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La latence provirale liée à la répression du LTR5′ est considérée comme un état viral silencieux. Or, il est maintenant démontré qu’en plus d’une transcription sens, le VIH-1 possède une transcription antisens et que in vitro, ces transcrits antisens répriment le LTR5′ et freinent sa réactivation. De plus, des données suggèrent que ces transcrits agissent comme des lncRNAs. Notre hypothèse est que les transcrits antisens du VIH-1 pourraient ainsi contribuer à l’établissement et/ou au maintien de la latence chez les personnes vivant avec le VIH-1 (PVVIH) mais également agir sur le lymphocyte T infecté. Dans ce cadre, notre objectif global est de caractériser l’expression in vivo et l’impact des transcrits antisens selon les objectifs spécifiques suivants:

Objectif 1: Quantification des transcrits antisens totaux chez les PVVIH Nous avons déjà valider les RT-PCR spécifiques des transcrits antisens totaux ou du transcrit sens Gag/Pol. Nous déterminerons les niveaux relatifs (RTqPCR) et nombre de copies (PCR digitale) de ces transcrits dans 2 séries de 30 PVVIH présentant une réplication virale active (encore non traités) ou une infection latente (thérapie antirétrivirale). Les valeurs seront normalisées sur le nombre de copies d’ADN total VIH ou d’ADN viral intégré. L’INSERM est promoteur de cette partie pour laquelle le Pr JP Viard (Hôtel-Dieu) est investigateur et cette étude fait l’objet d’une demande auprès du CPP qui sera soumise fin Septembre.

Objectif 2: Caractérisation des différents transcrits antisens. Nous réaliserons un séquençage pleine longueur par la technologie MinION (Oxford Nanopore Technologies), permettant d’obtenir des séquences complètes de transcrits. Pour maximiser la détection des transcrits antisens et minimiser la contamination par les transcrits sens, nous réaliserons le séquençage sur deux lignées latentes, J1.1 et ACH-2, pour lesquelles nous avons détecté une expression des transcrits antisens associée une  faible production des transcrits sens. En outre, ceci sera couplé à une étape de capture par oligonucléotides, soit des transcrits antisens totaux soit des transcrits sens totaux. Lors de l’analyse bioinformatique, les séquences retrouvées dans la capture sens seront éliminées des séquences antisens. Ceci sera réalisé en collaboration avec la plate-forme IBEN de l’ENS. Nous chercherons ensuite à détecter individuellement les transcrits antisens chez les PVVIH.

Objectif 3: Caractérisation des cibles cellulaires des transcrits antisens. Cette étude sera réalisée avec un transcrit antisens bien étudié, ASP-L, capable d’induire la répression épigénétique du LTR5’. Nous allons cloner un cDNA codant une forme non traduisible d’ASP-L dans un vecteur de transduction rétroviral ne contenant donc aucune autre séquence VIH-1 et portant un promoteur inductible permettant de contrôler le niveau de production. Le même vecteur contenant un cDNA neutre sera utilisé comme contrôle. Les transductions seront réalisées dans des lymphocytes T Jurkat et des analyses par RNAseq  (PF génom’IC de l’Institut Cochin) et protéomique (PF 3P5 de l’Institut Cochin) seront réalisées après sélection  (puro). Pour l’approche protéomique, nous utiliserons la méthode Label Free et analyserons en parallèle les extraits protéiques totaux et la fraction des protéines de surface (marquage par une biotine non-perméante+purification par billes streptavidine).Nous validerons ensuite les cibles identifiées par RTqPCR, western blot et cytometrie.

Ce projet implique deux équipes: Equipe 1 (C. Pique), avec une expertise dans l’étude des transcriptions sens et antisens des rétrovirus et qui comprend des virologues/cliniciens spécialistes du VIH et l’Equipe 2 (S. Gallois-Montbrun), experte dans la caractérisation des transcrits du VIH-1 par l’approche Nanopore. Dans l’équipe 1, deux personnes seront impliquées à 100%, une TCE INSERM statutaire et un IE bénéficiant d’un CDD Sidaction jusqu’en Mars 2023 dont le renouvellement sera demandé en 2022. De plus, nous travaillerons avec des plates-formes et bénéficierons de l’expertise du groupe de Véronique Avettand-Fénöèl dans l’analyse de la transcription du VIH chez les PVVIH.

En plus des éléments cis-régulateurs localisés dans la longue répétition terminale 5’ (LTR 5’) du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), notre laboratoire a identifié une importante région cis-régulatrice intragénique (IRR), présentant une activité enhancer sur le promoteur viral localisé dans le LTR5’. A l’origine identifiée comme étant associée à une région chromatinienne ouverte dans un contexte myéloïde uniquement, nos résultats récents ont montré que l’IRR était également critique pour médier la transcription et la réplication du VIH-1 dans des lymphocytes T infectés, démontrant l’importance d’étudier le rôle fonctionnel de l’IRR dans les deux contextes cellulaires d’infection par le VIH-1. De manière intéressante, nous avons identifié dans l’IRR trois sites de liaison pour le facteur de transcription myeloïde-spécifique PU.1. Le présent projet de recherche vise à comprendre plus avant les mécanismes moléculaires régulant la transcription et la latence du VIH-1 dans les deux cibles cellulaires majeures de l’infection, en étudiant le rôle joué par l’IRR sur l’activité promotrice du LTR5’. Dans la première partie du projet, nous étudierons le rôle du facteur de transcription myeloïde-specifique PU.1 dans la régulation transcriptionnelle et épigénétique du VIH-1 dans un modèle d’infection hautement physiologique, en réalisant des expériences d’infection de macrophages primaires dérivés de monocytes (MdMs) avec des particules virales contenant le génome viral du VIH-1 sauvage ou muté au niveau des sites intragéniques de liaison pour le facteur PU.1. Ensuite, afin de caractériser davantage le rôle fonctionnel de PU.1 dans la transcription et la réplication du VIH-1, nous inhiberons la liaison de PU.1 par une approche pharmacologique en utilisant un composé appelé diamidine hétérocyclique DB2115, connu pour inhiber sélectivement la liaison de PU.1 à ses sites cibles. Dans la seconde partie du projet, nous étudierons le rôle du facteur nucléaire T-spécifique se liant aux PU-boxes de l’IRR dans un contexte d’infection T-lymphocytaire. Nous étudierons le rôle de ce facteur dans la régulation transcriptionnelle et épigénétique du VIH-1 afin de démontrer les fonctions critiques jouées par l’IRR dans les deux contextes cellulaires majeurs d’infection par le VIH-1. Dans la dernière partie du projet, étant donné que la régulation transcriptionnelle du VIH-1 est un mécanisme multifactoriel complexe, comprenant de multiples niveaux de contrôle dont la structure tri-dimensionnelle (3D) de la chromatine, nous étudierons le rôle de protéines architecturales sur la régulation de la structure chromatinienne 3D des cellules infectées par le VIH-1. Plus précisément, dans l’IRR mais également le long du provirus VIH-1, nous avons identifié des sites de liaison pour CTCF et YY1, deux protéines architecturales impliquées dans la formation de boucles chromatiniennes. De plus, notre laboratoire a acquis une expertise importante dans la caractérisation des boucles chromatiniennes médiées par CTCF en étudiant d’autres rétrovirus dont le BLV et le HTLV-1. Afin d’étudier si le provirus du VIH-1 est capable de modifier l’organisation 3D de la chromatine dans les cellules infectées, nous étudierons le recrutement in vivo de CTCF et YY1 le long du provirus VIH-1 ainsi que leurs potentielles interactions 3D, par des expériences de 4C-seq. Par des expériences de CRISPR/Cas9, nous muterons ensuite les différents sites de liaison viraux pour CTCF et YY1 afin d’abolir la formation des boucles chromatiniennes et de caractériser le rôle fonctionnel de ces facteurs dans la latence virale et sur le transcriptome de la cellule infectée. Cette partie du projet de recherche contribuera à une meilleure compréhension des interactions 3D entre le provirus VIH-1 et son environnement génomique. En conclusion, notre projet de recherche permettra une connaissance plus approfondie des mécanismes moléculaires associés à la transcription et à la persistance du VIH-1 dans les deux réservoirs cellulaires majeurs du VIH-1 latent, ainsi que de nouvelles options thérapeutiques innovantes visant à contrôler l’infection virale.