont montré que des altérations de la structure 3D du génome étaient liées au développement de maladies dont le cancer ce qui est en accord avec le fait que l‘organisation tri-dimensionnelle du génome joue un rôle important dans l’expression des gènes.

Notre projet est d’étudier les conséquences de l’intégration d’HBV sur l’organisation 3D du génome à partir de cellules dérivées de CHC contenant des séquences intégrées d’HBV. Dans ce but nous réaliserons une analyse comparative de l’organisation 3D du génome de lignées cellulaires dérivées de CHC contenant le génome HBV, de CHC non reliés à HBV et d’hépatocytes humains primaires en utilisant une approche Hi-C dérivée de la capture de la conformation chromosomique. Nous étudierons par des approches de capture de l’ADN viral (CHi-C), si les séquences virales intégrées altèrent la structure locale du génome et contactent des régions spécifiques de la chromatine. Nous rechercherons si les altérations 3D du génome interfèrent avec l’expression de gènes cellulaires par RNA-seq et ChIP-seq afin de caractériser l’épigénome de l’hôte et de rechercher si modifications épigénétiques sont associées aux contacts HBV / chromatine hôte. Nous identifierons alors des gènes cibles et étudierons leur expression. Enfin, par insertion ou délétion de séquences virales par CRISPR/Cas9, nous étudierons le rôle des séquences intégrées sur la modulation de l’organisation 3D et sur la transformation cellulaire via l’utilisation de modèles ex vivo et in vivo.

En comprenant comment les intégrations d’HBV influencent l’organisation 3D du génome et en conséquence l’expression des gènes et la tumorigenèse, nos données devraient permettre de découvrir de nouveaux mécanismes de la cancérogenèse induite par HBV.

Le virus de l’hépatite B (VHB) est membre de la famille des Hepadnaviridae, qui infecte naturellement les mammifères (Orthohepadnavirus), les oiseaux (Avihepadnavirus), les poissons (Metahepadnavirus) et les amphibiens (Herpetohepadnavirus). Le VHB utilise le domaine PreS1 de sa glycoprotéine L pour interagir avec la protéine cellulaire NTCP et entrer dans les hépatocytes. Cependant, on ignore si cette voie d’entrée est conservée chez les Hepadnaviridae. La caractérisation des mécanismes d’entrée cellulaire des virus est fondamentale pour comprendre les déterminants de la susceptibilité et la spécificité de l’espèce. De plus, l’entrée étant une étape clé du cycle de la réplication virale, elle constitue une cible potentielle pour des stratégies/thérapies antivirales. Notre objectif est donc de caractériser les déterminants d’entrée cellulaires des hepadnavirus d’un point de vue mécanistique et évolutif. Ceci nous permettra de retracer l’évolution des mécanismes d’entrée des Hepadnaviridae sur des millions d’années de co-évolution virus-hôte, et de déterminer le tropisme et les potentiels zoonotiques.

L’évolution du domaine PreS1 des orthohepadnavirus est variable selon l’espèce. Particulièrement, le PreS1 des hepadnavirus de chauves-souris est génétiquement proche du VHB humain, tandis que le PreS1 des hepadnavirus de rongeurs est très divergent et dépourvu des motifs clés pour interagir avec NTCP. D’autre part, nos analyses évolutives du NTCP des mammifères révèlent différents patrons évolutifs entre les espèces hôtes. Une hypothèse est que certains hepadnavirus se sont adaptés à d’autres déterminants d’interactions virus-hôte (autres domaines protéiques ou même autre récepteur) suite à un processus d’adaptation majeur et/ou à des mutations dans le NTCP. Les objectifs spécifiques de ce projet sont donc de (i) caractériser et comprendre l’histoire évolutive du PreS des hepadnavirus d’une part, et de la protéine NTCP chez les vertébrés d’autre part, et d’inférer leur histoire co-évolutive durant les millions d’années d’association virus-hôte, (ii) caractériser moléculairement la voie d’entrée des Orthohepadnavirus, avec un focus sur les interactions PreS-NTCP.

Pour cela, nous utiliserons une approche combinant des analyses évolutives et expérimentales. L’une des caractéristiques principales des interactions hôtes – pathogènes est l’évolution rapide et réciproque des deux acteurs afin de survivre. Cette « course aux armements » génétique peut laisser des signatures au niveau des sites d’interaction, elles-mêmes identifiables par des méthodes statistiques. Afin de déterminer si le PreS des hepadnavirus et la protéine NTCP ont co-évolué et de caractériser les signatures de conflit génétique sur des millions d’années de divergence, nous réaliserons des analyses phylogénétiques et de sélection positive chez les vertébrés. Dans un second temps, nous testerons la capacité des glycoprotéines de différents orthohepadnavirus à interagir avec le NTCP de leur hôte naturel. Pour les couples positifs, les déterminants d’interaction et d’entrée dans PreS-NTCP seront caractérisés. Pour cela, nous utiliserons une approche mécanistique guidée par nos analyses de sélection positive et de phylogénie. Nous pourrons ainsi tester si les sites positivement sélectionnés de NTCP sont à l’interface virus-hôte. Si l’interaction PreS-NTCP s’avère non-conservée chez les orthohepadnavirus, cette étude s’inscrira alors dans un projet de plus grande ampleur visant à caractériser les protéines impliquées et les mécanismes d’entrée cellulaires des hepadnavirus. Cette étude éclairera sur l’importance des acteurs impliqués dans l’entrée, sur les déterminants d’interaction, ou sur les contre-adaptations virales possibles lors d’une évolution de l’hôte. Par ailleurs, elle permettra de déterminer si les Hepadnavirus circulant aujourd’hui peuvent transgresser facilement les barrières d’espèces.

L’immunodéficience observée chez les patients infectés par le VIH-1 est principalement due à la mort des lymphocytes T CD4 non infectés (cellules « bystander »). Les glycoprotéines de l’enveloppe (Env) de ce virus, exprimées à la surface des cellules infectées, ont un rôle majeur dans ce processus  puisqu’elles ont la capacité d’induire la mort par apoptose des cellules T CD4 non infectées voisines.

L’autophagie est une voie catabolique majeure impliquée dans de nombreuses fonctions cellulaires comme l’homéostasie et l’immunité. Notre équipe a montré que l’autophagie est nécessaire au déclenchement de l’apoptose induite par Env dans les lymphocytes T CD4 non infectés, suggérant que la dégradation de composés cellulaires par ce processus pourrait être responsable de l’apoptose.

Nos résultats préliminaires montrent qu’Env induit un stress oxydatif dans les cellules cibles non infectées et que ce stress est impliqué dans leur mort par apoptose. De plus, nous avons observé que plusieurs marqueurs des peroxysomes sont dégradés dans les mêmes conditions et que cette dégradation se réalise par voie autophagique. Les peroxysomes sont des organelles chargées de maintenir un état d’oxydation compatible avec la survie cellulaire. L’hypothèse que nous souhaitons étudier dans ce projet est que l’autophagie, induite par Env, conduise à la dégradation sélective des peroxysomes, appelée pexophagie, entraînant l’accumulation d’espèces réactives oxygénées dans les cellules cibles, et ainsi leur mort par apoptose.

Pour ce faire, nous étudierons l’effet de Env sur la dynamique d’expression des protéines du peroxysome (suivi par plusieurs techniques de biochimie) ainsi que leur co-localisation avec des protéines de la machinerie autophagique (microscopie à fluorescence confocale et électronique). Nous identifierons également les récepteurs de l’autophagie sélective impliqués dans ce processus et nous confirmerons le rôle de la pexophagie dans la survenue de l’apoptose induite par Env dans les lymphocytes T CD4 bystanders. Enfin, nous étudierons la capacité de différentes enveloppes, issues de patients infectés par le VIH-1, à induire la pexophagie et l’apoptose dans les cellules T CD4 bystanders. A plus long terme, nous souhaitons réaliser un crible protéomique afin de déterminer quelles sont les autres cibles sélectives de la dégradation autophagique induite par Env dans ces cellules.

Les résultats que nous obtiendrons permettront de progresser dans la compréhension des évènements conduisant à la déplétion des cellules T CD4 bystanders en réponse à l’enveloppe du VIH.

Le virus de l’hépatite C (VHC) contrôle les voies métaboliques lipidiques de la cellule hôte pour son cycle viral. Cela se traduit en particulier par un détournement des corps lipidiques (CL), structures cellulaires de stockage des lipides. Les CL servent de source d’énergie, de source de  lipides, mais aussi de plateforme d’assemblage pour la particule virale. Les CL et leur métabolisme sont donc de nouvelles cibles pour le développement de stratégies antivirales. Les CL ont une organisation originale avec un cœur de lipides neutres entouré par une monocouche de phospholipides et un ensemble de protéines. Nous nous intéressons à une classe particulière des protéines du CL, les protéines de Classe I, dont fait partie la protéine core du VHC. Ces protéines présentent une convergence structurale avec un repliement en épingle à cheveux (hairpin). Très peu de données structurales existent sur ces protéines car elles sont très difficiles à manipuler en raison de leur forte hydrophobicité. Grâce à nos compétences acquises sur l’étude des oléosines, protéines de Classe I du CL des graines oléagineuses, nous proposons un projet d’étude fonctionnelle et structurale de la protéine core du VHC dans la levure selon un protocole d’expression hétérologue que nous avons développé au laboratoire. Ce contrat d’initiation va nous permettre d’obtenir les résultats nécessaires au développement de projets plus ambitieux d’études de biochimie structurale utilisant la rayonnement synchrotron que nous sommes les seuls à maitriser. De plus, les résultats qui découleront de ce projet contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes mis en œuvre par le virus pour détourner le métabolisme lipidique de sa cellule hôte et à fournir de nouveaux outils pour le criblage de molécules thérapeutiques.