Projets et candidats lauréats

La tuberculose (TB), causée par Mycobacterium tuberculosis (Mtb) reste l’une des principales causes de décès due à un agent infectieux dans le monde. Le traitement de la tuberculose nécessite plusieurs mois de chimiothérapie avec des schémas thérapeutiques complexes contenant plusieurs antibiotiques. Malheureusement, la durée et la toxicité des régimes antituberculeux disponibles affectent considérablement l’observance, conduisant à des échecs thérapeutiques, des rechutes et l’émergence de résistances. Ce nombre croissant de souches multirésistantes constitue un véritable défi clinique extrêmement préoccupant. Dans ce contexte, le développement de nouvelles interventions thérapeutiques est désespérément nécessaire pour réduire la durée du traitement et éviter la génération de sous-populations multirésistantes récalcitrantes.

Parmi les médicaments de première ligne disponibles, le pyrazinamide (PZA) joue un rôle clé dans le traitement de la tuberculose. En effet, l’introduction de cet antibiotique dans la chimiothérapie antituberculeuse standard a permis de raccourcir la durée du traitement de 9-12 mois à 6 mois. Le PZA est donc l’une des meilleures molécules à notre disposition. Deux mécanismes majeurs, communément acceptés au sein de notre communauté scientifique, ont été proposés pour décrire le mode d’action du PZA. Le premier nécessite un pH microenvironnemental acide pour être efficace en perturbant l’homéostasie du pH intrabactérien et le potentiel de membrane. Le second, ne nécessite aucune étape de protonation et cible l’aspartate carboxylase PanD, impliquée dans la biosynthèse de la co-enzyme A, ayant ainsi une efficacité quel que soit le pH microenvironemental. Ainsi, bien qu’il soit utilisé en clinique depuis près de 50 ans, le mode d’action moléculaire du PZA reste mal caractérisé avec des modèles potentiellement conflictuels.

Afin de répondre à ces questions, nous avons conçu une proposition de projet d’initiation intitulée  » Contribution moléculaire du pH et de l’aspartate décarboxylase PanD dans le mode d’action du pyrazinamide chez Mycobacterium tuberculosis (PanDMyc) » qui vise à développer de nouveaux outils biologiques, technologiques et analytiques pour décrypter les bases moléculaires responsales de l’activité du PZA.

Dans un premier temps, nous proposons de développer un programme de répression transcriptionnelle (CRISPRi) chez Mycobacterium tuberculosis. Ensuite, ce système permettra de réaliser des approches chimio-génétiques innovantes pour caractériser les hypothétiques cibles et voies biologiques impliquées dans la sensibilité au PZA. Nos travaux se focaliseront donc sur la cible putative PanD, impliquée dans la biosynthèse de la co-enzyme A et la contribution du pH microenvironnemental.

Avec ces investigations, nous visons à redéfinir le mode d’action du PZA, apportant ainsi de nouvelles connaissances sur les principes fondamentaux de la chimiothérapie et l’émergence d’une population résistante aux médicaments avec des implications cliniques importantes.

Nous croyons fermement que les conclusions qui découleront de ce contrat d’initiation fourniront une base solide pour la conception d’un projet multidisciplinaire très ambitieux qui a le potentiel de bénéficier non seulement aux chercheurs fondamentaux et aux cliniciens, mais également à la définition de nouvelles stratégies thérapeutiques, le raccourcissement de la durée du traitement et ultimement bénéficier aux patients grâce à un meilleur contrôle global des cas de TB.

La réplication rétrovirale se déroule grâce à une étape obligatoire, l’intégration, qui est essentielle pour une expression génique virale efficace et garantit une ségrégation égale du matériel génétique du virus aux cellules filles après la division cellulaire. Bien que l’intégration rétrovirale se produise dans tout le génome humain, elle n’est pas entièrement aléatoire. Les lentivirus tels que le VIH, par exemple, ciblent de préférence les gènes actifs. Des recherches effectuées au cours des dernières années ont révélé que le facteur cellulaire associé à la chromatine, LEDGF/p75, et, plus récemment, le facteur nucléaire CPSF6 jouent un rôle dominant dans l’intégration du VIH dans les gènes actifs. Comme le VIH ne nécessite pas de division cellulaire pour pénétrer dans le noyau, l’ADN viral pour accéder à la chromatine rentre dans le noyau à travers le complexe de pores nucléaires (NPC).

Les NPC jouent un rôle important dans l’organisation de la chromatine 3D, ainsi que dans la régulation de l’expression des gènes cellulaires et, probablement, des gènes viraux. De plus, des études récentes, dont la nôtre, ont montré l’implication de certains Nups dans l’infection par le VIH. Récemment, nous avons montré que l’environnement de la chromatine à proximité des NPC favorisait la réplication virale. Plus récemment, nous avons publié une étude montrant qu’un autre facteur nucléaire, le CPSF6, joue un rôle important dans la sélection des sites d’intégration dans la chromatine active et dans les régions à majeur densité génique. Cependant il est possible que Nups et CPSF6 coopèrent pour autoriser une réplication efficace du VIH.

Des études sur différents parasites qui s’intègrent en permanence dans le génome de l’hôte montrent qu’ils ont évolué pour cibler la chromatine de manière à optimiser leur coexistence avec les hôtes et à favoriser la libération de nouveaux descendants viraux. En revanche, les lymphocytes T infectés par le VIH-1 ne survivent généralement qu’un jour ou deux avant d’être tués par le système immunitaire cellulaire ou par la toxicité de l’infection. Ainsi, le VIH doit libérer des taux élevés de virus dans les quelques jours suivant l’infection. L’intégration virale dans les gènes actifs est généralement favorable à une transcription efficace expliquant potentiellement la préférence de ciblage. Cependant, le VIH peut également coexister pendant des périodes prolongées en tant que chimère dans le génome de patients infectés comme virus latent. Par conséquent, les mécanismes sous-jacents à ce phénomène sont encore à l’étude et il est fort possible que les facteurs de chromatine associés aux protéines d’entrée nucléaire puissent jouer un rôle critique sur la persistance du VIH dans les cellules infectées.

Dans notre laboratoire, nous avons récemment mis au point un nouvel outil d’imagerie qui peut permettre de visualiser en temps réel l’ADN viral une fois retrotranscrit jusqu’à son intégration dans la chromatine de la cellule hôte. Cette technologie révolutionnaire sera l’occasion d’élucider la dynamique de l’interaction entre le génome de l’ADN viral et les facteurs de l’hôte ou d’identifier les sites de la chromatine impliqués dans la transcription ou la latence virale.

Dans le projet proposé, nous explorerons le lien entre le NPC et les sites d’intégration du VIH pour caractériser le rôle intrigant et inconnu des nucléoporines, des facteurs nucléaires et des «topologically chromatin associating domains» ou des régions régulatrices comme les « super enhancers »  pour orchestrer la transcription virale.

Contexte. L’hépatite D chronique est la forme la plus sévère d’hépatite virale chronique. Elle est causée par le virus de l’hépatite D (VHD), petit virus satellite du virus de l’hépatite B, responsable d’une aggravation et d’une accélération de la maladie hépatique chez les patients souffrant d’hépatite B chronique, ainsi qu’un risque accru de développer un carcinome hépatocellulaire. Le virus n’est que partiellement sensible aux thérapies basées sur l’interféron, et à l’heure actuelle, aucun traitement ne permet l’élimination du virus chez les patients chroniquement infectés. Si le cycle viral est bien décrit, Les interactions entre le VHD et les facteurs hépatocytaires sont encore assez mal connus, bien que ceux-ci représentent des cibles pertinentes pour le développement de nouveaux traitements curatifs contre ces infections.

Méthodes. Nous avons appliqué une double approche de criblage génomique fonctionnelle et chimique et identifié de nouveaux facteurs cellulaires impliqués dans le cycle viral du VHD, dont la triple enzyme CAD jouant un rôle clé dans la biosynthèse des pyrimidines. Son inhibiteur spécifique, le PALA, et un antiviral puissant contre le VHD et un candidat aux études précliniques. Par ailleurs, un total de 33 gènes candidats potentiellement importants pour le cycle viral a été validé à partir du criblage génomique primaire.

Objectifs spécifiques. Le but de ce projet est la caractérisation de ces candidats dans des modèles physiologiques, hépatocytes primaires et modèles murins, afin de comprendre leur implication dans le cycle viral du VHD et d’évaluer leur potentiel thérapeutique. Par ailleurs, étant donné le succès de notre première approche de criblage, nous souhaitons tester de nouvelles banques chimiques et appliquer des méthodes fonctionnelles alternatives pour l’identification de nouveaux candidats. Les objectifs spécifiques sont les suivants :

• Valider et caractériser de nouveaux facteurs hépatiques impliqués dans l’infection par le VHD

a/ Validation des genes candidats issus du criblage génomique

b/ Identification et caractérisation de facteurs cellulaires intéeragissant avec l’antigène delta (HDAg)             

• Caractérisation du PALA en modèles précliniques (modèles murins)
• Identification de nouvelles molecules antivirales par criblage chimique à haut debit.

Résultats attendus et conclusion. Les résultats de ce programme feront progresser notre compréhension du cycle viral du VHD et fourniront de nouvelles cibles thérapeutiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement contre cette infection majeure du foie.

L’hépatite virale fulminante (HVF) est une maladie extrêmement grave, survenant suite à une infection par les virus de l’hépatite, en particulier le virus de l’hépatite A (VHA) ou B (VHB), ou plus rarement par un herpès virus. Bien que très rare, l’HVF est une maladie dévastatrice avec moins de 20% de chance de survie sans transplantation hépatique. Aucune épidémie de HVF n’a été reportée, excluant l’émergence d’une souche virale avec une virulence accrue. Malgré l’observation de la destruction massive du foie, la pathogénie reste encore incomprise. Nous formulons l’hypothèse que l’HVF peut être la conséquence d’une prédisposition génétique de l’hôte due à des mutations rares touchant la réponse immunitaire spécifique du foie. Nos résultats préliminaires sont très prometteurs avec l’identification de mutations rares dans deux gènes candidats, CERS5 et IL18BP, dans deux familles indépendantes. Ces observations confortent fortement notre hypothèse de travail d’une prédisposition génétique mendélienne à l’HVF, au moins pour certains patients.

Méthodologie : Nous utilisons une stratégie qui nous a déjà conduit à l’identification de plusieurs maladies génétiques dans des pathologies infectieuses rares et sévères et qui combine une approche génétique avec le séquençage de l’exome et une validation fonctionnelle approfondie. Ces expériences fonctionnelles associent de façon synergique des études in vitro sur des cellules humaines, et in vivo dans un modèle murin en collaboration avec l’équipe de M. Samson, expert dans l’étude de l’immunité du foie chez la souris. La faisabilité du projet est excellente, s’appuyant sur des données préliminaires très encourageantes, et sur l’expertise considérable des 2 laboratoires concernés.

Conséquences attendues de la recherche : L’identification des premiers gènes associés à l’HVF va permettre une meilleure compréhension de la réponse antivirale hépatique et fournit des informations importantes pour l’investigation de la prédisposition génétique aux autres formes d’hépatite fulminante, notamment toxique médicamenteuse, ou d’hépatite chronique. Ces découvertes devraient également conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques basées sur une meilleure compréhension de la physiopathologie de cette maladie extrêmement sévère.

La distribution mondiale et régionale du VIH-1 dépend de nombreux facteurs, tels que la prévalence du VIH-1, la mobilité des populations, les facteurs socio-économiques, les différentes souches virales et les différences d’accès au traitement antirétroviral et aux soins cliniques. Il est important de mieux comprendre la dynamique de l’épidémie de VIH-1, car elle sert de support aux recherches sur l’évolution du profil de l’épidémie et sur les implications potentielles pour le diagnostic, la prise en charge clinique et la santé publique.

Notre objectif est de retracer l’origine géographique de l’acquisition du VIH-1 pour les migrants en Europe du Sud, en utilisant les méthodes d’épidémiologie moléculaire les plus récentes. Nos objectifs sont:

– Réaliser des analyses phylogénétiques et phylogéographiques de l’acquisition du VIH-1 parmi les migrants de chaque pays participant (France, Grèce, Italie, Espagne et Portugal),

– Effectuer une analyse phylogénétique et phylogéographique globale de l’acquisition du VIH-1 chez les migrants au niveau européen,

– Évaluer les caractéristiques de la dynamique de transmission à travers la valeur ajoutée du séquençage à haut débit dans des chaînes de transmission spécifiques.

L’étude sera menée en utilisant toutes les données de séquences VIH-1 disponibles auprès des principaux centres de référence pour le VIH dans cinq pays européens participants et toutes les données accessibles au public dans le monde entier pour les sous-types et les formes recombinantes les plus répandus infectant les migrants. L’analyse sera basée sur des méthodes moléculaires pouvant fournir des estimations précises de l’origine la plus présumée de l’acquisition du VIH-1. Une combinaison de méthodes sera utilisée afin de tracer avec précision les caractéristiques spatiales de l’acquisition du VIH-1. Grâce au grand nombre de patients (n = 47039) qui seront inclus dans cette étude et provenant de pays à prévalence élevée du sud de l’Europe et compte tenu du nombre croissant de réfugiés en provenance d’Afrique du Nord et du Moyen-Orient, qui présentent l’une des plus fortes augmentations de nouvelles infections par le VIH au cours des dernières années, les résultats issus de ce projet fourniront de nouvelles informations sur les caractéristiques d’acquisition et de dispersion de l’infection VIH-1 parmi les migrants. Ces données obtenues grâce à des outils innovants auront un impact sur la prévention, les stratégies de dépistage et la prise en charge clinique du VIH.

CALENDRIER: juillet 2020 – décembre 2020: collecte des séquences et des données cliniques; janvier 2021 – décembre 2021: analyse phylogénétique; janvier 2022- décembre 2022: séquençage UDS, analyse phylogénétique et statistique UDS; janvier 2023 – juin 2023: valorisation des résultats (soumission de résumé aux congrès, publication).

L’infection par le virus de l’hépatite B est la cause majeure de cirrhoses et de cancers primaires du foie responsables d’environ 800000 morts par an dans le Monde. Les traitements actuels reposent sur l’administration tout au long de la vie de composés antiviraux aux limitations reconnues. Un changement thérapeutique majeur est en cours dans le domaine du VHB avec le développement de nouvelles thérapies visant à la perte de l’antigène HBsAg (guérison fonctionnelle). Néanmoins, d’importantes questions demeurent quant à la meilleure façon d’administrer ces thérapies qui seront combinées avec les traitements antiviraux actuels. Cela justifie un effort concerté de Recherche taclant des questions clés relatives au virus lui-même ainsi qu’à la réponse immunitaire de l’hôte afin de surmonter les obstacles à une guérison fonctionnelle.

            Ce projet vise à une évaluation détaillée de nouveaux marqueurs viraux combinée à une analyse en profondeur des réponses immunitaires globale et spécifique au virus. Le compartiment périphérique sera étudié chez tous les patients et, lorsque cela est possible, des échantillons de foie seront interrogés. Nous identifierons ainsi des signatures virologiques et/ou immunologiques facilitant la prédiction du contrôle du virus et donc, la perte de HBsAg.

            Cette étude sera la première dans son genre à utiliser les dernières techniques, comme l’aspiration à l’aiguille fine (FNA) du foie, pour accroître notre compréhension des événements immunitaires et du réservoir viral au niveau du site infectieux. Cette recherche est primordiale pour casser les barrières à une guérison fonctionnelle and révélera définitivement le meilleur moyen d’administrer ces nouvelles thérapies anti-VHB.