Projets et candidats lauréats

Contexte: Malgré les progrès dans la prise en charge du VIH, 180000 enfants sont nouvellement infectés par le VIH en 2017 dans le monde, 45% d’entre eux naissent en Afrique de l’Ouest et Centrale où l’accès aux programmes de PTME (48%) et l’accès au diagnostic précoce (11%) reste limité. Le diagnostic précoce à 4-6 semaines de vie et le traitement ARV des enfants infectés avant le 60éme jours de vie est recommandé par l’OMS, compte tenu de la mortalité considérable dans les premiers mois de vie. Si le transport à l’échelle national des prélèvements pédiatriques dans un laboratoire central peut-être opérationnel dans certains pays très structuré comme en Ouganda, l’utilisation de point of care (POC) dans les centres de santé ou une centralisation à petite échelle des POC dans des hub paraît intéressante pour les pays à ressources limitées. L’utilisation de POC pour le diagnostic précoce de l’infection des nourrissons, en réduisant le délai de l’obtention des résultats, permet de réduire le nombre d’enfants perdus de vue et  permet d’améliorer l’accès au traitement ARV précoce des enfants infectés et est recommandé par l’OMS. En Guinée, la prévalence du VIH est de 1,7% et la décentralisation des soins (327 sites de PTME) rend irréaliste sur le plan opérationnel et financier la réalisation de POC dans tous les sites de prise en charge. La Guinée a mis en place un système centralisé, l’ensemble des tests étant réalisé dans un laboratoire central. En 2016 parmi les 2214 enfants exposés au VIH au niveau du pays, 246 ont bénéficié d’un test. Il était positif pour 43 d’entre eux et finalement 17 enfants ont initié un traitement ARV. Le projet ANRS 12344 Diavina en cours au niveau d’une seule maternité, a permis de dépister et traiter 20 enfants en 18 mois, montrant le potentiel d’amélioration. On peut en effet estimer qu’à Conakry, où vit 17% de la population guinéenne, qu’environ 1500 enfants exposés au VIH et 250 sont infectés chaque année. Par ailleurs, les pharmacies des centres de sante connaissent très régulièrement des rupture de test de dépistage des femmes enceintes ou de traitement antirétroviraux pédiatrique compliquant encore la cascade de prise en charge. L’utilisation de drone pourrait représenter une approche innovante pour que la rapidité du POC combinée avec un transport rapide des échantillons et un approvisionnement d’urgence en produit de santé puisse bénéficier aux enfants exposés au VIH.

Objectif principal:modélisation du coût-utilité de l’utilisation de drones pour le transport des échantillons sanguins et l’approvisionnement d’urgence des centres de santé pour la prise en charge des enfants exposés au VIH à Conakry.

Stratégie de l’étude: Mise en place d’un groupe de travail en Guinée impliquant les responsables nationaux et les acteurs de terrains dont les principaux objectifs seront de coordonner :

• L’évaluation des besoins en matière de prise en charge des enfants exposés au VIH à Conakry
• L’évaluation de l’acceptabilité de l’utilisation de drones par les autorités, le personnel de santé et la population.
• La réalisation d’une étude pilote de l’utilisation d’un drone pour le transport de DBS entre le service de pédiatrie de l’Hôpital Ignace Deen et le laboratoire de l’hôpital Donka bénéficiant de l’appui de l’équipe de projet ANRS 12344-Diavina et d’une société spécialisée dans le développement de drones professionnels.

Echéancier :

Février 2019: composition du groupe de travail

Mars-Juin 2019: Réalisation des études et obtention de l’accord des autorités pour le projet pilote.

Juin 2019-Décembre 2019 : étude pilote utilisation drone

Janvier 2019 : rédaction d’un cahier des charges drone adapté aux besoins

Février 2019 : rédaction projet de recherche ANRS

Résultats attendu : Ce projet permettra de réaliser une étude de faisabilité de l’utilisation d’un drone à Conakry et d’informer sur les enjeux cout /efficacité d’une telle stratégie avant la réalisation d’un projet opérationnel à plus grande échelle à Conakry.

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Contexte scientifique  

Les carcinomes hépatocellulaires (CHC) sont classés en plusieurs sous-types moléculaires liés à des mécanismes de carcinogenèse spécifiques mais aussi à des caractéristiques cliniques et pronostiques différentes. Le lien entre les caractéristiques radiologiques du CHC et ces différents sous-types moléculaires n’est pas établi. L’objectif principal de notre étude est de réaliser une classification radio-moléculaire du CHC lié à l’hépatite B, afin d’identifier de façon non-invasive les principaux sous-groupes moléculaires de CHC en imagerie. De plus, nous comparerons les caractéristiques radiologiques et moléculaires des CHC liés au VHB aux CHC non liés au VHB.

Description du projet

Nous analyserons une série de 171 CHC développés sur hépatopathie chronique virale B qui seront divisés en une cohorte de test de 111 CHC et une cohorte de validation indépendante de 60 CHC, pour lesquels les échantillons congelés sont déjà stockés au laboratoire. 

Toutes les imageries réalisées dans les 3 mois précédant le prélèvement des tumeurs seront revues par des radiologues. Les caractéristiques radiologiques seront évaluées en aveugle des résultats moléculaires à l’aide d’une grille prédéfinie comprenant les catégories LI-RADS. Ensuite, nous effectuerons des analyses en deep-learning afin d’identifier les signatures radiomiques des sous-groupes moléculaires.

La cohorte « test » de 111 CHC liés au VHB dont la moitié est déjà séquencée en whole genome sequencing (WGS) et analysée en transcriptomique au laboratoire (n=56 tumeurs et foies non tumoraux correspondant), la deuxième moitié de 55 tumeurs reste à séquencer et à analyser en WGS, et analyser en transcriptomique par RNAseq. Sur la base de ces données, nous évaluerons les voies d’altérations génétiques somatiques dans les gènes driver, les signatures mutationnelles, l’identification des sites d’insertion du VHB et ainsi que la caractérisation et la quantification des différentes formes d’ADN viral (réplicative, linéaires etc…). Nous évaluerons également le profil transcriptomique des CHC afin de les classer selon la classification G1-G6, le score 5 gènes et selon la dérégulation des voies de signalisation, ainsi que le profil immunologique des tumeurs et l’expression des ARN viraux. Nous corrélerons les caractéristiques radiologiques et la signature radiomique avec les données moléculaires, les caractéristiques histologiques et clinico- biologiques afin d’identifier des sous-types homogènes de CHC.

Une cohorte de validation de 60 CHC sur hépatite B sera utilisée pour confirmer les résultats de la cohorte « test ». Pour tous ces échantillons, nous effectuerons une analyse quantitative par RT-PCR en utilisant la technologie fluidigm d’une sélection de 300 gènes incluant les gènes permettant de réaliser la classification G1/G6, le score pronostique à 5 gènes, les gènes appartenant à différentes voies de signalisation, les gènes des cellules souches, les gènes de l’infiltrat inflammatoire et les gènes codant pour des transcrits viraux. De plus, sur ces mêmes échantillons, nous effectuerons le séquençage des 25 principaux gènes driver mutés de façon récurrente dans le CHC en utilisant la technologie Miseq. Tous les résultats de l’analyse moléculaire seront corrélés avec les caractéristiques d’imagerie et de radiomique ainsi qu’avec les données cliniques et histologiques afin de valider dans cette cohorte nos résultats.

Nous déterminerons la validité des critères radiologiques seuls ou en combinaison pour identifier les différents sous-groupes moléculaires de CHC. De plus, nous proposerons une nouvelle classification radio-moléculaire du CHC lié au VHB. Enfin, nous évaluerons la valeur pronostique de la classification radio-moléculaire.

Résultats attendus

Nous cherchons à obtenir une description complète du CHC lié au VHB sur le plan génomique et de l’imagerie afin de décrire une nouvelle classification radio-moléculaire. Cette classification pourrait être utile en pratique clinique à visée pronostique, diagnostique, et théranostique.

La maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) représente un des plus grands défis sanitaires de ce siècle au niveau global. Les données actuelles présentent une situation critique et alarmante dans la majorité des régions affectée, et tout particulièrement en Asie, en Europe et aux USA. L’évolution dramatique de cette pandémie dans les régions du monde les mieux préparées à une telle situation fait craindre pour le continent africain, une perspective incertaine. Le continent africain présente pour l’instant des données extrêmement parcellaires qui ne permettent pas de définir l’état de l’épidémie sur le continent. Sans ces informations, il est et sera difficile, voire impossible de développer des stratégies et des réponses adaptées pour prévenir, contenir et éradiquer l’épidémie sur le continent.

L’objectif principal de cette étude est de générer des données épidémiologiques en utilisant des outils et technologies plus adaptés au contexte du Sud et modéliser l’état et la progression de l’épidémie dans la région à partir de ces données, notamment celles de portage d’anticorps spécifique au SARS-CoV-2 dans les communautés du Sud. Nous articulons notre recherche également sur les performances, l’apport et la place des tests rapides dans le diagnostic et la surveillance épidémiologique du COVID-19 en Afrique Sub-Saharienne.

L’étude sera conduite en Afrique centrale, dans deux pays que sont le Gabon et la République du Congo. Ces 2 pays sont confrontés à une montée de l’épidémie comme les autres pays de la région et peuvent servir de sites de recherche pour la définition de stratégies pouvant s’appliquées aux autres pays de la région, voire du continent. Cette recherche nous permettra de combler un important vide dans la stratégie actuelle de compréhension et de riposte contre l’épidémie.

Le développement de manifestations cliniques sévères suite à une infection par le virus de l’hépatite E (VHE) s’accroît avec l’âge. Contrairement au jeune adulte, où l’infection est généralement asymptomatique, le VHE induit, dans un tiers des patients de plus de 60 ans, des hépatites aiguës sévères (ictère et lésions hépatiques). Des facteurs propres à l’hôte tels que la réponse immunitaire déterminent l’issue de l’infection VHE. Dans ce contexte, nous avons récemment analysé les différentes sous-populations de lymphocytes T CD8 provenant d’individus âgés sains ou infectés par le VHE et présentant ou non des symptômes cliniques sévères (patients symptomatiques ou asymptomatiques). Cette étude nous a permis de révéler qu’un dysfonctionnement de la population de lymphocyte T CD8 effecteur mémoire (EM) est corrélé à la pathogenèse du VHE chez les personnes âgées. En effet, comparé aux donneurs sains ou aux patients asymptomatiques, les patients symptomatiques sont caractérisés par une accumulation de lymphocytes T CD8 EM fortement activés. Cette sur-activation, non restreinte aux cellules spécifiques du VHE, est a été mise en évidence par la co-expression de plusieurs marqueurs d’activation (HLA-DR et CD38), de prolifération (Ki-67) et d’inhibition (PD-1, TIM-3 et LAG-3). De plus, ce phénotype activé est associé à des défauts qualitatifs et quantitatifs dans la sécrétion de cytokines de type Th1 et Th2. Ainsi, nous avons observé d’une part une diminution de la sécrétion de TNF-α et de l’IL-2 associé à une accumulation de cellules monofonctionnelles secrétant uniquement l’IFN-γ et d’autre part, une augmentation de la sécrétion de l’IL-4. En revanche, les cellules T CD8 EM des patients asymptomatiques ont un état d’activation modéré et une fonction sécrétrice intacte. Cependant, les mécanismes sous-jacents à ce dysfonctionnement demeurent inconnus. A cet égard, les fonctions des cellules T sont étroitement liées à leur métabolisme énergétique qui peut être altéré avec l’âge et lors des infections virales. De plus toute altération de ces voies conduit non seulement à des réponses inefficaces des lymphocytes T, mais aussi à leur épuisement. Dans ce sens, nos expériences préliminaires suggèrent que les patients symptomatiques pourraient présenter un défaut dans la voie de la glycolyse qui est une des voies principales de production d’énergie. Pour toutes ces raisons, nous émettons l’hypothèse que des changements métaboliques liés à l’âge et/ou l’infection par le VHE sous-tendent l’altération des fonctions des cellules T CD8 EM chez les patients symptomatiques. Pour vérifier notre hypothèse, nous identifierons dans un premier temps les principales voies métaboliques (glycolyse, phosphorylation oxydative, glutaminolyse et β-oxydation des acides gras) impliquées dans les fonctions des cellules T CD8 EM chez des patients âgés infectés par le VHE symptomatiques/asymptomatiques, des sujets sains du même âge ainsi que des patients VHE jeunes (<45 ans). Nous analyserons ainsi l’absorption des éléments qui alimentent chaque voie métabolique ainsi que les étapes clés de leurs transformations. Dans un deuxième temps, nous modulerons ces voies dans le but de restaurer les fonctions sécrétrices des lymphocytes T CD8 EM. Pour cela, nous activerons ou inhiberons les voies métaboliques citées ci-dessus et analyserons les conséquences sur la sécrétion d’IFN-γ, de TNF-α, d’IL-2 et d’IL-4. L’ensemble de données générées dans cette étude nous permettra de déterminer i) les voies métaboliques utilisées chez les personnes âgées pour générer l’énergie nécessaire à la réponse immunitaire, ii) si l’infection par le VHE affecte ces voies métaboliques, iii) si un défaut de certaines voies métaboliques est à l’origine de l’altération des fonctions sécrétrices des lymphocytes T CD8 EM et iv) si leur reprogrammation peut restaurer la réponse immunitaire. Notre projet présente donc un intérêt majeur, à la fois sur un plan fondamental et clinique, et ouvre de nouvelles perspectives pour le développement de stratégies thérapeutiques innovantes dans le contexte du vieillissement.

En plus des éléments cis-régulateurs localisés dans la longue répétition terminale 5’ (LTR 5’) du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), notre laboratoire a identifié une importante région cis-régulatrice intragénique (IRR), présentant une activité enhancer sur le promoteur viral localisé dans le LTR5’. A l’origine identifiée comme étant associée à une région chromatinienne ouverte dans un contexte myéloïde uniquement, nos résultats récents ont montré que l’IRR était également critique pour médier la transcription et la réplication du VIH-1 dans des lymphocytes T infectés, démontrant l’importance d’étudier le rôle fonctionnel de l’IRR dans les deux contextes cellulaires d’infection par le VIH-1. De manière intéressante, nous avons identifié dans l’IRR trois sites de liaison pour le facteur de transcription myeloïde-spécifique PU.1. Le présent projet de recherche vise à comprendre plus avant les mécanismes moléculaires régulant la transcription et la latence du VIH-1 dans les deux cibles cellulaires majeures de l’infection, en étudiant le rôle joué par l’IRR sur l’activité promotrice du LTR5’. Dans la première partie du projet, nous étudierons le rôle du facteur de transcription myeloïde-specifique PU.1 dans la régulation transcriptionnelle et épigénétique du VIH-1 dans un modèle d’infection hautement physiologique, en réalisant des expériences d’infection de macrophages primaires dérivés de monocytes (MdMs) avec des particules virales contenant le génome viral du VIH-1 sauvage ou muté au niveau des sites intragéniques de liaison pour le facteur PU.1. Ensuite, afin de caractériser davantage le rôle fonctionnel de PU.1 dans la transcription et la réplication du VIH-1, nous inhiberons la liaison de PU.1 par une approche pharmacologique en utilisant un composé appelé diamidine hétérocyclique DB2115, connu pour inhiber sélectivement la liaison de PU.1 à ses sites cibles. Dans la seconde partie du projet, nous étudierons le rôle du facteur nucléaire T-spécifique se liant aux PU-boxes de l’IRR dans un contexte d’infection T-lymphocytaire. Nous étudierons le rôle de ce facteur dans la régulation transcriptionnelle et épigénétique du VIH-1 afin de démontrer les fonctions critiques jouées par l’IRR dans les deux contextes cellulaires majeurs d’infection par le VIH-1. Dans la dernière partie du projet, étant donné que la régulation transcriptionnelle du VIH-1 est un mécanisme multifactoriel complexe, comprenant de multiples niveaux de contrôle dont la structure tri-dimensionnelle (3D) de la chromatine, nous étudierons le rôle de protéines architecturales sur la régulation de la structure chromatinienne 3D des cellules infectées par le VIH-1. Plus précisément, dans l’IRR mais également le long du provirus VIH-1, nous avons identifié des sites de liaison pour CTCF et YY1, deux protéines architecturales impliquées dans la formation de boucles chromatiniennes. De plus, notre laboratoire a acquis une expertise importante dans la caractérisation des boucles chromatiniennes médiées par CTCF en étudiant d’autres rétrovirus dont le BLV et le HTLV-1. Afin d’étudier si le provirus du VIH-1 est capable de modifier l’organisation 3D de la chromatine dans les cellules infectées, nous étudierons le recrutement in vivo de CTCF et YY1 le long du provirus VIH-1 ainsi que leurs potentielles interactions 3D, par des expériences de 4C-seq. Par des expériences de CRISPR/Cas9, nous muterons ensuite les différents sites de liaison viraux pour CTCF et YY1 afin d’abolir la formation des boucles chromatiniennes et de caractériser le rôle fonctionnel de ces facteurs dans la latence virale et sur le transcriptome de la cellule infectée. Cette partie du projet de recherche contribuera à une meilleure compréhension des interactions 3D entre le provirus VIH-1 et son environnement génomique. En conclusion, notre projet de recherche permettra une connaissance plus approfondie des mécanismes moléculaires associés à la transcription et à la persistance du VIH-1 dans les deux réservoirs cellulaires majeurs du VIH-1 latent, ainsi que de nouvelles options thérapeutiques innovantes visant à contrôler l’infection virale.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) requiert la contribution concertée de nombreux facteurs cellulaires et de différentes voies de signalisation pour se répliquer. Parallèlement, les cellules de mammifères expriment de nombreuses protéines qui agissent de façon dominante et autonome afin de supprimer la réplication virale. Ces facteurs de restriction définissent la première ligne de défense contre les infections. Parmi eux, les protéines de la famille APOBEC3 (apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3 ou A3) et en particulier A3G et A3F, sont des désaminases de cytosines dont l’action d’édition des cytosines en uridines lors de la transcription inverse du génome viral est létale pour le virus. L’activité antivirale d’A3G/3F est contrecarrée par la protéine Vif (virion infectivity factor) du VIH-1, qui réduit considérablement leur taux d’expression et leur incorporation dans les particules virales (i) en recrutant une E3 ubiquitine ligase et en induisant la dégradation d’A3G par le protéasome, (ii) en réduisant la transcription des gènes dépendant de RUNX, dont A3G, et (iii) en régulant négativement la traduction de l’ARNm d’A3G. Concernant ce dernier mécanisme, nous avons récemment découvert la présence d’un uORF (upstream ORF) dans la région 5’ non traduite (5’UTR) de l’ARNm d’A3G et montré son importance non seulement pour la traduction intrinsèque d’A3G, qui serait traduit par un mécanisme original de leaky-scanning et de ré-initiation, mais également pour sa régulation par Vif.

Au vu du rôle des uORF dans la répression traductionnelle en général, notre projet s’articulera autour de 3 axes majeurs :

1. Explorer la conservation phylogénétique de l’uORF chez les hominoïdes et son impact dans la réplication virale. Nous avons montré la conservation de l’uORF d’A3G pour A3F chez l’humain, avec des propriétés similaires vis-à-vis de Vif. Nous élargirons nos connaissances phylogénétiques au niveau de l’uORF à l’ensemble des APOBEC3 issues des hominoïdes et étudierons l’impact du polymorphisme sur l’expression protéique et la réplication virale (collaboration avec Lucie Etienne, ENS-CIRI, Lyon).
2. Identifier les facteurs protéiques cellulaires requis pour l’inhibition traductionnelle. Par des techniques de pull-down basées sur la biotinylation des ARNm d’A3G ou par l’utilisation d’une biotine ligase (BirA), suivie d’une analyse par spectrométrie de masse, nous identifierons les facteurs protéiques cellulaires spécifiques de Vif et de l’uORF de l’ARNm d’A3G.
3. Cartographier les ARNm cellulaires régulés par Vif. Vif étant une protéine chaperon d’ARN, nous chercherons à identifier par la technique de PAR-CLIP les ARN cellulaires qui interagissent avec Vif (potentiellement via une uORF). Ces ARN, et/ou leur produit d’expression, pourraient être des régulateurs potentiels de la réplication virale (collaboration avec Sarah Gallois-Montbrun, Institut Cochin, Paris).

L’ensemble de ces résultats devrait apporter une vision nouvelle sur un mécanisme original d’inhibition traductionnelle induit par une protéine virale. Cette nouvelle compréhension élargie du phénomène de restriction cellulaire pourrait permettre à l’ensemble de la communauté scientifique d’imaginer de nouvelles stratégies d’inhibition de la réplication virale qui ciblerait spécifiquement l’interaction de Vif avec les ARNm d’A3G/3F, le complexe d’initiation de la traduction dépendant de Vif ou encore les nouveaux partenaires identifiés.