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La tuberculose est une maladie infectieuse chronique causée par Mycobacterium tuberculosis responsable de 10 millions de cas de maladie active et 1,4 million de décès en 2019. Le vaccin vivant atténué BCG dérivé de M. bovis par Calmette et Guérin il y a 100 ans, représente toujours le seul vaccin antituberculeux autorisé. Cependant, alors que la vaccination des jeunes enfants par le BCG les protège efficacement, elle ne prévient pas la tuberculose pulmonaire à l’âge adulte. Le développement d’un vaccin plus puissant est donc urgemment nécessaire pour contrôler l’épidémie mondiale.

En comparant le BCG à M. bovis et M. tuberculosis, nous avons montré que la région génomique de différence 1 (RD1) est absente de toutes les souches de BCG mais qu’elle est conservée dans tous les isolats virulents de M. bovis et MTB. Les protéines codées par le segment RD1 sont impliquées dans plusieurs processus biologiques et interactions hôte-pathogène importants. Elles comprennent les antigènes immunodominants ESAT-6 et CFP-10, qui concourent à la capacité de MTB à s’échapper du phagosome en rompant la membrane phagosomale du phagocyte hôte, ainsi que les composants structurels du système de sécrétion ESAT-6 (ESX)-1 qui participent à la sécrétion de ces deux antigènes. Nous avons construit des souches de BCG recombinantes capables d’accéder au cytosol comme MTB en clonant le système de sécrétion ESX-1 de MTB ou M. marinum dans le génome du BCG. L’insertion du locus esx-1 de M. marinum dans le BCG (BCG:ESX-1Mmar) a conféré une protection plus forte par rapport au BCG chez la souris, avec une immunogénicité et une efficacité similaires au BCG:ESX-1Mtb mais avec une virulence plus faible. L’expression d’ESX-1 a entraîné une signalisation cytosolique suivant l’axe cGas/STING/TBK1/IRF-3/interféron de type I et une activité accrue de l’inflammasome AIM2 et NLRP3, ainsi que l’augmentation de la fréquence des cellules T CD4+ et CD8+ spécifiques des mycobactéries.

Le BCG est connu pour ses effets protecteurs non-spécifiques qui reposent sur l’immunité entraînée, également appelée mémoire immunitaire innée. Les monocytes et les neutrophiles entraînés présentent une réactivité accrue, y compris des fonctions anti-mycobactériennes améliorées, qui participent aux effets protecteurs du BCG.

Nous évaluerons si le BCG:ESX-1Mmar peut reprogrammer fonctionnellement et durablement les cellules myéloïdes innées, de manière similaire ou différente du BCG, sachant que l’IFN-g et l’IL-1b produits en réponse au BCG et au b-glucan (un autre stimulus d’immunité entrainée canonique), respectivement, favorisent l’immunité entraînée, alors que les IFN de type I induits par MTB au contraire l’empêchent, et que BCG :ESX-1Mmar provoque la sécrétion d’IFN-b par les monocytes in vitro, contrairement au BCG mais à un niveau inférieur par rapport au MTB, et d’IL-1b de manière similaire au MTB mais à un niveau supérieur au BCG.

Nous comparerons BCG:ESX-1Mmar et BCG pour leur capacité à entraîner des monocytes in vitro et à induire une mémoire immunitaire dans le compartiment myéloïde inné in vivo en immunisant des macaques (n=5/groupe). L’hypothèse d’une contribution de l’inflammation systémique précoce et/ou de la présence du vaccin dans la moelle osseuse, qui devraient différer entre BCG:ESX-1Mmar et BCG, à la reprogrammation de la myélopoïèse et à la modification à long terme des monocytes et neutrophiles sanguins sera testée avec une analyse de corrélation multivariée, et in vitro en utilisant un modèle cellulaire basé sur la différenciation de progéniteurs hématopoïétiques en présence de plasma d’animaux immunisés et/ou de monocytes infectés in vitro autologues.

Ce travail collaboratif implique deux équipes aux expertises complémentaires dans le domaine des interactions de MTB avec les cellules immunitaires de l’hôte, de l’immunologie des vaccins, y compris l’immunité entraînée, et des modèles primates non humains. Il devrait accélérer le développement du BCG:ESX-1Mmar en tant que vaccin en élucidant davantage ses modes d’action. Il devrait aussi contribuer à mieux comprendre les mécanismes d’induction de l’immunité entraînée en utilisant BCG:ESX-1Mmar comme outil.

Différents processus cellulaires controlant la stabilité de l’ARN peuvent avoir de effets sur la réplication virale. C’est notamment le cas du nonsense mediated mRNA decay (NMD) qui dégrade les ARN messagers présentant un codon stop dans un contexte atypique. Récemment, la caractérisation des ARN retroviraux comme des cibles potentielles du NMD nous a amené à nous demander comment ces retrovirus arrivent à contourner cette menace et comment cela peut modifier l’expression des genes cellualires : une cis-inhibition du NMD qui n’impacte que l’ARN viral et/ou une trans-inhibition du NMD qui modifie également la stabilité des ARN cellulaires. Dans le cas du VIH, l’ARN viral semble globalement protégé mais nous ne savons pas encore ce qui empeche le NMD de cibler cer ARN. De plus, il n’a jamais été demontré si l’expression du VIH peut moduler l’efficacité du NMD en trans, affectant alors les ARN cellulaires et comment cela se traduit sur les voies associées que sont le splicing alternatif et la traduction.  

Dans ce programme de recherche nous prévoyons de démontrer tout d’abord que le NMD est sensible à l’expression du virus VIH en mesurant la stabilité des ARN et les niveaux de protéines traduites dans des cellules. Pour ce faire, nous utiliserons des ARN rapporteurs sensibles au NMD que nous avons déjà largement utilisés dans le passé. Dans un second temps, nous décrirons le mécanisme d’inhibition après avoir identifié son effecteur viral.Chaque protéine d’VIH sera testée seul ou en combinaison. Des résultats préliminaires ont déjà montré que Rev peut inhiber le NMD. Sur la base de ce travail et notre connaissance de l’autre rétrovirus humain HTLV  (notamment de l’homologie entre Rev et HTLV-1 Rex), nous suspectons que l’inhibition dependante de Rev soit liée à son activité de transfert nucléo-cytoplasmique à travers son interaction avec CRM1. La caractérisation de l’effet de Rev sera aussi analysé du point de vue des facteurs du NMD : en utilisant des protéines mutantes et des drogues déjà décrites, nous pourrons definirà quelle(s) etape(s) du nmd VIH manipule. dans la troiseme partie du projet, nous voulons cribler  les arn dont la dérégulation est liée 0 l’inhibition du NMD. La caractérisation des ½ vies des ARN cellulaires srea réalisée par RNAseq dans des cellules exprimant Rev. Nous avons déjà mis au point cette procédure pour des analyses similaires avec des portéines d’HTLV-1 au laboratoire.  De ces résultats de RNAseq et en utilisant des outils de bioinformatique developpées par d’autres équipe du LBMC, nous analyserons l’impact de cette inhibition du NMD sur le splicing alternatif. Finallement nous réaliserons des ribosomes footprintings afin de corréler la dérégulation du NMD à une possible modification de l’éfficacité traductionnelle.

Des résultats préliminaires ont déjà validé Rev comme inhibiteur du NMD. Ainsi, dès le début du projet, nous pourrons commencer à travailler sur 2 axes en parallèle : la description du mécanisme d’inhibition et l’identification des cibles NMD cellulaires en RNAseq.

Les virus ont développé différentes stratégies pour prévenir la réinfection des cellules productivement infectées. Ces mécanismes d’interférence virale ont probablement pour objectif d’éviter un stress additionnel qui pourrait induire la mort des cellules qui ont survécu à une première infection. Par la délétion de chaque gène viral, ou son expression isolée, nous avons montré précédemment que la protéine virale Rev est responsable de l’interférence virale indépendante des récepteurs, qui se met en place 18-24h post-infection par le VIH.

Notre but est de déterminer les mécanismes et les facteurs impliqués dans l’interférence virale médiée par Rev. Dans le cadre d’un projet actuellement soutenu par l’ANRS (jusqu’en mars 2019) nous avons déjà identifié les fonctions de Rev nécessaires pour l’interférence et l’étape du cycle réplicatif du virus qui est ciblée. Sur la base de nos résultats et des données de la littérature, notre objectif principal est de tester l’implication des facteurs viraux et cellulaires dans l’interférence médiée par Rev. De plus, nous souhaitons valider nos résultats dans des lymphocytes T-CD4+ primaires, et modéliser l’impact de l’interférence sur la propagation de l’infection par le VIH.

La caractérisation du mécanisme d’interférence nous permettra de mieux comprendre les interactions entre le virus et la cellule cible, et d’identifier des nouvelles approches pour réduire la susceptibilité des cellules, en profitant de stratégies virales.

Objectif

Ce projet vise à développer un test moléculaire isotherme, simple et rapide, pour détecter le génome du virus de l’Hépatite Delta (VHD). Le test combinera la méthode d’amplification isotherme RPA (Recombinase Polymerase Amplification) avec la détection par CRISPR-Cas13. Les objectifs spécifiques incluent :

• l’optimisation des conditions opératoires de la RT-RPA avec des amorces T7,
• le développement d’un protocole intégrant la transcription par polymérase T7 et la détection par CRISPR-Cas13 dans une seule réaction,
• la mise au point du protocole deux étapes dans un seul tube (RT-RPA suivie de la transcription par polymérase T7 et détection par CRISPR-Cas13),
• ainsi que l’évaluation des performances analytiques du protocole de détection sur l’ARN synthétique de génotype VHD-1 et sur le standard international de l’OMS pour l’ARN du VHD.

Situation du sujet

Le VHD, identifié pour la première fois en 1977, est un virus défectif nécessitant le virus de l’hépatite B (VHB) pour se répliquer. Environ 5% des personnes atteintes d’hépatite B chronique sont co-infectées par le VHD, représentant environ 20% des porteurs de maladies hépatiques et d’hépatocarcinome. La prévalence du VHD est probablement sous-estimée en raison du manque de dépistage systématique et de tests de diagnostic disponibles. Le VHD est endémique dans de nombreux pays à revenu faible et intermédiaire, notamment en Afrique centrale, en Asie centrale, dans les îles du Pacifique et en Amérique du Sud centrale.

Problématique

La détection du VHD est complexe en raison de la grande diversité génétique du virus, qui se traduit par l’existence de huit génotypes différents. Actuellement, les méthodes de diagnostic disponibles sont souvent coûteuses et nécessitent des équipements sophistiqués. Il est donc important de développer un test moléculaire de faible coût, simple d’utilisation, spécifique et sensible, adaptable en fonction des besoins et ayant le potentiel d'être utilisé dans des environnements où l'accès au diagnostic est limité.

Méthodes

Le projet propose une méthode de détection en un seul tube, combinant plusieurs étapes. D’abord, le développement de l’amplification RT-RPA avec des amorces spécifiques incluant un promoteur T7 pour amplifier l’ARN du VHD. Ensuite, la détection par CRISPR-Cas13, utilisant des crRNA pour cibler spécifiquement l’ARN du VHD et activer la Cas13, qui clive les ARNs cibles et génère une émission de fluorescence. Enfin, l’intégration des étapes d’amplification et de détection dans un seul tube pour éviter les contaminations et simplifier le processus.

Échéancier des travaux

Le projet est divisé en quatre tâches principales. La première tâche, sur les trois premiers mois, concerne le développement de l’amplification par RT-RPA, incluant le design des amorces et l’optimisation des conditions d’amplification. La deuxième tâche, prévue pour les mois quatre à six, porte sur le développement du protocole de transcription par polymérase T7 et de détection par CRISPR-Cas13, incluant le design des ARNs guides et l’optimisation des conditions de détection. La troisième tâche, de juillet à septembre, consiste à intégrer les étapes dans un seul tube et à ajuster les paramètres pour obtenir un test sensible et spécifique. Enfin, la quatrième tâche, prévue pour les trois derniers mois, concerne l’évaluation des performances analytiques du test, incluant la sensibilité et la spécificité sur différents échantillons, y compris l’ARN synthétique de génotype VHD-1 et le standard international de l’OMS pour l’ARN du VHD.

Résultats attendus

Le développement de ce test devrait permettre une détection rapide et précise du VHD, avec une sensibilité de détection élevée (entre 10 et 100 copies/ml). Il offrirait une méthode de diagnostic accessible et adaptable à différents environnements, y compris ceux à ressources limitées, améliorant ainsi le dépistage et le suivi thérapeutique des patients atteints de VHD. De plus, cette technologie pourrait être adaptée pour détecter d’autres virus existants ou émergents.