Projets et candidats lauréats

Chez les eucaryotes, la traduction est un processus dynamique et rapide qui est régulé à la fois par la structure intrinsèque de l’ARN et de nombreuses protéines cellulaires qui se fixent sur l’ARNm. Contrairement au mécanisme de traduction procaryote, la sous-unité 40 S ne peut pas se lier directement sur l’ARN et l’attachement a lieu par le biais d’interactions ARN-protéines qui se mettent en place grâce à un ensemble de 12 facteurs d’initation (eIFs pour eukaryotic Initiation Factors). La sous-unité 40 S du ribosome associée à ces facteurs d’initiation constitue le coeur d’un vaste complexe macromoléculaire auquel se joint de nombreuses autres protéines de liaison à l’ARN pour former le complexe de préinitiation. Celui-ci a une composition variable en fonction de l’ARN considéré ce qui module sa fonction et lui permet de s’adapter aux contraintes structurelles que l’on trouve chez certains transcrits.

L’initiation de la traduction chez les eucaryotes, qu’elle soit opérée à partir de l’extrémité 5’ (coiffe-dépendante) ou en position interne (IRES-dépendante) consiste à attirer et lier le complexe de préinitiation sur l’ARNm afin qu’il puisse parcourir la région 5′ non traduite (5’UTR) pour accéder au codon AUG. Lorsqu’il arrive sur le site initiateur, ce complexe de préinitiation est dissocié pour permettre la liaison de la sous-unité 60 S du ribosome et constituer le ribosome 80S; celui-ci va ensuite parcourir la phase codante pour produire la protéine d’intérêt. L’étape d’initiation est l’étape limitante et elle détermine le taux de production protéique global de l’ARN concerné. A ce titre, l’initiation de la traduction est un processus extrêmement régulé et contrôlé à la fois par la structure de l’ARNm et la composition du complexe de préinitiation.

L’ARN génomique du VIH-1 est traduit dans le cytoplasme de la cellule infectée par la machinerie cellulaire de l’hôte et code pour les polyprotéines Gag et Gag/Pol. Il commence par une coiffe (guanosine méthylée-m7GTP) qui est suivie par une longue région 5′ non traduite (5’UTR) de 336 nucléotides qui contient de nombreux motifs complexes d’ARN dont la tige boucle TAR, le PBS, les signaux de dimérisation (DIS) et d’encapsidation (Psi). L’initiation de la traduction de l’ARNg est particulière puisqu’elle peut s’opérer à la fois à partir du 5′ de l’ARN (mécanisme coiffe-dépendant) ou sur 2 séquences IRES distinctes qui se trouvent dans la région 5’UTR (IRES1) et au début de la phase codante pour Gag (IRES2). Il est donc possible de recruter 3 complexes de préinitiation sur l’ARNg mais on ne sait pas si ces complexes peuvent se former simultanément ou si leur assemblage est mutuellement exclusif. On ne connait pas leur composition protéique ni leur dynamique d’assemblage au cours de la progression du cycle viral ou de l’état physiologique de la cellule hôte. En revanche, on sait qu’ils ont une composition variable en fonction de leur site de recrutement sur l’ARN.

Les objectifs de ce projet sont de cartographier et identifier la composition de ces complexes d’initiation sur leurs sites d’assemblage, c’est à dire à l’extrémité 5′ de l’ARN (coiffe/TAR) ou au niveau des 2 IRES afin de mieux comprendre comment s’articule la traduction du VIH-1. Pour ce faire, nous utiliserons la technique récente de biotinylation de proximité en combinaison avec un système d’édition de type CRISPR/Cas13 pour cibler des régions précises de l’ARNg. Cela permettra de cartographier les interactions protéines-protéines et déterminer le réseau complexe de ces interactants dans un rayon d’environ 10 nm autour des sites d’initiation.

L’infection respiratoire COVID-19, due à un nouveau coronavirus, le SRAS-CoV2, est apparue en décembre 2019 chez plusieurs personnes ayant fréquenté le marché d’animaux à Wuhan, dans la province du Hubei, en Chine. Alors que COVID-19 s’est propagé dans près de 200 pays et a causé deux millions de cas, la République Démocratique Populaire du Laos a détecté son premier cas confirmé très récemment, le 20 mars, soit trois mois après le début de l’épidémie en Chine. Au 12 avril 2020, la République Démocratique Populaire du Laos n’avait enregistré que 18 cas confirmés, un nombre très faible par rapport à tous les autres pays du monde touchés par l’épidémie.

Cependant, plusieurs facteurs clés suggèrent que le Laos aurait dû être beaucoup plus affecté par le COVID-19 pour les raisons suivantes: (i) L’existence de nombreux mouvements transfrontaliers entre ce pays et la Chine. (ii) Des caractéristiques biogéographiques et socio-écologiques similaires à celles du sud-ouest de la Chine. (iii) Une grande diversité de séquences de bétacoronavirus détectées dans plusieurs espèces de chauves-souris au Laos. (iv) La présence de nombreux marchés vendant de grandes quantités d’animaux sauvages locaux, notamment des chauves-souris et des pangolins.

Le projet LACOVISS vise à étudier, en utilisant une approche ONE-HEALTH, ce profil épidémiologique inattendu du SRAS-CoV-2 au Laos grâce à l’implication d’une équipe pluridisciplinaire de scientifiques de l’IRD, de l’Université de Caen, du Centre d’Infectiologie Lao-Christophe Mérieux (CILM) et du Laboratoire National de Santé Animale (LNHA) de Vientiane. Nous nous concentrerons sur une cohorte communautaire de 1092 ménages, dont 5400 participants à l’étude, suivie entre mars 2015 et février 2019 pour l’investigation des syndromes grippaux et la détection des agents causaux (projet LACORIS), située dans la région métropolitaine de Vientiane. Nous suivrons la progression du COVID-19 dans le pays et suivrons le SRAS-CoV-2, rétrospectivement et prospectivement, chez tous les acteurs potentiels de la circulation du SRAS-CoV-2, y compris les humains, les animaux domestiques et la faune.

Le projet LACOVISS apportera sans aucun doute de nouvelles informations sur la circulation du SARS-Cov-2 et des SARS-CoV au Laos et fournira des informations précieuses sur l’histoire naturelle de COVID-19 et sur les modalités de la contamination de l’Homme, qui sont encore largement inconnu.

L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) est un enjeu majeur de santé publique au niveau mondial avec près de 260 millions de porteurs chroniques. La prévalence de l’antigène de surface HBs du VHB varie de 0,2% à plus de 8% dans des régions de forte endémicité. Le nombre de décès associés à des cirrhoses du foie et des hépato-carcinomes a été estimé à 887.000 en 2015 dans le monde.

Le mode principal de transmission du virus de l’hépatite B (VHB) est la transmission périnatale de la mère à l’enfant.  Les conséquences cliniques en sont par ailleurs particulièrement graves puisque la précocité de l’infection est corrélée avec un risque de chronicité élevé. Malgré une immunoprophylaxie efficace chez le nouveau-né, celle-ci est mise en échec chez des enfants nés de mère dont la charge virale est supérieure à 200.000 UI/mL

L’objectif de ce projet est de développer un outil moléculaire innovant et permettant d’éviter le recours à des instruments afin de diagnostiquer la mère à risque de transmission.  Ce test permettra d’identifier les femmes enceintes infectées par le virus de l’hépatite B et ayant une charge virale élevée afin d’initier un traitement antiviral.

Ce test comprend des étapes pré-analytiques simples intégrant une extraction d’ADN rapide couplée à une amplification isotherme RPA. Ce système sera optimisé pour obtenir un seuil de détection à 200.000 UI/mL. Un contrôle interne synthétique sera intégré au test afin de valider ce seuil. Une détection semi-quantitative sur bandelette en flux latéral pourra être réalisée à l’œil nu.

Ainsi ce test simple et rapide, en évitant le recours à des instruments, ouvrira de nouvelles perspectives diagnostiques adaptées aux besoins des pays à ressources limitées.

La trithérapie antirétrovirale n’est pas capable d’éradiquer le virus VIH-1. Elle diminue la charge virale à des seuils indétectables et prévient les complications cliniques. Ceci étant, l’arrêt de ce traitement entraine systématiquement un rebond viral. Plusieurs études mettent en évidence l’expansion clonale des cellules infectées par le VIH-1. Ce processus exponentiel, à partir du réservoir, contribue directement au rebond viral au sein des tissus sanguin et lymphoïde après l’arrêt du traitement. Encore récemment, plusieurs efforts se sont concentrés sur la définition du réservoir et de l’infection latente du VIH. Naturellement « silencieux », l’approche actuelle ce concentre sur les phénomènes de réactivation virale et d’inversion de l’état de latence. Inaccessible chez l’homme, les modèles animaux par la détection de transgène ou protéine virale identifient seulement les intégrations transcriptionelles actives. Certains modèles murins humanisés ont l’avantage d’avoir une reconstitution fidèle du système immunitaire humain avec cellules dendritiques, lymphocytes, macrophages et organes lymphoïdes secondaires. Néanmoins, en l’absence de réactivation par des test in vitro, ces techniques censurent les intégrations silencieuses du réservoir.

Il n’existe pas aujourd’hui de technique capable d’identifier les cellules ancestrales du réservoir VIH-1. Nous proposons de mettre en place une nouvelle technique permettant de visualiser ces cellules du réservoir sans réactivation ex vivo au préalable.

 C’est par la visualisation de l’intégration de l’ADN proviral in vivo que nous arriverons à définir précisément la latence du virus. Nous avons récemment développé une technologie révolutionnaire, HIV-1 ANCHOR, permettant d’identifier spécifiquement l’ADN proviral par « live imaging ». La technologie HIV-1 ANCHOR offre l’opportunité unique d’identifier un faible nombre de cellules portant l’intégration de l’ADN proviral silencieuse ou transcriptionnellement active. La caractérisation de ces états fonctionnels in vivo pourra être disséquée afin de mettre en évidence les différents mécanismes moléculaires intervenant dans l’activation de l’ADN proviral : l’étude de la chromatine et l’accumulation des facteurs de la cellule hôte au sein du locus nucléaire viral seront des éléments clés de l’étude. Notre unité a une longue expérience des étapes précoces, intra cytoplasmique et nucléaire du VIH. Nous avons un intérêt particulier à la régulation spatiotemporelle du génome virale ainsi qu’aux mécanismes de régulation transcriptionnel. Il est important de noter que ces deux aspects sont des acteurs fondamentaux de la persistance du virus. Notre étude visualisera par “ live imaging” d’une part l’intégration proviral par le système HIV-1 ANCHOR et d’autre part l’activité transcriptionnelle  par un système couplé MS2. La combinaison de ces technologies de « live imaging » permettent d’identifier au sein d’un modèle vivant, le réservoir, ainsi que son comportement sous traitement et au cours du rebond viral.

 Notre but final, sera d’apporter une meilleure compréhension du réservoir par son identification et sa localisation. Nous approfondirons également la description du microenvironnement de la chromatine dans le rebond viral et les mécanismes de latence. Ces notions fondamentales seront très importantes dans l’élaboration de nouvelles stratégies d’éradication du virus en ciblant spécifiquement le réservoir et sa latence.

L’intégration du génome du rétroviral dans la cellule infectée est une étape clé du cycle réplicatif permettant de pérenniser l’infection. L’interaction fonctionnelle entre l’intasome (complexe formé entre l’ADN viral et l’intégrase, IN) et le nucléosome, complexe final siège de l’intégration, constitue le premier point de contact entre le génome viral et cellulaire. Cette association représente, ainsi, une plateforme d’échanges moléculaires entre le virus et l’hôte. Notre projet vise par une combinaison d’approches biochimiques, fonctionnelles et cellulaires, à définir les interfaces entre le complexe d’intégration du VIH-1 et son substrat cellulaire nucléosomal afin de comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu au sein de cette plateforme d’échanges.

Dans ce travail, nous i) caractériserons les interfaces physiques et fonctionnelles entre l’intasome et le nucléosome humain dans un contexte de nucléosome isolé mais aussi dans le cadre de differentes structures chromatiniennes ; ii) déterminerons comment ces interfaces sont régulées par les facteurs cellulaires précédemment identifiés (cofacteurs de l’IN, structure et remodelage de la chromatine, machineries associées à la transcription) ; iii) développerons la première approche thérapeutique ciblant spécifiquement les interfaces intasome/nucleosome par la technique Alphascreen.

Ce projet permettra notamment de déterminer comment cette association intasome/nucléosome peut affecter le choix du site d’insertion de l’ADN viral, l’efficacité d’intégration et de réplication du virus ainsi que le développement d’approches thérapeutiques innovantes. Notre travail constituera ainsi la première caractérisation d’envergure du complexe intasome/nucléosome, intermédiaire central de l’intégration et de la réplication virale.