Winning projects and candidates

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agent infectieux responsable de la tuberculose, tue chaque année 1,5 millions de personnes. L’antibiothérapie actuelle, administrée par voie orale, est contraignante, longue et entraîne de nombreux effets indésirables. Avec l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques et les faiblesses de la thérapie orale, il est urgent de développer un traitement plus efficace. Dans ce projet de recherche, nous proposons d’administrer par aérosolisation des nanoparticules originales à base d’oligosaccharides (poly-beta-cyclodextrines ou pβCD) et/ou de PLGA (polymère d’acide lactique et d’acide glycolique) chargées avec une combinaison d’antibiotiques adaptée. Ce projet ambitieux est interdisciplinaire et repose sur de solides preuves de concept.

Nous avons démontré que l’encapsulation d’antibiotiques dans ces pβCD et leur administration directement dans les poumons, augmentait considérablement l’efficacité du traitement en faveur de l’administration par voie orale chez la souris. De plus, nous avons découvert que ces particules « nues » (en l’absence d’antibiotique) avaient la particularité intrinsèque d’améliorer les défenses de l’hôte et donc de diminuer la charge bactérienne. Les nanoparticules de PLGA permettront l’encapsulation des médicaments qui ne présenteront pas d’affinités avec les pβCD. Nous avons aussi montré que les PLGA utilisées dans ce projet étaient principalement internalisée par les macrophages (cellules réservoir de Mtb) et qu’elles s’y accumulaient préférentiellement lorsque la cellule était infectée. Cela renforce le rôle de vecteur d’antibiotiques pour ces molécules.

Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons identifier la combinaison de molécules/nanoparticules idéale qui permettra une diminution drastique de la charge bactérienne pulmonaire pour un minimum d’administrations. Nous proposons de créer des nanoparticules mixtes entre PLGA et pβCD dans le but d’optimiser la combinaison de molécules incorporée tout en conservant l’activité antibactérienne intrinsèque des pβCD. Dans ce contexte nous allons aussi optimiser et caractériser au niveau moléculaire et cellulaire l’effet antibactérien des pβCD.

Les lymphocytes T CD4 + sont les principales cibles de l’infection par le VIH-1. Le virus est reconnu par les senseurs du système immunitaire inné dès son entrée dans les cellules cibles, conduisant à la production de cytokines antivirales et pro-inflammatoires. Cependant, l’infection des lymphocytes T CD4 + par le VIH-1 conduit à une production extrêmement faible d’IFN qui ne permet pas une activation suffisante de la réponse antivirale, suggérant que le virus est capable de bloquer cette réponse qui serait délétère pour sa réplication.

L’autophagie est une voie catabolique majeure impliquée dans plusieurs fonctions cellulaires importantes. Notamment, c’est un mécanisme d’immunité intrinsèque car il permet la dégradation des agents pathogènes après leur entrée dans les cellules cibles. De plus, l’autophagie permet la dégradation de plusieurs médiateurs de l’immunité innée permettant un retour à un état basal du système immunitaire après son activation suite à une infection. Par conséquent, les agents pathogènes ont développé des mécanismes leur permettant de bloquer l’autophagie ou de l’utiliser à leur propre profit afin de favoriser leur réplication. En particulier, de plus en plus d’études montrent que les virus utilisent l’autophagie pour bloquer la réponse IFN. Dans ce contexte, les mitochondries et les peroxisomes sont deux organelles cellulaires impliquées dans la réponse immunitaire innée et qui sont ciblées par l’autophagie au cours d’infections virales.

Nous avons montré que les protéines d’enveloppe du VIH-1 (Env) induisent l’autophagie dès la phase d’entrée du VIH-1 dans les LT CD4+ mais ce processus est rapidement bloqué et inhibé dans ces cellules lorsque l’infection devient productive, suggérant que le VIH-1 a développé des stratégies pour le contrôler. De façon intéressante, nos résultats préliminaires indiquent que l’autophagie, induite transitoirement à l’entrée du virus dans les LT CD4+, favorise sa réplication. Récemment, nous avons montré que les peroxysomes sont des cibles de l’autophagie induite par Env (mécanisme appelé « pexophagie »). De plus, nos résultats (non publiés) suggèrent que les mitochondries pourraient être ciblées par l’autophagie induite dans les phases précoces de l’infection des LT CD4+ par le VIH-1 (processus appelé « mitophagie »). Ces deux organelles, mitochondries et peroxysomes, sont d’important médiateurs de la réponse au stress oxydatif.

Notre projet a pour objectif de caractériser plus en avant les processus de mitophagie et de pexophagie induits dans les étapes précoces de l’infection par le VIH-1 et de définir leurs conséquences sur la réponse immunitaire contre ce virus. Il se décline en 3 grandes étapes :

– Etude de la dynamique de dégradation des mitochondries et des peroxysomes dans les premières étapes de l’infection par le VIH-1.

– Recherche des mécanismes d’autophagie sélective impliqués dans la dégradation des mitochondries et des peroxysomes.

– Effet de la dégradation des mitochondries et des peroxysomes sur l’état oxydatif de la cellule infectée et conséquences sur l’homéostasie cellulaire, la réponse immunitaire innée et l’inflammasome.

Plusieurs travaux font état du rôle de l’autophagie au cours de l’infection par le VIH-1 dans différents contextes cellulaires mais aucune étude n’a mis en évidence son rôle dans les 1ères étapes du cycle de réplication du virus dans les LT CD4+. Il est donc important de progresser dans cette compréhension afin de pouvoir proposer, à plus long terme, de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur la réponse cellulaire.

La mutation responsable de la dystrophie musculaire rare LGMD1F (limb girdle muscular dystrophy 1F) est une délétion d’un seul nucléotide dans le codon stop de la transportine 3 (TNPO3). Cette mutation conduit à une extension de la protéine en C-ter sur 15 acides aminés, produisant une protéine de fonction inconnue (TNPO3_mut) qui est co-exprimée avec la protéine TNPO3 sauvage (TNPO3_wt). TNPO3 a été impliquée dans le transport nucléaire de protéines riches en sérine / arginine, telles que les facteurs d’épissage alternatif, ainsi que dans l’infection par le VIH-1 en agissant sur la capside virale. Nos données préliminaires montrent que cette mutation génétique rare confère une protection contre le VIH-1 in vitro, faisant de cette mutation la deuxième anomalie génétique décrite jusqu’à présent qui confère une forte résistance à l’infection par le VIH-1. L’objectif du projet est d’approfondir notre compréhension de l’impact de TNPO3 sur le VIH-1 en se basant sur les patients LGMD1F. Premièrement, nous visons à comprendre le fonctionnement de cette forme mutante de TNPO3 et à évaluer son impact sur les fonctions cellulaires: examiner si TNPO3_mut a un effet dominant négatif sur TNPO3, la distribution cellulaire de TNPO3 et des facteurs d’épissage, la structure du cytosquelette et les modifications post-traductionnelles des microtubules dans les cellules de patient et en lignées cellulaires modèles de la maladie. Deuxièmement, en utilisant la mutation LGMD1F comme modèle, nous étudierons les mécanismes d’interférence sur l’infection par le VIH: identifier l’étape du cycle viral bloquée par TNPO3, examiner l’effet de la mutation sur le transport de la capside et l’induction de l’IFN, caractériser la localisation des provirus intégrés dans la topographie nucléaire et le paysage d’intégration dans les cellules TNPO3_mut. Si les objectifs du projet sont atteints, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’inhibition de l’infection VIH par la TNPO3 défectueuse chez les patients LGMD1F. D’un point de vue technique et translationnel, notre projet développera des techniques innovantes (BRET, CRISPR / Cas9 FISH de provirus intégrés) qui pourraient ouvrir de nouvelles possibilités de recherche.

L’intégration du génome du rétroviral dans la cellule infectée est une étape clé du cycle réplicatif permettant de pérenniser l’infection. L’interaction fonctionnelle entre l’intasome (complexe formé entre l’ADN viral et l’intégrase, IN) et le nucléosome, complexe final siège de l’intégration, constitue le premier point de contact entre le génome viral et cellulaire. Cette association représente, ainsi, une plateforme d’échanges moléculaires entre le virus et l’hôte. Notre projet vise par une combinaison d’approches biochimiques, fonctionnelles et cellulaires, à définir les interfaces entre le complexe d’intégration du VIH-1 et son substrat cellulaire nucléosomal afin de comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu au sein de cette plateforme d’échanges.

Dans ce travail, nous i) caractériserons les interfaces physiques et fonctionnelles entre l’intasome et le nucléosome humain dans un contexte de nucléosome isolé mais aussi dans le cadre de differentes structures chromatiniennes ; ii) déterminerons comment ces interfaces sont régulées par les facteurs cellulaires précédemment identifiés (cofacteurs de l’IN, structure et remodelage de la chromatine, machineries associées à la transcription) ; iii) développerons la première approche thérapeutique ciblant spécifiquement les interfaces intasome/nucleosome par la technique Alphascreen.

Ce projet permettra notamment de déterminer comment cette association intasome/nucléosome peut affecter le choix du site d’insertion de l’ADN viral, l’efficacité d’intégration et de réplication du virus ainsi que le développement d’approches thérapeutiques innovantes. Notre travail constituera ainsi la première caractérisation d’envergure du complexe intasome/nucléosome, intermédiaire central de l’intégration et de la réplication virale.

L’intestin est un compartiment clé pour la réplication du VIH-1, dès les stades précoces de l’infection, entraînant une déplétion profonde des lymphocytes T CD4+ dans la muqueuse intestinale, notamment les cellules productrices d’IL-17 (Th17, Th1Th17) qui jouent un rôle central dans l’homéostasie muqueuse.

Dans l’étude ANRS EP44, nous avons observé un défaut de reconstitution des lymphocytes T CD4+ dans la muqueuse intestinale sous traitement antirétroviral, en particulier des Th17 et Th1Th17, notamment du fait d’altérations du recrutement des lymphocytes T CD4+ du sang vers le compartiment intestinal.

La caractérisation virologique réalisée chez les individus de l’étude ANRS EP44 a révélé la persistance d’une fraction augmentée de T CD4+ hébergeant de l’ADN VIH-1 par rapport aux T CD4+ sanguins, la persistance d’une production virale résiduelle, et une compartimentation des populations virales dans l’intestin chez plus de 75% des individus étudiés.

Le projet proposé a pour objectif de mieux caractériser les cellules cibles du VIH-1 dans la muqueuse intestinale, notamment en fonction du tropisme d’utilisation des corécepteurs CCR5 et CXCR4. Nous avons développé un modèle d’histocultures de tissu intestinal humain permettant d’étudier l’infection des différentes sous-populations de T CD4+ dans le micro-environnement tissulaire muqueux. Nos résultats préliminaires montrent que les virus utilisant CCR5 infecteraient préférentiellement les T CD4+ CCR6+, en particulier les Th1Th17 et Th17, alors que les virus utilisant exclusivement CXCR4 cibleraient préférentiellement les T CD4+ CCR6-. Nous chercherons à mieux caractériser les sous-populations de T CD4+ ciblées par les virus utilisant CCR5, notamment les Th17, Th1Th17, Th22 ainsi que les sous-populations de Treg CCR6+ vs. CCR6-, et à comparer les cinétiques d’infection entre ces sous-populations. Nous chercherons également à préciser les sous-populations ciblées préférentiellement par les virus utilisant CXCR4, et à mieux comprendre les facteurs de susceptibilités à l’infection entre ces sous-populations T CD4+ en fonction du tropisme viral.

La caractérisation des cellules cibles du VIH-1 dans la muqueuse intestinale, et les différences de susceptibilités selon le tropisme viral pour CCR5 ou CXCR4 pourraient permettre de mieux comprendre le rôle de ce compartiment dans la sélection des virus utilisant CCR5 observée aux stades précoces de l’infection. Ce projet pourrait également avoir des implications concernant la persistance du VIH-1 sous traitement antirétroviral.

TLR7 et TLR8 sont des récepteurs Toll dont les gènes sont codés sur le chromosome X. Ils sont présents dans les endosomes et sont activés par des séquences d’ARN simple brin provenant de virus comme le VIH-1. Ils sont exprimés simultanément par les lymphocytes T  (LT) CD4+ et les monocytes, et l’interaction entre VIH-1 et TLR7 ou TLR8 peut avoir des impacts fonctionnels distincts sur les LT CD4+ humains ou les monocytes. En particulier, il a été récemment montré que la stimulation des LT CD4+ humains avec des ligands de TLR8 amplifie l’activation via le TCR, la production de cytokines pro-inflammatoires et promeut leur différenciation en cellules effectrices Th1/Th17. L’activation de TLR8 favorise la réplication du VIH-1 et induit la réversion de la latence dans les LT CD4+ de patients VIH+ avirémique. Nous avons établi que TLR8, comme TLR7, sous leur forme clivée active, sont bien exprimés dans les LT CD4+ d’hommes et de femmes. En visualisant les transcrits primaires en RNA FISH, nous avons démontré que le gène TLR8, comme TLR7, échappe à l’inactivation du chromosome X dans les LT CD4+ et les monocytes, et présentent également un profil d’expression distinct sur le chromosome X actif, co-dépendant chez les femmes, et mutuellement exclusif sur l’X des hommes. Par conséquent, à l’échelle unicellulaire les cellules exprimant les deux gènes simultanément sont 7-fois moins fréquentes chez les hommes comparées aux femmes. Ces résultats indiquent que les gènes TLR7 et TLR8 forment un cluster de gènes corégulés que nous avons appelé « X-linked Toll-like receptor locus » (Youness et al., soumis). La prise en compte du sexe dans l’analyse des interactions VIH-1/LT CD4 nous apparait donc essentiel, ce qui curieusement n’a jamais été pris en considération jusqu’à présent.

            Nos objectifs seront d’étudier 1) s’il existe un biais du sexe dans l’infection par le VIH-1 dans les cellules T CD4+ et 2) si l’expression bi-allélique de TLR8 dans les LT CD4+ de femmes leur donne un avantage dans l’infection et/ou la réversion de la latence des LT CD4+ infectées.

            Ce projet s’articulera autour de 3 objectifs spécifiques :

1) Impact de l’activation de TLR8 sur la permissivité à l’infection par le VIH-1 des LT CD4+ activés en fonction du sexe

2) Rôle de TLR8 dans l’infection VIH-1 dans les LT CD4+ provenant d’un tissu lymphoïde, les amygdales, en fonction du sexe

3) Impact de l’activation de TLR8 sur la réversion du VIH-1 latent dans les LT CD4+ en fonction du sexe.

            Notre hypothèse de travail est que le bais de sexe dans l’infection VIH-1 pourrait être lié à un biais de sexe dans la susceptibilité à l’infection productive des LT CD4+ et/ou à un biais de sexe dans l’établissement du réservoir latent. Cette différence liée au sexe pourrait être intrinsèque aux LT et dû à l’expression différentielle du récepteur TLR8 codée par l’X entre les cellules T CD4+ d’hommes et de femmes. Une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les facteurs biologiques liés au sexe impactent l’inversion de la latence et la persistance du VIH-1 pourrait promouvoir le développement d’approche thérapeutique spécifique à chaque sexe.

Le zinc est un oligo-élément essentiel utilisé comme cofacteur par de nombreuses enzymes qui peuvent se structurer en des motifs particuliers appelés doigts de zinc. Le zinc naturel se présente sous la forme d’un mélange de 5 isotopes stables avec des abondances relatives variables. Le fractionnement isotopique du zinc correspond à une modification des rapports de ces abondances. Ce phénomène a déjà été observé dans plusieurs conditions physiologiques et pathologiques tels que certains cancer ou les maladies neurodégénératives. Le HIV-1 code pour une protéine de nucléocapside (NCp7) de 7 kDa comprenant deux motifs à doigts de zinc avec une très haute affinité. Les atomes de zinc étant nécessaires à l’activité de NCp7 et au bon déroulement du cycle viral, ils ont été la cible de nombreuses stratégies antivirales. Cependant, aucune étude à ce jour ne s’est intéressée au fractionnement isotopique au cours de l’infection virale.

Dans cette étude, nous souhaitons atteindre 3 objectifs :

(1) Mesurer le fractionnement isotopique du zinc dans les particules virales

(2) Déterminer l’influence d’une dérégulation de la composition isotopique naturelle du zinc sur la production du virus HIV-1 et son caractère infectieux

(3) Déterminer et comparer les caractéristiques biochimiques de protéine NCp7 synthétique contenant différents isotopes du zinc.

Nos résultats préliminaires nous ont déjà permis de montrer un fractionnement isotopique du zinc dans les particules virales HIV-1 purifiées comparées au milieu intra et extracellulaire. Nous souhaitons donc dans un premier temps valider ces résultats dans différents modèles cellulaires (0-6mois). Ensuite les objectifs 2 et 3 pourront être menés de front et de manière indépendante. Nous comptons produire du virus dans des conditions où nous aurons modifié l’abondance naturelle des isotopes du zinc en ajoutant au milieu de culture un isotope enrichi disponible commercialement (6-24mois). En parallèle, la protéine NCp7 sera produite par la plateforme SFR Biosciences (0-6mois), puis des tests in vitro seront réalisés afin d’étudier ses propriétés biochimiques en présence de différents isotopes du Zinc (6-24 mois).

Ce projet est original et innovant et il pourrait mener à considérer les isotopes du Zinc comme biomarqueurs de l’infection par le HIV-1 et même ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Enfin, nous pourrions étendre ces études à d’autres modèles viraux ainsi qu’à d’autres cellules immunitaires (macrophages, cellules primaires, etc.).