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De nouvelles options sont nécessaires pour vacciner contre des agents infectieux tels que le VIH. L’ingénierie génomique au locus des gènes des immunoglobulines à l’aide des outils CRISPR Cas9 est une nouvelle approche permettant d’introduire de nouveaux paratopes dans le répertoire des cellules B humaines, notamment pour exprimer des anticorps neutralisants contre le VIH-1. En modifiant le répertoire des lymphocytes B naïfs capables de répondre à une stimulation antigénique pour se différencier en plasmablastes et lymphocytes mémoire spécifiques du VIH-1, cette approche pourrait permettre une vaccination contre le VIH-1. En utilisant des stratégies CRISPR Cas9 efficaces et récemment publiées ainsi que des nouveaux vecteurs lentiviraux pour la modification génétique des cellules B primaires humaines naives ou activées, nous proposons d’insérer des nouveaux HIV-1 bnAbs LN01 ou LN02 dans le locus du gène IgH variable des cellules B humaines. L’approche d’édition du génome sera optimisée en terme d’éfficacité, de spécificité et de maintien de la viabilité et de la fonction cellulaire. Les cellules reprogrammées seront testées in vivo dans dans des souris humanisées pour définir la persistence des cellules et les niveaux de production d’anticorps reprogrammés. Les souris seront également soumise à un stimulation antigénique avec un nouveau système couplant un anticorps anti-CD40 fusionné à des peptides HIV-1 portant des épitopes T.  Un challenge HIV-1 dans un modèle thérapeutique, permettra de définir si les cellules reprogrammées ont permettent de réduire la réplication du VIH-1. Le projet sera mené grâce à la collaboration entre une équipe spécialisée dans la thérapie génique translationnelle (accélérateur de recherche technologique) et une équipe spécialisée dans le développement de vaccins anti-VIH (institut de recherche sur les vaccins). Trois tâches seront conduites pour développer les constructions, optimiser la livraison des composants d’édition de gènes aux cellules B et tester la production d’anticorps des cellules B reprogrammées in vitro et in vivo. Les résultats de ce projet HIV-B-VAC pourraient avoir un impact important sur le développement de vaccins contre le VIH. Des résultats positifs seraient applicables à de nombreuses autres maladies pour lesquelles une thérapie par anticorpsa démontré son utilité.

Situation du sujet : Au stade chronique de l’infection virale B, des complications peuvent survenir comme la fibrose hépatique qui peut évoluer vers une cirrhose hépatique ou un carcinome hépato-cellulaire. Le mécanisme physiopathologique de la fibrose hépatique est complexe mais l’activation puis la prolifération des cellules hépatiques stellaires (CHS) joue un rôle primordial dans la fibrogenèse. L’implication du VHB et/ou de ses protéines virales spécifiques dans l’activation des CHS et la fibrose hépatique reste à préciser.

Objectifs : Le projet Fibcore a pour objectifs de mettre en place les outils moléculaires qui permettront d’étudier le rôle différencié ou combiné des protéines HBc et HBe dans l’induction de la fibrose hépatique via le développement d’un modèle de co-culture cellulaire utilisant les lignées HepaRG et LX2.

Méthodes :

Plusieurs étapes sont nécessaires pour mener à bien ce projet :

1. La construction de 3 particules lentivirales : l’une contenant le transgène complet (le PBC et les gènes précore-core), la 2ème contenant le transgène précore-core tronqué du PBC et la 3ème contenant uniquement le gène core
2. L’optimisation de la transduction des cellules HepaRG différenciées (dHepaRG) pour synthétiser les protéines d’intérêts
3. La production des protéines HBc et HBe après transduction des HepaRG par les particules lentivirales définies dans l’étape 1
4. La validation du modèle de co-culture cellulaire utilisant les lignées HepaRG et LX2.
5. La mesure de l’impact de la production simultanée ou différentielle des protéines HBc et HBe sur l’expression des gènes profibrotiques ou la synthèse des marqueurs pro-fibrotiques (collagène 1, a-SMA, PDGF, TGF-β1) pour déterminer le rôle pro- ou anti-fibrosant de ces deux protéines.

Echéancier : Les étapes 1 et 2 ont été validées en 2017 au cours des travaux de master 2 du Dr Lefeuvre et du doctorat d’université du Dr Pivert. Une partie de l’étape 3 a été validée au cours  des travaux de master 2 du Dr Przyrowski et l’optimisation de la synthèse de la protéine HBc est en cours. Les étapes 4 et 5 feront l’objet des travaux de thèse d’université du Dr Lefeuvre.

Résultats attendus : Nous espérons valider notre modèle d’étude de la fibrose hépatique par une production efficiente des protéines HBc et HBe suite à la transduction des dHepaRG et étudier le rôle pro- ou anti-fibrosant de ces mêmes protéines en appréciant le niveau d’expression des gènes profibrotiques suite à l’activation des CHS.

Le tissu adipeux (TA) est un tissu largement affecté lors de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) puisqu’il est ciblé simultanément par le virus et les molécules antirétrovirales (ARV). Les perturbations des fonctions métaboliques et sécrétoires du TA ont des répercussions sur l’ensemble de l‘organisme en particulier sur les aspects métaboliques et inflammatoires qui participent au risque cardio-métabolique. Par ailleurs, des données récentes de la littérature suggèrent que le TA pourrait également jouer un rôle anti-infectieux majeur, de par la présence de lymphocytes T (LT) mémoires résidents en son sein. Les perturbations du TA pourraient contribuer à trois aspects majeurs de la physiopathologie de l’infection par le VIH : le risque cardiovasculaire et dysmétabolique, la persistance virale et les perturbations immunitaires.

Nous posons l’hypothèse que les dysfonctions du TA, observées au cours de l’infection par le VIH, conduisent à des atteintes métaboliques, qui seraient responsables de la mise en place des perturbations immunitaires. L’objectif de ce projet est de mieux caractériser la biologie du TA, en étudiant simultanément les versants immunologique et métabolique de ce tissu, et d’identifier les nœuds d’interaction entre les perturbations métaboliques et immunitaires observées chez les patients. Nous avons défini trois objectifs :

(1) Evaluer l’impact synergique de l’infection chronique par le VIH/SIV et des ARV sur les composantes métabolique et sécrétoire du TA. L’originalité de ce travail est de caractériser le contexte de l’infection chronique par le VIH/VIS, en intégrant la toxicité des nouveaux ARV (en particulier les inhibiteurs d’intégrase (dolutégravir et raltégravir)) et la persistance virale au sein du TA. Nous étudierons les modifications morphologiques (fibrose, vascularisation, taille adipocytaire) et fonctionnelles du TA (adipogenèse, insulino-résistance, lipolyse). L’implication de différentes voies, telles que la sénescence, l’inflammation, ou le stress oxydant, sera étudiée.

(2) Evaluer l’impact synergique de l’infection chronique par le VIH/SIV et des ARV sur les capacités immunitaires du TA. L’étude des propriétés fonctionnelles comprendra une analyse des capacités effectrices, des profils d’épuisement et de sénescence des LT mais aussi du potentiel de migration de ces derniers, notamment vers les sites lymphoïdes. Des études de mobilité seront réalisées par microscopie dynamique in vivo et ex vivo sur explants.

(3) Identifier les mécanismes impliqués dans ces interactions entre métabolisme et immunité dans le contexte de l’infection par le VIH. Plusieurs mécanismes peuvent être impliqués dans ce dialogue. Un de nos axes d’étude sera la caractérisation du double rôle des ASC qui, en complément de leur activité pro-adipogénique, présentent des activités immunosuppressives. Un deuxième aspect sera aussi d’évaluer l’impact de la fibrose du TA sur la mobilité des cellules immunitaires. A l’inverse, les modifications immunitaires du TA peuvent impacter sur sa fonction métabolique et jouer un rôle dans l’insulinorésistance et le profil dysmétabolique. Les associations entre ces différents paramètres seront étudiées dans les modèles animaux VIS et confirmées chez les patients.

Ce travail collaboratif vise à démontrer l’impact direct des perturbations métaboliques sur la qualité des réponses immunitaires, non seulement au sein du TA, mais aussi aux sites lymphoïdes de proximité dans le contexte de l’infection par le VIH. Si tel est le cas, nos résultats identifieraient le TA comme un organe central, non seulement pour les équilibres métaboliques, mais aussi pour la qualité des réponses anti-infectieuses. Cette problématique pourrait être d’autant plus importante chez les patients vivant avec le VIH que la population des patients infectés vieillit progressivement et est plus sensibles aux déséquilibres métaboliques et infectieux. Ce travail pourrait permettre de mieux cibler les actions thérapeutiques de restauration de l’homéostasie du TA, et ainsi réduire le risque cardio-métabolique et les perturbations immunitaires chez les patients.

L’initiation d’une multithérapie antirétrovirale chez le nourrisson infecté par le VIH dans les premiers mois de vie entraine dans la plupart des cas le contrôle de la réplication virale, limite la dissémination et la taille des réservoirs, préserve la réponse immunitaire humorale et cellulaire et réduit drastiquement la mortalité. Ainsi, avec la diffusion large des antirétroviraux, l’observation dans les files actives d’enfants infectés par le VIH avec des sérologies négatives n’est plus un phénomène exceptionnel : ils représentent 26% des enfants de l’étude ANRS 12225-Pediacam. Cette situation est un véritable défi en clinique dans la mesure où les mécanismes impliqués dans sa survenue ne sont pas élucidés. Plusieurs pistes explorées dans le contexte des pays du Nord et dans de rares pays du Sud mettent en avant la précocité du TARV chez l’enfant qui contrôlerait très rapidement la réplication virale entrainant une absence d’antigène pour stimuler le système immunitaire et les déterminants génétiques associés à un meilleur contrôle immunitaire. L’identification de ces mécanismes pourrait contribuer de façon déterminante à la compréhension du contrôle de la réplication virale du VIH post traitement antirétroviral qui aujourd’hui constitue un défi très important dans le champ de la recherche sur l’infection VIH pédiatrique. En même temps, elle fournira aux cliniciens des éléments pour mieux gérer cette situation. La cohorte ANRS – Pediacam nous offre une opportunité d’explorer en Afrique sub-Saharienne cette question de part sa conception comportant un groupe d’enfants infectés par le VIH traités précocement et deux groupes témoins d’enfants non infectés nés de mères séropositives ou négatives pour le VIH, sa durée de suivi (démarrage en 2007) et la constitution d’une biothèque bien documentée. Pour ce faire, nous privilégierons trois orientations majeures dans cette étude physiopathologique : l’exploration du statut immunitaire lors de l’exposition au VIH en primo-infection, la description plus fine du réservoir (mesure du réservoir viral (ADN VIH total et ADN VIH intégré sur PBMC), de l’activité du réservoir VIH  (ARN messagers du VIH associés aux cellules), et virémie résiduelle (Charge virale ultrasensible)), et l’exploration des déterminants génétiques (HLA et KIR).

Cette étude nichée dans la cohorte ANRS 12225 – Pediacam III comportera deux phases dans sa mise en place : une étude cas-témoins (phase rétrospective) dans laquelle les cas seront constitués d’enfants infectés par le VIH ayant eu au cours de leur suivi médical au moins une sérologie VIH négative faite par ELISA. A côté, seront constitués quatre groupes témoins d’enfants ayant toujours eu une sérologie positive au cours du suivi avec bon contrôle virologique, avec mauvais contrôle virologique, d’enfants non infectés nés de mères séropositives, d’enfants nés de mères séronégatives pour le VIH. Les cas et les témoins seront stratifiés sur l’âge gestationnel (<37 et ≥37 semaines) et l’année de naissance (2007-2008 et 2009-2010). Pour tous les enfants inclus dans cette phase, les analyses porteront sur les données mesurées à partir de la biothèque déjà disponible durant la phase de primo-infection avant l’initiation des HAART, à 6 mois après la fin de la première série des vaccins du PEV, et à 2 ans. Une étude transversale (phase prospective) sera proposée à tous les enfants inclus et toujours suivis dans la cohorte, permettant de constituer une biothèque ad hoc lors de deux visites successives, afin de mesurer des paramètres non mesurables sur la biothèque constituée dans la petite enfance. Aujourd’hui ces enfants ont entre 8 et 12 ans, et il très important de constituer une biothèque avant leur entrée dans l’adolescence.

Au delà des avancées dans la compréhension des mécanismes expliquant le phénomène de séronégativation, les résultats pourraient permettre de prédire la taille du réservoir viral et la reconstitution des lymphocytes T CD4 chez les sujets compliants. De plus, ces résultats associés à la banque d’échantillons sanguins générée permettront d’envisager des futures études et faciliter le renforcement du transfert de technologie.

La protéine TRBP est impliquée dans divers mécanismes biologiques, notamment en tant que co-facteur de la protéine Dicer, une RNase impliquée dans l’une des étapes de maturation des pré-miARNs, dont TRBP garantit la spécificité de substrat. TRBP agit également au cours de l’infection cellulaire par le VIH, où elle favorise la propagation virale en bloquant le caractère inhibiteur de l’élément TAR en 5’ de l’ARN génomique viral sur la traduction des protéines situées en aval. TRBP permet également de détourner la méthylase cellulaire FTSJ3 au profit du virus, lui permettant d’échapper au système immunitaire. Récemment, nous avons mis en évidence une interaction directe entre, d’une part, la protéine TRBP, et d’autre part, la protéine RPAP3 du complexe d’aide à l’assemblage, R2TP. Nous avons en outre obtenu la structure cristalline à haute résolution de ce complexe, identifiant les résidus clés à l’interface des deux protéines indispensables à l’interaction. Le complexe R2TP associé à HSP90/70 joue le rôle de protéine chaperone pour l’assemblage de diverses particules ribonucléoprotéiques. Nous avons montré que les liaisons de TRBP à RPAP3 ou de TRBP à Dicer étaient mutuellement exclusives, tandis que RPAP3 peut simultanément lier TRBP et HSP90/70. Les rôles de RPAP3 au cours du cycle de réplication du VIH ou dans le processus de maturation des miARN n’ont jamais été décrits. La mise en évidence de cette nouvelle interaction entre TRBP et RPAP3 nous permet de proposer ce projet dans lequel nous tenterons de déterminer quels sont les fonctions possibles de RPAP3 dans la régulation des activités de TRBP au cours la réplication du VIH et dans le mécanisme de maturation des miARNs. Enfin, nous entreprendrons l’analyse structurale du complexe TRBP-FTSJ3 qui n’est pas décrite, ce qui permettra de mieux comprendre les mécanismes clés d’échappement du virus au système immunitaire et de développer à terme de nouvelles stratégies thérapeutiques antivirales.

Plus de 25 millions de personnes dans le monde souffrent d’une infection chronique par le virus de l’hépatite D (VHD). Alors que l’évolution clinique de l’infection aiguë par le VHD ne se distingue guère de l’hépatite B aiguë, à l’exception d’un taux plus élevé d’hépatites fulminantes, l’infection chronique par le VHD aggrave les pathologies hépatiques causées par le VHB. Le VHD se réplique dans les hépatocytes et les altérations qu’il induit se limitent au foie, se caractérisant par une nécrose des hépatocytes et des infiltrats inflammatoires. Le virion du VHD est une particule enveloppée constituée d’une enveloppe lipidique contenant des protéines de surface du VHB (HBsAg) et enrobant une ribonucléoprotéine interne (RNP), composée d’un multimère de la protéine delta (HDAg) codée pour le VHD et associée à une copie de l’ARN viral circulaire monocaténaire.

Bien que la protéine HDAg ait été initialement considérée comme un nouvel antigène du VHB, il a été montré par la suite qu’elle était associée à un petit ARN en tant qu’agent transmissible et défectueux utilisant les glycoprotéines (GP) d’enveloppe du VHB pour sa propagation, reflétant ainsi la nature du VHD comme virus satellite du VHB. En effet, les particules du VHD utilisent uniquement le mécanisme d’enveloppement et de bourgeonnement fournis par les GPs du VHB, ce qui permet ensuite le ciblage et l’entrée des particules du VHD dans les hépatocytes humains via des mécanismes qui dépendent des facteurs d’entrée du VHB. Le VHB, un virus « furtif » qui induit peu d’activation de la réponse innée et même la supprime, est lui-même réprimé lors d’une co-infection par le VHD,viadivers mécanismes directs et indirects. En particulier, l’activation de la réponse innée par le VHD, laquelle a peu ou pas d’effet sur le VHD lui-même, peut affecter plusieurs paramètres du VHB.

L’origine du VHD est actuellement inconnue. Il est possible que son ARN provienne du transcriptome cellulaire, en accord avec la découverte selon laquelle les ARN circulaires sont abondants dans les cellules. Par conséquent, une possibilité pourrait être que l’ARN du VHD soit apparu dans des hépatocytes infectés par le VHB après évolution de formes d’ARN cellulaire circulaires devenant auto-réplicatives et pour lesquelles le ribozyme viral et les séquences d’ARN codant pour HDAg pourraient être issues du transcriptome humain. Alternativement, comme l’ARN du VHD peut s’auto-répliquer dans une grande variété de types de cellules et d’espèces, ceci pose la possibilité théorique qu’il puisse être transmis par des processus différent de ceux fournis par le VHB.

Une étude récente de notre laboratoire a montré la possibilité que le VHD peut être transmis dans des infections expérimentales in vivopar différents virus génétiquement non apparentés au VHB, notamment par le virus de l’hépatite C (VHC). Ces résultats suggèrent que le VHD interrogent sur les raisons pour lesquelles le VHD semble, en apparence du moins, avoir naturellement évolué avec le VHB et non avec d’autres virus hépatotropes tels que le VHC. Dans le cas d’éventuelles co-infections VHD/VHC naturelles, le VHD et le VHC pourraient soit se neutraliser mutuellement, via des interactions réciproques négatives, soit coexister simultanément, ce que nous proposons de modéliser et disséquer dans ce projet.

Ainsi, nous investiguerons dans des co-infections expérimentales VHD/VHC in vitroet in vivo: 1) comment le VHC, qui est génétiquement différent du VHB, pourrait fournir au VHD ses mécanismes d’enveloppement, de bourgeonnement, de sécrétion ainsi que ses fonctions d’entrée ou de transmission, 2) quelles seraient les conséquences d’une telle transmission sur la réplication et la propagation du VHD, ou vice-versa, et sur ses interférences directes ou indirectes (immunes) entre les deux virus. Ce projet devrait également permettre de mieux comprendre les mécanismes qui on permis au VHD de s’adapter naturellement au VHB.