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Objectifs
Ce projet vise à développer et valider une plateforme d’étude immunologique cutanée à partir d’explants de peau humaine, dans le contexte de l’infection par Treponema pallidum subsp. pallidum (TPA), agent de la syphilis. Les cellules immunitaires cutanées seront identifiées et isolées par cytométrie en flux, puis caractérisées par séquençage d’ARN à l’échelle unicellulaire (scRNA-seq). Cette approche permettra d’identifier de façon exhaustive les sous-populations impliquées et de définir les programmes transcriptionnels activés, en particulier au sein des cellules dendritiques (DC), acteurs clés de l’initiation de la réponse adaptative. À terme, cette plateforme constituera un outil innovant pour décrypter les mécanismes d’activation locale et tester des candidats vaccinaux capables d’induire une immunité cellulaire protectrice, en alternative aux modèles animaux lourds tels que le lapin.

Situation du sujet et problématique

La syphilis demeure un enjeu majeur de santé publique mondiale, avec environ 6 millions de nouveaux cas par an et une recrudescence marquée dans les pays industrialisés, notamment chez les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes et les personnes vivant avec le VIH. Malgré l’efficacité de la pénicilline G, l’incidence reste élevée et la syphilis congénitale constitue une cause évitable de morbi-mortalité fœtale. Les lésions précoces sont caractérisées par un infiltrat riche en macrophages, lymphocytes T CD4+ Th1 et DC, associé à une production de cytokines pro-inflammatoires. Toutefois, cette réponse ne prévient ni la dissémination systémique ni les réinfections, suggérant une activation incomplète ou inadaptée de l’immunité. Les mécanismes d’échappement immunitaire de TPA, incluant la variation antigénique et l’induction de voies immunorégulatrices, sont encore mal compris. En particulier, le rôle des DC cutanées dans la capture antigénique, leur maturation et leur capacité à initier une réponse T mémoire protectrice restent insuffisamment caractérisés. Or, la peau abrite un réseau immunitaire spécialisé (cellules de Langerhans et DC dermiques) dont l’activation conditionne la qualité de la réponse adaptative. Nous faisons l’hypothèse qu’une activation inadéquate des DC par TPA conduit à une réponse mémoire inefficace, favorisant la persistance bactérienne et les réinfections. Le développement d’un modèle ex vivo humain constitue une opportunité unique pour analyser ces événements précoces dans un contexte physiologique pertinent.

Méthodes
Des explants de peau humaine issus d’abdominoplasties seront stimulés pendant 24 h par deux souches de TPA (Nichols et SS14), cultivées en micro-anaérobiose sur cellules épithéliales Sfe1Ep. Les contrôles incluront LPS, peptidoglycane et Poly(I:C). Les cellules immunitaires migrantes seront récupérées puis analysées par cytométrie en flux. Le profil cytokinique sera déterminé par ELISA multiplex. Pour caractériser l’hétérogénéité cellulaire, les cellules immunes cutanées CD45+ seront triées et analysées par scRNA-seq (technologie 10x Genomics). Les gènes d’intérêt seront validés par qRT-PCR et cytométrie. Enfin, pour déterminer si les DC activées par TPA induisent une réponse adaptative efficace ou dysfonctionnelle une validation fonctionnelle sera réalisée par culture lymphocytaire mixte. La prolifération, le phénotype d’activation et la production de cytokines seront évalués.

Ce projet établira une plateforme translationnelle innovante pour comprendre l’immunité cutanée anti-TPA et identifier des cibles pertinentes pour le développement vaccinal.

Echéancier des travaux : Durée du projet 1 an.

Résultats attendus :

• Détermination du profil d’activation des DC par TPA (cDC1, cDC2, pDC, Langherans) et comparaison avec les stimuli contrôles (LPS, PGN, Poly(I:C).
• Caractérisation fine de l’ensemble des sous populations cellulaires activées lors du contact avec TPA.
• Mise en évidence de l’expression des gènes impliqués lors de la reconnaissance de TPA.

La tuberculose (TB), causée par la bactérie Mycobacterium tuberculosis (Mtb), reste l’une des maladies infectieuses les plus meurtrières au monde. TB est responsable de 1.6 million de décès par an au niveau mondial. Cette situation est aggravée par l’augmentation constante et alarmante du nombre de cas de tuberculose multi- et ultra-résistante, avec près d’un demi-million de cas de ce type en 2021 selon le rapport de l’OMS (Global Tuberculosis report 2022). La force de Mtb réside dans sa capacité à survivre dans un état dormant dans les macrophages et dans les granulomes de l’hôte, puis à se réactiver dans des conditions favorables. Dans cet état dormant, la plupart des fonctions biologiques de Mtb sont ralenties, expliquant en partie la perte d’efficacité des antibiotiques. Dans ce contexte, il est urgent d’identifier de nouvelles cibles, pertinentes dans les états actif et dormant de Mtb, pour le développement de nouveaux traitements contre la TB. Les protéines contenant des centres fer-soufre (Fe-S), protéines essentielles dans divers processus biologiques (régulation de la transcription, réparation de l’ADN, métabolisme central, bioénergétique, synthèse de cofacteurs,…), constituent une famille de cibles attrayante. Le génome de Mtb contient environ 60 cadres de lecture ouverts codant pour des protéines Fe-S putatives, ayant des fonctions importantes dans les états actif et dormant de Mtb. Parmi ces protéines, les protéines WhiB utilisent leur centre Fe-S comme senseur redox pour détecter les signaux de stress rencontrés au cours de l’infection et ajustent le métabolisme de Mtb pour survivre aux conditions difficiles dans les macrophages et les granulomes, permettant de rentrer en dormance. Un moyen intéressant de cibler toutes les protéines Fe-S de Mtb en même temps serait de cibler la voie responsable de la biogenèse des centres Fe-S chez Mtb. En général, les bactéries ont plusieurs systèmes de biogenèse des centres Fe-S (ISC, SUF et/ou NIF). De façon intéressante Mtb a un seul système, le système SUF. Ce système est absent chez l’homme, où l’assemblage des centres Fe-S est réalisé par d’autres machineries. Le système SUF de Mtb est essentiel à la croissance in vitro de Mtb dans des conditions normales et a été montré comme étant un point de vulnérabilité de Mtb. De plus, le système SUF est induit dans des conditions de carence en fer, situation rencontrée par le pathogène lors de l’infection. De même, le système SUF de Mtb est régulé à la hausse dans des conditions de stress nitrosant et oxydant, facteurs de stress de la réponse immunitaire innée. Collectivement, ces données soulignent l’importance de la biogenèse et du métabolisme des centres Fe-S pour le cycle de vie de Mtb et renforcent l’hypothèse selon laquelle cibler le métabolisme des centres Fe-S dans Mtb via le système de leur biogenèse (SUF) est pertinent pour le développement de nouveaux médicaments anti-TB. Cibler le système SUF par des inhibiteurs aura d’abord un effet pléiotropique sur la capacité de Mtb à synthétiser les 60 protéines à centre Fe-S. Ensuite, cette approche désarmera Mtb en altérant sa capacité à synthétiser des centres Fe-S pour détecter les signaux de stress environnementaux, via les protéines WhiB. L’inactivation de WhiB empêchera la bactérie de s’adapter pour entrer en dormance. Le projet “FeSMtb” propose d’explorer la faisabilité d’utiliser la voie SUF de Mtb comme cible pour lutter contre la tuberculose. A cette fin, une partie du projet “FeSMtb” consistera à valider le caractère essentiel du système SUF dans la pathogénicité de Mtb. Une autre partie sera dédiée à la caractérisation structurale et fonctionnelle des protéines SUF. Une troisième partie se focalisera sur l’identification d’inhibiteurs du système SUF de Mtb, par le biais d’une approche de criblage sur cellules entières de mycobactéries ; inhibiteurs qui serviront de bases pour le développement futur de médicaments. Le projet sera réalisé en utilisant une combinaison d’approches expérimentales comprenant la génétique et la physiologie des mycobactéries, la biochimie, la spectroscopie, la biologie structurale, les modèles in vitro et in vivo de l’infection par Mtb.

L’utilisation des thérapies antirétrovirales (cART) est très efficace pour supprimer la réplication du VIH-1. Cependant, l’infection par le VIH ne peut pas être éradiquée car le virus persiste dans les réservoirs cellulaires, tels que les cellules CD4+T infectées de manière latente, contenant des provirus silencieux mais capables de transcription. Ces provirus latents ont la capacité de se réactiver lors de l’interruption des traitements, entraînant un rebond rapide de l’infection. Le développement de nouveaux agents thérapeutiques ciblant les cellules infectées de manière latente est donc crucial dans la course à la guérison de l’infection par le VIH-1.

La latence est un processus multifactoriel contrôlé par l’état de la chromatine au site d’intégration ainsi que par la disponibilité des facteurs transcriptionnels et post-transcriptionnels. L’une des étapes majeures contrôlant la modulation du provirus VIH-1 est la pause-redémarrage de l’ARN Polymérase II (ARNPII) dans la région proximale du site d’initiation de la transcription. Un blocage du redémarrage de l’ARNPII après la pause peut entraîner une terminaison prématurée de la transcription.

Nous décrivons ici deux activateurs transcriptionnels, SPT6 et BRD4, comme étant des répresseurs de l’expression du VIH-1. SPT6 est un facteur d’élongation de la transcription qui a été récemment décrit pour contrôler la terminaison de la transcription des gènes cellulaires. De même, BRD4 qui est une protéine connue pour interagir avec les régulateurs transcriptionnels et se lier aux promoteurs et enhancers actifs. Paradoxalement, ces deux facteurs exercent des rôles répressifs sur l’expression du VIH-1. Des études récentes ont montré que BRD4 recrutait des facteurs d’élongation, notamment SPT6 et la machinerie de terminaison en 3’ des ARNm, lors d’un point de contrôle de l’ARNPII. De fait, ce mécanisme moléculaire pourrait expliquer nos observations récentes sur le rôle de SPT6 et du complexe CPA dans la répression de la transcription du VIH dans les cellules latentes.

Nos données préliminaires confirment que SPT6 interagit avec BRD4 et la sous-unité catalytique du complexe de clivage et de polyadénylation (CPA) et inhibe l’expression du VIH dépendamment du signal de polyadénylation présent dans le 5’LTR. Nous montrons également que l’inhibition de ce complexe réactive de manière significative l’expression du VIH dans plusieurs modèles de latence. Ainsi, notre hypothèse est que dans les cellules infectées de manière latente, BRD4 et SPT6 s’associent à l’ARNPII en pause au niveau du 5’LTR et recrutent le complexe CPA pour induire la terminaison prématurée de la transcription du VIH. Ce mécanisme pourrait être directement ciblé par dBet6, un dégradeur rapide et spécifique de BRD4, pour induire la réactivation de l’expression du VIH.

Dans ce projet, nous utiliserons une combinaison d’approches biochimiques et moléculaires pour valider et caractériser le complexe SPT6-BRD4-CPA. Nous étudierons les mécanismes de recrutement de ces protéines au provirus. De plus, nous étudierons le rôle de ce complexe dans l’établissement de la latence du VIH-1 dans les lymphocytes T CD4+ humains primaires. Ce modèle de latence sera également utilisé pour déterminer si la terminaison prématurée de la transcription du VIH-1 nécessite la présence de SPT6 et de BRD4. Surtout, nous évaluerons le potentiel de dBet6 seul, ou en combinaison avec d’autres agents de réversion de la latence (LRA), sur la réactivation du VIH-1. Nous évaluerons l’effet de ces combinaisons dans des lignées cellulaires infectées par le VIH-1 et des modèles de cellules primaires d’origine lymphoïde T et myéloïde. Enfin, nous analyserons l’effet des combinaisons les plus prometteuses sur la réactivation de l’expression virale dans des cultures ex vivo de PBMC déplétées en CD8+ isolées du sang de patients VIH+ sous cART.

Notre projet révèle un nouveau mécanisme moléculaire impliqué dans la latence du VIH-1 et vise à fournir une preuve de concept selon laquelle la perturbation de la terminaison prématurée de la transcription pourrait conduire à la réactivation de provirus latents dans les stratégies de guérison du VIH.

Les adolescents vivants avec le VIH (AdVIH) ont un taux d’échec thérapeutique particulièrement élevé, notamment en Afrique de l’Ouest et du Centre (AOC) où ils sont les seuls dont la mortalité n’a pas diminué drastiquement ces dernières années. Le développement de l’association cabotégravir/rilpivirine (CAB/RPV) à longue durée d’action (LDA), administrable toutes les 4 ou 8 semaines, laisse espérer un progrès thérapeutique significatif, au moins pour certains AdVIH (pas d’obligation de prise quotidienne de traitements, respect de la confidentialité, supervision du traitement par un professionnel de santé permettant une amélioration de l’observance thérapeutique,…)
L’essai clinique de phase 1/2 MOCHA évalue actuellement l’efficacité et la tolérance de la bithérapie CAB/RPV chez les adolescents de 12-17 ans. Cependant, dans chaque région où ce traitement pourrait être envisagé, il est primordial d’évaluer au préalable sa faisabilité d’implémentation en fonction des caractéristiques des patients suivis, de l’organisation du système de soins et de l’acceptation (théorique) par les patients et les soignants.
L’étude CABRILADO vise à définir la place, la faisabilité d’implémentation et l’acceptabilité potentielle d’un traitement injectable par CAB/RPV dans le contexte spécifique des AdVIH de 12-17 ans suivis dans 7 centres de 5 pays du réseau Enfants-VIH-Afrique (EVA): Sénégal, Mali, Cameroun, Côte d’Ivoire et Burkina Faso. C’est la première étude pédiatrique de ce type en AOC.
Elle sera proposée à tous les adolescents de 12-17 ans suivis dans ces centres et informés de leur séropositivité pour le VIH-1 (n=883) et nécessitera 1 visite et une prise de sang (couplée avec la mesure annuelle de la charge virale). Quatre aspects complémentaires seront évalués :
– WP clinique : proportion d’adolescents présentant une contre-indication médicale à l’association CAB/RPV (infection par le VHB, co-médications à risque d’interactions médicamenteuses…)
– WP virologique : proportion d’adolescents présentant une contre-indication virologique à ce traitement (virus de sous-type A1/A6, résistance au CAB et/ou à la RPV par séquençage « classique » sur ARN (si virémie ≥1000 copies/ml) ou ADN (si virémie <1000 copies/ml) (incluant une sous-étude virologique visant à identifier des mutations de résistance par séquençage à haut débit, réalisée chez 80 adolescents chez qui le génotype de résistance « classique » n’a pas retrouvé de mutations de résistance à la RPV)). Par ailleurs, l’étude visera à évaluer si les adolescents ayant une contre-indication
virologique peuvent être identifiés sans nécessiter au préalable un génotype de résistance (à partir de leur région de suivi, leurs antécédents et l’évaluation actuelle de leur charge virale), ce qui permettrait de faciliter l’implémentation d’une bithérapie par CAB/RPV dans les régions où les génotypes de résistance sont difficiles d’accès

– WP « Organisation des services » (par entretiens directifs avec les acteurs clés de l’approvisionnement et les responsables de la dispensation des centres) : identification des enjeux, contraintes et conditions de mise en oeuvre pratique des injectables (logistiques – financement, approvisionnement, conservation- organisation des soins, prise en charge, formation des professionnels, etc).

– WP « Acceptabilité » auprès des adolescents, leurs parents/tuteurs et les soignants (étude quantitative par questionnaire dans tous les sites de cette étude + étude qualitative à Dakar et Abidjan par entretiens semi-directifs auprès d’un sous-échantillon d’adolescents, de parents/tuteurs et de professionnels de santé + 2 ateliers participatifs d’une journée) : exploration du niveau et des conditions d’acceptabilité des adolescents, des parents/tuteurs et des soignants du traitement ARV injectable à LDA, ainsi que des facteurs associés à ce niveau d’acceptabilité.

L’étude CABRILADO permettra ainsi de définir la place éventuelle des ARV injectables chez les adolescents vivant en AOC et les défis à leur implémentation.