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L’infection par le génotype 3 du virus de l’Hépatite E (VHE) est généralement asymptomatique et spontanément résolutive chez les sujets immunocompétents. Cependant, l’infection des patients transplantés d’organes solides évolue fréquemment vers une hépatite chronique. Bien que la clairance du VHE semble dépendre d’une réponse efficace des lymphocytes T (LT), plusieurs lacunes subsistent, empêchant ainsi l’identification des mécanismes impliqués dans la persistance virale. En effet, le statut immunitaire du compartiment T au stade aigu de l’infection dont va dépendre le développement des LT spécifiques du VHE et l’issue de l’infection n’a jamais été évalué. A cet égard, nous avons récemment mené une analyse rétrospective du phénotype des LT provenant de 2 groupes de patients transplantés rénaux en phase aigüe d’une infection VHE dont un groupe a résolu l’infection et l’autre a développé une forme chronique 3 mois post-infection. Nous avons observé que les patients qui développeront une infection chronique sont caractérisés par une diminution de la population naïve de LT CD8 et CD4 et une accumulation de cellules mémoires/effectrices en différenciation terminale (CCR7-CD27-CD28-CD57+). De plus, ce profil semble être indépendant de la spécificité antigénique. En revanche, les patients qui élimineront le virus sont dotés de LT mémoires moins différenciés (CCR7-CD27+CD28+). Le profil des LT chez les patients susceptibles d’évoluer vers la chronicité a été précédemment attribué à des cellules sénescentes ou régulatrices et est fréquemment associé à l’immunopathogenèse des infections virales. Ainsi, nous émettons l’hypothèse qu’une altération du compartiment T au stade précoce de l’infection est impliquée dans la persistance virale chez les patients transplantés. Afin de déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent la réponse immunitaire pendant la phase aigüe de l’infection VHE, nous proposons dans ce projet d’explorer les caractères sénescent et régulateur des LT ainsi que les mécanismes sous-jacents à leurs différenciations. Pour cela, nous disposons de PBMC et de plasma congelés (de la phase aigüe et tardive de l’infection) provenant des 2 groupes de patients décrits ci-dessus et d’un groupe contrôle de patients transplantés non infectés. Nous analyserons les LT (par cytométrie de flux) sur le plan phénotypique (récepteurs NK, molécules inhibitrices et ectonucleotidases), fonctionnel (sécrétion de facteurs pro/anti-inflammatoires, potentiel cytotoxique et capacité inhibitrice de la prolifération), métabolique (capacité glycolytique, phosphorylation oxydative, fonction mitochondriale, et stress oxydatif) et réplicatif (cycle cellulaire, prolifération, dommage à l’ADN). Afin de caractériser les voies biologiques qui régissent les caractères sénescents ou régulateurs, nous évaluerons l’expression génique dans les PBMC à l’échelle de la cellule unique (par CITE-Seq). Sachant que l’accommodation du greffon lors d’une transplantation est associée à des changements métaboliques et cytokiniques qui peuvent altérer la différenciation des LT, nous utiliserons des approches métabolomiques (par LC-MS/MS) et protéomiques (par immunodosage multiplex) pour identifier les facteurs solubles et les médiateurs bioactifs présents dans le plasma. Afin de valider nos résultats, nous déterminerons enfin si une reprogrammation des voies cytokiniques et/ou métaboliques est capable de restaurer/altérer les voies de différentiation et les fonctions des LT chez les différents patients. L’ensemble des données générées dans notre projet nous permettra de déterminer : i) la réponse immune chez les patients transplantés en phase aiguë d’une infection VHE, ii) l’évolution de cette réponse entre les stades aigües et chroniques de l’infection, iii) les voies et les mécanismes précoces impliqués dans la persistance virale, iv) si la reprogrammation de certaines voies peut restaurer la réponse immunitaire, et v) une signature immunologique prédictive de la persistance virale. Ainsi notre étude fournira les connaissances fondamentales et translationnelles requises pour le développement de stratégies thérapeutiques spécifiques au VHE.

La transcription du VIH-1 est fortement dépendante del’enhancer endogène à ce virus. Cet enhancer est formé de plusieurs sites de liaison pour NF-kB présents au sein de son extrémité (LTR), qui rendent l’activation du promoteur HIV-1 dépendante de la voie de signalisation NF-kB. Des données récentes suggèrent également un rôle clé de l’environnement du site d’intégration de HIV-1, et de la présence dans le voisinage  d’enhancers de la cellule hôte. Ces enhancers favoriseraient l’intégration du génome virale tout en seregroupant spatialement. Or, l’activité des enhancers cellulaires est liée au métabolisme de petits ARNs non-codants produits à partir des enhancers (‘eRNAs’) et capables de réguler leurs regroupements spatiaux. A l’échelle moléculaire, les eRNAs pourraient réguler la liaison de facteurs clés de l’activation enhancer-dépendante des gènes, ou de HIV-1, tel que le facteur CTCF, cohésine ou encore YY-1.De façon intéressante, nos résultats montrent que la dé-régulation des eRNAs est observée après déplétion des facteurs d’adressage de ces ARNs à l’exosome, tels que l’hélicase MTR4 et ses co-acteurs ZFC3H1/PAXT et ZCCHC8/NEXT. De plus, nos travaux récents montrent que ces facteurs contribueraient largement à déréguler la latence du VIH-1, selon des mécanismes qui restent à être révélés.
 
De façon remarquable, nos résultats très récents démontrent un rôle clé des eRNAs dans le contrôle des contacts à longues distances, à la base des activations de gènesenhancer-promoteurs dépendantes. De plus, ces interactions s’avèrent être régulées en fonction de la dégradation des eRNAs selon l’adressage de l’exosome par MTR4, ZFC3H1 et  ZCCHC8. Ainsi, nous allons tester quels facteurs sont impliqués dans ces voies de régulation, dans le contexte de l’activation ou de la latence du VIH-1, et selon l’accumulation ou non des eRNAs aux enhancers endogènes capables d’activer le promoteur HIV-1 voisin. Ces informations devraient aider à mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de contrôle de la latence du virus, en fonction des eRNAs. Nos travaux pourraient également identifier un nouveau type de cibles thérapeutiques exploitables dans la modulation de la latence virale, selon l’adressage de ces eRNAs par l’exosome.

Les cellules Natural Killer (NK) sont des lymphocytes de l’immunité innée et constituent la première ligne de défense contre les cellules infectées ou tumorales. Cependant, en contexte de stimulation chronique, un état de tolérance ou d’épuisement des cellules NK a été observé. Les bases moléculaires conduisant à l’épuisement demeurent mal caractérisées et la possibilité de restaurer la fonctionnalité des cellules NK n’est pas décrite. A partir des publications précédentes de l’équipe, nous avons supposé qu’une stimulation chronique des NK induit une altération de l’activité de la voie mTOR conduisant à l’épuisement. Grâce à un précédent support de l’ANRS (Appel 2016-1), nous avons pu étudier la dysfonction des cellules NK en contexte d’infection chronique par HBV. Pour cela, nous avons établi différents panels de cytométrie en flux permettant l’analyse du phénotype, de la fonctionnalité, du métabolisme et des capacités de signalisation de cellules NK chez des patients chroniquement infectés. En effet, nous avons recruté une cohorte de patients  classés rétrospectivement comme porteurs inactifs.  Des changements phénotypiques ont pu être observés tels que des altérations de l’expression des récepteurs CD160, NKp30, CD16 et Tim-3, l’expansion de la population de cellules NK adaptatives (FCεRg- NKG2C+ or CD57high) mais également l’augmentation de l’expression de CD107a au niveau basal (marqueur de dégranulation), de NKG2D et 41BB. Des changements au niveau fonctionnels comme la diminution de la production d’IFNγ et de MIP1β mais également l’augmentation des niveaux deTGF-β dans le sérum des patients, ont été mis en évidence. De plus, nous avons observé une diminution de la phosphorylation des protéines S6 et Akt (protéines en aval de l’activation de mTOR) chez les patients (cf rapport Appel 2016-1). La diminution de la fonction des cellules NK ainsi que l’augmentation de la dégranulation basale chez les patients suggère un état d’épuisement des cellules NK. Enfin, nos données provenant de modèles in vitro où des PBMCs sont exposées au virus, suggèrent que le composé viral HBsAg conduit à la dérégulation de la voie mTOR.

Notre demande de financement d’une année supplémentaire est nécessaire à l’analyse d’une seconde cohorte de patients en cytométrie de flux multiparamétrique. L’inclusion des patients est actuellement en cours et les patients recrutés représentent les 5 phases de l’infection (immunotolérance, immune active, immune inactive, réactivation et patients sous traitement). Notre but est d’examiner le phénotype, la fonction et les voies de signalisation potentiellement altérées afin de déterminer la cinétique de l’épuisement et de la dérégulation de mTOR au cours des différentes phases de l’infection. En parallèle, en utilisant nos modèles in vitro actuellement en cours d’optimisation, nous souhaitons identifier les mécanismes utilisés par le virus et plus particulièrement HBsAg pour induire la perte de fonction de mTOR et ainsi l’épuisement des cellules NK.

Les traitements actuels pour une infection chronique du virus de l’hépatite B (VHB) sont rarement curatifs et doivent être pris à vie. Bien que le virus infecte les hépatocytes, la réponse immunitaire joue un rôle prépondérant dans la physiopathologie induite par le VHB, en déterminant sa progression vers la résolution ou la chronicité. Les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régulent cette évolution sont méconnus.

L’objectif de ce projet de recherche est d’analyser la réponse immunitaire suite à un traitement combiné avec un inhibiteur de la capside qui inhibe fortement la charge et les antigènes viraux. Le VHB a un tropisme restreint aux humains et aux chimpanzés, ainsi des modèles animaux de petite taille qui combinent un système immunitaire et un foie humanisé sont très utiles pour étudier les interactions entre les hépatocytes infectés et la réponse immunitaire. Dans ce but, nous avons établi un modèle murin immunodéficient greffé avec des cellules souches hématopoïétiques humaines et des hépatocytes humains, générant des souris chimériques avec un système immunitaire et un foie humanisés (souris HIS-HUHEP) (Strick-Marchand et al. 2015).

Chez les souris HIS-HUHEP inoculées avec le VHB, la virémie augmente progressivement, puis la virémie se stabilise, alors que chez les souris HUHEP la virémie augmente continuellement. L’hépatite chronique dans les souris HIS-HUHEP est caractérisée par une activation des cellules NK et T, dans le foie et la rate, accompagnée par le développement d’une réponse humorale anti-HBV spécifique (anti-HBc, anti-HBs). Malgré cette réponse inflammatoire, une immunosuppression est aussi observée dans le foie (TREG, IL-10, MDSC), reflétant la dichotomie observée chez les patients VHB chroniques, et la possibilité d’analyser la persistance virale versus son contrôle dans ce modèle murin (Dusseaux et al. Gastroenterology 2017).

Dans cette étude, nous analyserons la réponse immunitaire chez des animaux chroniquement infectés et traités avec des analogues nucleos(t)iques (NUC) en présence ou en absence d’un nouveau inhibiteur de la capside GLP-26. Nos résultats préliminaires chez des souris HUHEP infectées HBV montrent que ce traitement combiné réduit considérablement le HBV DNA, HBsAg, HBeAg avec un contrôle partiel de la virémie après l’arrêt du traitement. Cette diminution remarquable de l’HBsAg pourrait permettre l’induction d’un rétablissement de la réponse immunitaire, qui était épuisée par la stimulation continuelle avec des antigènes viraux excessifs. Chez les souris immunocompétentes HIS-HUHEP, nous évaluerons si ces combinaisons thérapeutiques peuvent rétablir une réponse immunitaire efficace et curative après l’arrêt du traitement en analysant les paramètres virologiques (HBV DNA, HBcAg, HBeAg, HBsAg, pgRNA, cccDNA) et immunologiques (séroconversion, phénotypes myéloïdes et lymphoïdes, biomarqueurs plasmatiques). Nous déterminerons si la réduction de la charge d’antigènes viraux peut rétablir une réponse immunitaire par les lymphocytes T et B dans le foie. Ce modèle animal a l’avantage de permettre une étude fine de la pathologie dans le foie, organe cible de l’infection au centre de la réponse immunitaire.

Nos résultats nous éclaireront sur les stratégies d’échappement et d’immunosuppression mises en place par le VHB afin de modifier la réponse immunitaire. Ces modifications inhibent le développement d’une réponse adaptative diversifiée et efficace, ce qui mène à une infection virale persistante. Ces modèles animaux novateurs permettront d’évaluer des traitements immunomodulateurs, en combinaison avec des antiviraux, afin d’élaborer des stratégies thérapeutiques plus efficaces et curatives.

Aujourd’hui, les personnes vivant avec le VIH sous traitement antirétroviral efficace ont une espérance de vie proche des personnes non infectées par le virus. En France, 4% des PVVIH sont âgés de 70 ans et plus et cette proportion va augmenter dans les décennies à venir. Cependant les comorbidités associées à l’âge, en particulier les maladies cardiovasculaires, l’ostéoporose, les troubles métaboliques, hépatiques, rénaux, fractures osseuses et certains cancers sont plus fréquentes dans un contexte d’exposition au VIH, d’immunodépression, d’exposition prolongée à certains ARV, de polymédications et de mode de vie à risque plus importants. Dès lors, une approche de prise en charge globale présente l’intérêt de pouvoir réduire l’apparition d’évènements de santé péjoratifs et la perte d’autonomie chez les personnes âgées vivant avec le VIH. Le dépistage de la fragilité, syndrome gériatrique caractérisé par une perte des réserves physiologiques où la personne perd ses capacités d’adaptation au stress permettrait de détecter précocement les sujets à risque et de construire des programmes d’interventions de santé du fait de la réversibilité de cet état.

C’est dans ce contexte que s’est inscrite l’étude ANRS EP66 SEPTAVIH, étude prospective, multicentrique, nationale dont l’objectif initial était d’évaluer la prévalence de la fragilité chez les PVVIH âgés de 70 ans et plus et d’étudier la faisabilité du dépistage via différents outils d’évaluation. Cette étude démarrée en mai 2019 a recruté 512 patients dans les 16 centres participants et prévoit un suivi sur 12 mois. Les données recueillies vont permettre d’identifier les facteurs de risque associés à la survenue d’évènements péjoratifs de santé à court terme comme les chutes graves, la diminution des capacités fonctionnelles, le recours aux soins non programmés et les institutionnalisations.

Nous souhaitons désormais proposer aux sujets inclus dans SEPTAVIH un suivi sur 5 ans. L’organisation d’un suivi long terme d’une population de PVVIH gériatrique en France nous permettra de disposer de suffisamment d’éléments pour identifier le ou les critères de fragilité les plus discriminants chez cette population émergente, ceci avec un rapport coût/efficacité favorable puisque l’évaluation initiale des PVVIH âgés a été très exhaustive, les patients se prêtent volontiers à l’évaluation et les équipes sont maintenant aguerries à l’évaluation des sujets âgés. Cela laisse présager d’un faible nombre de perdus de vue et d’une excellente qualité des données de suivi.  

Le suivi SEPTAVIH Long terme comprendra 1 visite par an pour un suivi total de 5 ans, correspondant aux visites annuelles de suivi de l’infection VIH. Ces visites seront complétées par une évaluation gériatrique simplifiée réalisée dans le service d’infectiologie.

Cette évaluation long terme contribuera ainsi à disposer de connaissances supplémentaires pour adapter les recommandations de prise en charge dans cette population particulière de PVVIH gériatriques. Elle permettra également de servir de base à la construction d’essais pragmatiques d’évaluation d’interventions ciblées pour prévenir/ralentir la perte d’autonomie dans cette population comme cela peut être observée en population générale.