Winning projects and candidates

Selon les données épidémiologiques de l’UNAIDS, plus de 50 millions de personnes sont actuellement infectées par le VIH. L’arsenal thérapeutique actuel ne permet pas l’éradication finale de la maladie et provoque également des effets secondaires graves. La recherche de nouvelles molécules antivirales reste donc très importante tant du point de vue économique que sociétal.
Les G-quadruplexes (ou “G4”) sont des structures d’acide nucléique composées de quatre brins. Ces conformations inhabituelles ont longtemps été considérées comme de simples curiosités. Cependant, l’intérêt pour les G4 est en plein essor et plusieurs publications récentes dans des revues prestigieuses démontrent leur implication dans des processus biologiques clés.
Grâce au soutien de l’ANRS, nous commençons à déchiffrer le lien existant entre la formation des structures G4 et le cycle de réplication du VIH-1. L’utilisation de sondes G4 spécifiques nous a permis de démontrer qu’une structure G4 est formée dans la région U3 au cours du processus de transcription inverse. La liaison de ces sondes chimiques au G4 de l’U3 inhibe le processus. Ces effets inhibiteurs pourraient ouvrir la voie à des voies thérapeutiques anti-VIH sans précédent construites autour de ces G4 viraux. Nous voulons d’abord savoir comment les ligands de la porphyrine interagissent avec l’U3G4. Nous voulons fournir aux chimistes des données structurelles précises leur permettant d’améliorer les propriétés des ligands.

Comprendre comment le VIH-1 est transmis et s’établissent les premières étapes d’une infection chez le nouvel hôte est crucial à des fins thérapeutiques. Les analyses génotypiques de virus isolés au stade de la primo-infection (PHI) et de virus transmis/fondateurs (T/F) ont montré que la transmission de VIH-1 est généralement le fait d’un seul variant. Il n’est cependant pas clair s’il est transmis aléatoirement ou sélectionné, et dans ce cas quelles propriétés lui ont permis d’être transmis et de s’installer chez le nouvel hôte. Dans 95 % des cas, les virus T/F et ceux de la PHI ont un tropisme R5. Il a été proposé qu’ils présentent un avantage sélectif et/ou que les virus utilisant CXCR4 comme corécepteur (virus X4 ou R5X4) sont contre-sélectionnés au moment de la transmission. La forte prévalence des virus R5 dans les premiers stades de l’infection, et implicitement l’idée que les virus X4/R5X4 ne sont probablement pas « équipés » pour être transmis, ont conduit à ne considérer que des virus R5 dans les études sur les propriétés des virus transmis. En fait, même si un certain degré de contre-sélection des virus utilisant CXCR4 a pu être rapporté (notamment des virus X4 dans le contexte d’une transmission par voie sexuelle), la littérature montre que la faible fréquence de la transmission des virus X4/R5X4 est en premier lieu le fait que leur proportion chez les individus VIH+ est faible. Des faits de transmission de virus X4/R5X4 ont en fait été rapportés, notamment quand la proportion de ces virus chez le donneur est élevée. Le suivi longitudinal de patients chez lesquels des virus X4/R5X4 ont été identifiés au stade de la PHI suggèrent aussi que ceux-ci sont compétents pour accomplir les premières étapes de l’établissement d’une infection. Ces données suggèrent donc que les virus X4/R5X4 sont transmissibles, bien que jusqu’à quel point ils le sont comparativement aux virus R5 reste incertain. Il n’est pas non plus connu si les propriétés des virus X4/R5X4 présents chez les individus nouvellement infectés diffèrent de celles des virus chroniques et dans quelle mesure elles ont contribué à installer l’infection. Enfin on ne sait pas si ces propriétés s’apparentent à celles des virus R5 T/F ou isolés lors de la PHI.

     Pour répondre à ces questions, et mieux comprendre la transmission et l’établissement d’une nouvelle infection chez l’hôte, nous étudierons des virus X4 ou R5X4 isolés du plasma d’individidus diagnostiqués au stade de la PHI, comparativement à des virus R5 du même stade ou T/F et des virus chroniques. Nous contrôlerons le relation monophylétique et la diversité restreinte des séquences d’Envs dans ces plasmas afin de déduire qu’elles ont pour origine un variant unique. Nous étudierons l’hypothèse que les virus X4/R5X4 de la PHI sont pourvus de propriétés ayant pu favoriser leur installation chez le nouvel hôte. Quatre objectifs secondaires seront poursuivis à cette fin : i/ Nous étudierons si les virus X4/R5X4 de la PHI se distinguent par la manière dont ils utilisent CD4, CCR5 et CXCR4 et leur degré de dépendance à l’expression de ces récepteurs pour l’entrée virale. Des simulations de dynamique moléculaire permettront d’obtenir une description à l’échelle atomique des interactions Env/corécepteurs. ii/ Nous étudierons si ces propriétés d’interaction avec les récepteurs s’accompagnent d’un tropisme accru pour les cellules résidentes des sites de transmission et de dissémination des virus, i.e. lymphocytes T CD4, cellules dendritiques et macrophages et iii/ résultent de modifications de propriétés structurales des Envs (séquence, conformation). Des tests de neutralization des virus par des anticorps seront réalisés à cette fin. iv/ Nous étudierons enfin si l’installation de ces virus chez l’hôte s’est faite à la faveur de leur résistance aux interférons de type I (IFN-I) et/ou, comme cela a été montré pour d’autres ligands de CXCR4, de la capacité des Envs X4/R5X4 à réprimer leur production dans les cellules dendritiques plasmacytoides. Cette étude novatrice sur des virus encore trop peu étudiés devrait enrichir notre connaissance de l’établissement de l’infection VIH et des moyens de la prévenir.

Les hépatites virales (A à E) sont des problèmes de santé majeurs dans le monde, entraînant plus d’un million de décès chaque année, dont environ 80 % sont causés par le virus de l’hépatite B (VH). Le virus, responsable de l’infection et de ses complications, doit détourner la machinerie cellulaire de l’hôte pour pénétrer dans les hépatocytes, répliquer son génome et libérer de nouveaux virions à partir des cellules infectées. Pour réaliser les processus biologiques nécessaires au cycle de vie viral, les protéines virales doivent acquérir leur structure tridimensionnelle pour accomplir leurs fonctions, y compris les interactions avec d’autres protéines virales et cellulaires. Les progrès considérables et récents de l’intelligence artificielle (IA) pour les prédictions de la structure tridimensionnelle (3D) des protéines et des complexes protéine-protéine à partir de la séquence, avec une qualité proche de celle de la détermination expérimentale, offrent un aperçu des mécanismes moléculaires des protéines et aideront concevoir de nouveaux vaccins et médicaments pour lutter contre les agents pathogènes. Dans ce projet, des algorithmes d’apprentissage profond pour la prédiction de la structure 3D de protéines seront utilisés pour acquérir des connaissances sur les structures tertiaires et quaternaires (complexes) des protéines du VHB. Cela permettra d’aborder des questions allant de l’amélioration du rationnel des expériences de biologie moléculaire ou de biophysique, l’élucidation des mécanismes d’action, à la conception de nouvelles thérapies ciblant le virus. Le projet poursuit deux objectifs principaux. Premièrement, évaluer la version la plus récente des algorithmes et optimiser leurs paramètres dans le contexte des protéines du VHB et de leurs complexes avec les protéines humaines. Deuxièmement, générer un réseau d’interaction entre protéines humaines et du VHB structurellement résolu, avec les modèles prédits avec une haute confiance mis à librement à la disposition de la communauté via le site Web de la base de connaissances du VHB (HBVdb; https://hbvdb.lyon.inserm.fr).

Les protéines d’enveloppes du VHB sont indispensables à l’assemblage des virions infectieux contenant le génome viral (virions-ADN). Cependant, la quantité de ces virons est inférieur de 3 à 5 log à la quantité des particules sous virales (PSV) constituées des seules protéines d’enveloppes L, M et S portant l’antigène VHB de surface (AgHBs). D’autres particules sous virales correspondant à des virions vides enveloppés circulent à une concentration 100 fois plus élevées que les virions-ADN. Enfin, certaines études ont documenté la présence dans le sérum de porteurs chronique de capsides virales nues. La faible quantité de virions ADN d’une part et la taille de ces particules produites de 20 à 40 nm rendent très difficile la description de la morphogenèse des virions-ADN du VHB par les méthodes conventionnelles d’observation par microscopie dans les cellules permissives. L’objectif de ce projet est donc de décrire l’assemblage du VHB en identifiant chacun des constituants viraux afin de distinguer la formation des virons-ADN de celle des autres particules virales et de suivre leurs trafics intracellulaires respectifs. Nous avons récemment caractérisé l’assemblage des protéines core (C) en capside et l’interaction entre les protéines L et C. Nos observations par microscopie électronique montrent que L se concentre dans des régions riches en membranes cellulaires dans lesquelles sont condensées un grand nombre de capsides vides. Nous proposons de poursuivre ce travail 1- en définissant le domaine cellulaire dans lequel les amas de L s’accumulent et en suivant l’effet de S sur cette localisation, 2- en caractérisant l’interaction et la localisation cellulaire des protéines L, C et S et, 3- en comparant l’assemblage et le trafic des virions vides et virions-ADN. Ce travail sera réalisé grâce à des plasmides qui expriment, dans des cellules hépatocytaires, de manière séquentielle ou combinée, l’ensemble des acteurs viraux impliqués dans l’assemblage des virions (protéines L, S et C en présence ou en absence du l’ADN viral). En plus des méthodes de biochimie et de microscopie optique, la seule méthode ayant une résolution nanométrique est la microscopie électronique qui, grâce à l’expertise du laboratoire, permettra sans ambigüité d’imager et d’identifier les différents types particules virales. Ces approches expérimentales seront étendues à l’étude de l’assemblage du HDV et les résultats obtenus trouveront une application directe dans la description du mécanisme d’action des inhibiteurs du VHB.

Il y a environ 240 millions de porteurs chroniques du VHB dans le monde. Parmi ceux-ci, 15 à 20 millions sont co-infectés par le VHD. La surinfection des porteurs du VHB par le VHD entraîne une co-infection chronique en 90% des cas et est associée à une progression de la maladie plus grave et plus rapide et à un risque accru de CHC par rapport aux porteurs VHB. Ni les analogues nucléosidiques actuellement utilisés contre le VHB ni les thérapies à base d’interféron pégylé-alpha ne sont vraiment efficaces dans le contexte des co-infections VHB / VHD .
 Notre compréhension actuelle du cycle de vie du VHD et de son impact pathologique est très limitée et basée sur des systèmes d’expression artificielle des protéines virales. Nous utiliserons un système réplicatif de super-infection par le VHB / VHD, où nous comparerons les cultures infectées par des hépatocytes primaires infectés par le VHB, le VHD et les hépatocytes primaires super-infectés par le VHB / VHD. Nous étudierons l’empreinte métabolique du VHD. Des résultats préliminaires de notre laboratoire montrent qu’un « rewiring » des flux métaboliques vers le cycle de Krebs joue un rôle important dans l’infection par le HDV. Nos objectifs sont dans le contexte du système de surinfection VHB / VHD d’ analyser l’empreinte métabolique du HDV sur le métabolisme central du carbone par RMN et approches biochimiques conventionnelles et d’étudier la dépendance du HDV à ces changements métaboliques.

Une meilleure compréhension des réponses de la cellule hôte au HDV dans le contexte des surinfections HBV / HDV est nécessaire pour mieux comprendre la physiopathologie associée et pour développer des thérapies efficaces.

Aujourd’hui, les personnes vivant avec le VIH sous traitement antirétroviral efficace ont une espérance de vie proche des personnes non infectées par le virus. En France, 4% des PVVIH sont âgés de 70 ans et plus et cette proportion va augmenter dans les décennies à venir. Cependant les comorbidités associées à l’âge, en particulier les maladies cardiovasculaires, l’ostéoporose, les troubles métaboliques, hépatiques, rénaux, fractures osseuses et certains cancers sont plus fréquentes dans un contexte d’exposition au VIH, d’immunodépression, d’exposition prolongée à certains ARV, de polymédications et de mode de vie à risque plus importants. Dès lors, une approche de prise en charge globale présente l’intérêt de pouvoir réduire l’apparition d’évènements de santé péjoratifs et la perte d’autonomie chez les personnes âgées vivant avec le VIH. Le dépistage de la fragilité, syndrome gériatrique caractérisé par une perte des réserves physiologiques où la personne perd ses capacités d’adaptation au stress permettrait de détecter précocement les sujets à risque et de construire des programmes d’interventions de santé du fait de la réversibilité de cet état.

C’est dans ce contexte que s’est inscrite l’étude ANRS EP66 SEPTAVIH, étude prospective, multicentrique, nationale dont l’objectif initial était d’évaluer la prévalence de la fragilité chez les PVVIH âgés de 70 ans et plus et d’étudier la faisabilité du dépistage via différents outils d’évaluation. Cette étude démarrée en mai 2019 a recruté 512 patients dans les 16 centres participants et prévoit un suivi sur 12 mois. Les données recueillies vont permettre d’identifier les facteurs de risque associés à la survenue d’évènements péjoratifs de santé à court terme comme les chutes graves, la diminution des capacités fonctionnelles, le recours aux soins non programmés et les institutionnalisations.

Nous souhaitons désormais proposer aux sujets inclus dans SEPTAVIH un suivi sur 5 ans. L’organisation d’un suivi long terme d’une population de PVVIH gériatrique en France nous permettra de disposer de suffisamment d’éléments pour identifier le ou les critères de fragilité les plus discriminants chez cette population émergente, ceci avec un rapport coût/efficacité favorable puisque l’évaluation initiale des PVVIH âgés a été très exhaustive, les patients se prêtent volontiers à l’évaluation et les équipes sont maintenant aguerries à l’évaluation des sujets âgés. Cela laisse présager d’un faible nombre de perdus de vue et d’une excellente qualité des données de suivi.  

Le suivi SEPTAVIH Long terme comprendra 1 visite par an pour un suivi total de 5 ans, correspondant aux visites annuelles de suivi de l’infection VIH. Ces visites seront complétées par une évaluation gériatrique simplifiée réalisée dans le service d’infectiologie.

Cette évaluation long terme contribuera ainsi à disposer de connaissances supplémentaires pour adapter les recommandations de prise en charge dans cette population particulière de PVVIH gériatriques. Elle permettra également de servir de base à la construction d’essais pragmatiques d’évaluation d’interventions ciblées pour prévenir/ralentir la perte d’autonomie dans cette population comme cela peut être observée en population générale.

La communication au niveau des cellules immunitaires s'effectue au niveau de contacts étroit appelés synapses immune (IS). Ces IS sont essentiels pour la réponse de l'hôte aux agents pathogènes, mais sont détournés par ces derniers à leur propre profit. Ainsi, le VIH-1 détourne des composants de ces IS pour former des jonctions spécifique, appelées synapses virologiques (VS), par lesquelles le virus peut se propager d’une cellule à l’autre. Malgré de multiples études, leur formation et fonctionnement ne sont pas encore totalement compris. Cependant, il apparait clairement dans la littérature que le trafic vésiculaire joue un rôle central dans l’assemblage et les fonctions des VS. Ces dernières années, plusieurs études ont souligné le rôle potentiel de la protéine ATG9A en tant que régulateur général du trafic vésiculaire. ATG9A est présent au sein de vésicules, appelées ci-après « vésicules ATG9A ». Le rôle principal de ces vésicules a été principalement documenté dans le contexte de l’autophagie, où elles « alimentent » en protéines et lipides la membrane des autophagosomes en formation. A côté de ce rôle dans l'autophagie, ATG9A est impliqué dans des processus non liés à l'autophagie. Plusieurs études ont mis en évidence la présence de vésicules ATG9A au niveau du site présynaptiques des neurones, avec un rôle potentiel dans le renouvellement de la membrane synaptique.

Dans ce projet, nous émettons l'hypothèse que grâce à sa capacité à interagir avec les membranes, les vésicules ATG9A participent à la formation et l'efficacité des synapses virologiques de par leur capacité intrinsèque à faciliter la délivrance de protéines ou la distribution de lipides au sein de membranes.

Notre objectif est de découvrir de nouveaux facteurs et mécanismes impliqués dans la propagation virale.

Le premier objectif est de définir le rôle des vésicules ATG9A sur la transmission du VIH-1 médiée par les VS. En utilisant la microscopie confocale et de super résolution, nous caractériserons le recrutement de ATG9A à la VS et déterminerons si ces vésicules ATG9A sont essentielles à son architecture et efficacité. Cette analyse permettra de déterminer le rôle d'un sous-ensemble spécifique de vésicules dans l'organisation et la fonction des VS.

Le deuxième objectif est d'étudier les voies cellulaires impliquant les vésicules ATG9A et leur influence sur la transmission du VIH-1. Nous utiliserons une approche d'inhibition spécifique de ces voies, combiné à la microscopie confocale et la cytométrie de flux quantitative, pour les perturber sélectivement et évaluer leur impact sur la transmission du VIH-1. Cette approche nous permettra de dissocier les fonctions spécifiques au VIH-1 des vésicules ATG9A de leurs rôles cellulaires plus généraux et comprendre pleinement comment le virus exploite cette protéine pour sa transmission.

Le troisième objectif est de mieux comprendre le mécanisme moléculaire par lequel ces vésicules ATG9A influencent la VS en caractérisant les protéines et les lipides associés à ces vésicules lors de la transmission du VIH-1. Nous réaliserons une analyse comparative de leur composition protéique, par spectrométrie de masse quantitative et lipidique par shotgun. Une analyse intégrative de ces données nous permettra d’identifier de nouveaux facteurs impliqués dans la propagation du VIH-1 et d’identifier de nouvelles cibles pour bloquer la transmission du virus.

Ce projet sera réalisé par une approche multidisciplinaire utilisant une gamme variée d'outils et de méthodes tels que l'isolement de compartiments, la virologie et l'imagerie, sur la base de mon expertise et de celle de notre laboratoire sur ATG9A et le VIH-1.

Ce projet se déroulera à l'Institut Cochin, (INSERM U1016-CNRS UMR 8104- Université Paris Descartes) dans le laboratoire du Dr. Clarisse Berlioz-Torrent et Dr. Stéphane Emiliani. Ce projet sera dirigé par moi-même (CRCN, INSERM – 100%) et impliquera un candidat ingénieur (100%) et des étudiants en Master (100%) en collaboration avec Clarisse Berlioz-Torrent (DR2, INSERM – 10%).