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L’initiation d’une multithérapie antirétrovirale chez le nourrisson infecté par le VIH dans les premiers mois de vie entraine dans la plupart des cas le contrôle de la réplication virale, limite la dissémination et la taille des réservoirs, préserve la réponse immunitaire humorale et cellulaire et réduit drastiquement la mortalité. Ainsi, avec la diffusion large des antirétroviraux, l’observation dans les files actives d’enfants infectés par le VIH avec des sérologies négatives n’est plus un phénomène exceptionnel : ils représentent 26% des enfants de l’étude ANRS 12225-Pediacam. Cette situation est un véritable défi en clinique dans la mesure où les mécanismes impliqués dans sa survenue ne sont pas élucidés. Plusieurs pistes explorées dans le contexte des pays du Nord et dans de rares pays du Sud mettent en avant la précocité du TARV chez l’enfant qui contrôlerait très rapidement la réplication virale entrainant une absence d’antigène pour stimuler le système immunitaire et les déterminants génétiques associés à un meilleur contrôle immunitaire. L’identification de ces mécanismes pourrait contribuer de façon déterminante à la compréhension du contrôle de la réplication virale du VIH post traitement antirétroviral qui aujourd’hui constitue un défi très important dans le champ de la recherche sur l’infection VIH pédiatrique. En même temps, elle fournira aux cliniciens des éléments pour mieux gérer cette situation. La cohorte ANRS – Pediacam nous offre une opportunité d’explorer en Afrique sub-Saharienne cette question de part sa conception comportant un groupe d’enfants infectés par le VIH traités précocement et deux groupes témoins d’enfants non infectés nés de mères séropositives ou négatives pour le VIH, sa durée de suivi (démarrage en 2007) et la constitution d’une biothèque bien documentée. Pour ce faire, nous privilégierons trois orientations majeures dans cette étude physiopathologique : l’exploration du statut immunitaire lors de l’exposition au VIH en primo-infection, la description plus fine du réservoir (mesure du réservoir viral (ADN VIH total et ADN VIH intégré sur PBMC), de l’activité du réservoir VIH  (ARN messagers du VIH associés aux cellules), et virémie résiduelle (Charge virale ultrasensible)), et l’exploration des déterminants génétiques (HLA et KIR).

Cette étude nichée dans la cohorte ANRS 12225 – Pediacam III comportera deux phases dans sa mise en place : une étude cas-témoins (phase rétrospective) dans laquelle les cas seront constitués d’enfants infectés par le VIH ayant eu au cours de leur suivi médical au moins une sérologie VIH négative faite par ELISA. A côté, seront constitués quatre groupes témoins d’enfants ayant toujours eu une sérologie positive au cours du suivi avec bon contrôle virologique, avec mauvais contrôle virologique, d’enfants non infectés nés de mères séropositives, d’enfants nés de mères séronégatives pour le VIH. Les cas et les témoins seront stratifiés sur l’âge gestationnel (<37 et ≥37 semaines) et l’année de naissance (2007-2008 et 2009-2010). Pour tous les enfants inclus dans cette phase, les analyses porteront sur les données mesurées à partir de la biothèque déjà disponible durant la phase de primo-infection avant l’initiation des HAART, à 6 mois après la fin de la première série des vaccins du PEV, et à 2 ans. Une étude transversale (phase prospective) sera proposée à tous les enfants inclus et toujours suivis dans la cohorte, permettant de constituer une biothèque ad hoc lors de deux visites successives, afin de mesurer des paramètres non mesurables sur la biothèque constituée dans la petite enfance. Aujourd’hui ces enfants ont entre 8 et 12 ans, et il très important de constituer une biothèque avant leur entrée dans l’adolescence.

Au delà des avancées dans la compréhension des mécanismes expliquant le phénomène de séronégativation, les résultats pourraient permettre de prédire la taille du réservoir viral et la reconstitution des lymphocytes T CD4 chez les sujets compliants. De plus, ces résultats associés à la banque d’échantillons sanguins générée permettront d’envisager des futures études et faciliter le renforcement du transfert de technologie.

L’infection chronique par HBV (CHB) augmente fortement le risque d’hépatocarcinome. Or, les traitements actuels du CHB ne sont pas curatifs car ils ne permettent pas d’éliminer l’ADN viral nucléaire épisomique (ADNccc) qui est responsable du rebond viral à l’arrêt des traitements. L’ADNccc sert de matrice à la transcription des ARNs viraux dont l’ARN prégenomique qui est  encapsidé et rétrotranscrit en ADN dans le cytoplasme, créant ainsi un cycle de renouvellement du pool d’ADNccc. Dans le but de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à éliminer le virus, il est important d’élucider les mécanismes contrôlant la transcription du cccDNA.

L’organisation spatiale tri-dimentionnelle (3D) du génome joue un rôle important dans la régulation de l’expression des gènes. On ignore cependant encore si les virus à ADN, dont l’HBV, entrent en contact avec des régions spécifiques du génome de l’hôte et tirent parti de l’architecture 3D du génome pour recruter ou mobiliser des facteurs nécessaires à leur propre réplication/transcription.

En utilisant des approches de «Chromosome Conformation Capture » (Hi-C) et de capture de l’ADN viral (CHi-C) à partir d’hépatocytes humains primaires (PHH) infectés par HBV, nous avons montré qu’HBV contacte préférentiellement la chromatine active au niveau des ilots CpG (CGIs). Les CGIs sont enrichis en facteurs Cfp1, un facteur qui est recruté sur l’ADNccc et qui est nécessaire à sa transcription. Enfin, nous avons également observé que les gènes associés aux CGIs contactés par HBV correspondent aux gènes dont l’expression est dérégulée dans les PHH infectés. Ces données suggèrent qu’HBV contacte préférentiellement des régions spécifiques de la chromatine active car elles offrent vraisemblablement un environnement favorable à sa propre transcription. De plus nos données suggèrent qu’HBV interfère avec l’expression des gènes cellulaires à travers des contacts ADN viral/ ADN Cellulaire (Moreau et al, Nature Comm., in press).

Le but de notre projet est de déterminer quels sont les mécanismes impliqués dans l’adressage de l’ADN de l’HBV à la chromatine active et d’en comprendre les conséquences fonctionnelles notamment au niveau de la transcription de l’ADNccc et de la dérégulation de l’expression des gènes cellulaires.

Dans ce but, par des approches de capture virale CHi-C, d’imagerie et d’immunoprécipitation de la chromatine et de séquençage (ChIP-seq) nous déterminerons le rôle des facteurs cellulaires Cfp1 et CTCF et de la protéine virale HBc dans le positionnement de l’ADN d’HBV aux CGIs. Nous  déterminerons également l’importance de ce positionnement aux CGIs dans la transcription de l’ADNccc. En parallèle, par des approches de capture HI-C (CHI-C) à partir de PHH infectés par l’HBV sauvage ou déficient pour l’expression d’HBc, nous rechercherons si HBV dérégule l’expression des gènes cellulaires en perturbant l’organisation 3D des CGIs, agissant ainsi comme un dérégulateur spatial de l’expression des gènes. Nous déterminerons si la dérégulation de l’expression des gènes corrèle alors avec des modifications épigénétiques comme la méthylation de l’ADN ou la déposition de marques répressives H3K27me3. 

L’objectif général du projet est d’identifier des cibles thérapeutiques permettant d’éradiquer le réservoir viral.

La surinfection par le virus de l’Hépatite Delta (HDV) de patients chroniquement infectés par le virus de l’Hépatite B (HBV) induit une des formes les plus agressives d’hépatite virale chronique. Plus de 40 ans après sa découverte, cette surinfection reste énigmatique à la fois pour les chercheurs et les cliniciens. En particulier, en plus d’induire des effets secondaires sévères, l’efficacité des traitements à base d’IFN-α est limitée est limitée et les mécanismes liés à ces échecs ne sont pas connus. Si plusieurs gènes stimulés par l’interferon (ISGs) ont déjà été décrit pour inhiber HBV, le set complet d’ISGs nécessaire à l’effet de l’IFN-α n’a pas été décrit. De plus, le mode d’action et les ISGs responsables de l’effet antiviral de l’IFN-α sur HDV sont complétement inconnues.

Objectif. A partir de données préliminaires solides obtenues après séquençage ARN de cellules HepaRG et HuH7.5-NTCP différenciées (dHepaRG et dHuH7.5-NTCP), notre objectif est d’établir une carte complète des facteurs de restrictions pour HBV et HDV induit par l’IFN-α afin d’évaluer de nouvelles stratégies antivirales basée sur le remplacement de l’IFN-α.

Partie 1. Identification des sets d’ISGs responsable de l’effet antivirale de l’IFN-α sur HBV et/ou HDV. Après validation des données de notre analyse transcriptomique par nanostring et RTqPCR, des expériences de pertes et gain de fonction seront menées dans des cellules dHepaRG et dHuH7.5-NTCP pour identifier les sets complets d’ISGs responsable de l’effet antivirale de l’IFN-α sur HBV et/ou HDV. Des expériences seront ensuite effectuées dans des hépatocytes primaires humain (PHH) pour déterminer le mode d’action sur HBV et/ou HDV des ISGs identifiées.

Partie 2. Test de l’effet antiviral des ISGs identifées en combinaison avec des traitements anti-HDV. Des vecteurs AAV recombinants exprimant les ISGs les plus efficaces pour inhiber HBV et/ou HDV (identifiées en partie 1) seront produits et leur profil de toxiccité ainsi que leur efficacité antivirale seront testés dans des PHH, dHepaRG et souris humanisées pour le foie (HuHep). Des combinaisons seront effectuées avec des molécules approuvées ou en développement pour le traitement de l’hépatite comme le Bulevirtide ou le Lonafarnib. L’effet antiviral de ces combinaisons sera comparé à des combinaison avec l’IFN-α.

Perspectives. Notre programme permettra d’avancer sur notre compréhension des interactions entre les ISGs et les co-infections par HBV et HDV tout en identifiant des nouveaux facteurs de restrictions de l’hôte. La liste complète de ces ISGs ouvrira la voie vers le développement de nouvelles stratégies antivirales basées sur le remplacement de l’IFN-α. Nos résultats pourraient aussi permettre d’identifier des biomarqueurs de réponses aux traitements actuels chez les patients.