Winning projects and candidates

L’équipe de Gilles Travé a mis au point une protéine de fusion chimère ciblant simultanément deux surfaces d’interaction de E6. Cette construction bifonctionnelle composée du domaine PDZ fusionné au motif LxxLL est capable de se lier à toutes les protéines E6 avec une affinité proche du nanomolaire, et de provoquer l’apoptose des cellules infectées par HPV16 et HPV18. En utilisant toutes les données structurales et fonctionnelles issues des travaux de l’équipe de Gilles Travé, le projet consistera à caractériser et améliorer la spécificité et l’affinité de cette construction anti-E6, et à tester ces effets cellulaires par différentes approches. 1) D’une part, nous chercherons encore à renforcer l’affinité du motif LxxLL de E6AP pour E6, en fusionnant au peptide LxxLL une zone d’interaction potentielle secondaire à E6 qui a été révélée par des prédictions de repliement alpha. Différents peptides de fusion seront synthétisés, avec différentes tailles de linker séparant le motif LxxLL du site secondaire. Les affinités pour E6 seront déterminées par SPR-BIAcore et comparées aux affinités obtenues avec le peptide LxxLL. La construction présentant la meilleure affinité pour E6 sera retenue pour la suite du projet. 2) Ce nouveau peptide, e6ap(1-2), sera ensuite intégré dans les constructions chimériques, pour générer des fusions monomères et tétramères e6ap(1-2). Les affinités pour la protéine E6 seront mesurées par SPR-BIAcore et cFP. Sachant que l’affinité de la chimère PDZ-LxxLL initiale était d’environ 10 nM, nous espérons, avec ces nouvelles constructions, obtenir des affinités sub-nanomolaires, voire se rapprochant du picomolaire. 3) Ces nouvelles constructions chimériques seront testées pour leurs activités dans les cellules, dans différentes lignées HPV+. Ils seront délivrés soit sous forme d’ARN messagers. Les efficacités relatives de chaque construction à bloquer l’activité intracellulaire de E6 et à induire le processus d’apoptose dans les différentes lignées cellulaires seront suivies par des marqueurs appropriés et quantifiées.

L'infection par le virus de l'hépatite B (VHB) reste un problème global majeur de santé publique. Des vaccins thérapeutiques efficaces et des traitements antiviraux ont actuellement disponibles, mais ils doivent être pris à vie et ne parviennent pas à éradiquer le virus du foie infecté. La recherche de nouvelles cibles thérapeutiques est en continuel développement. Certaines de ces nouvelles approches visent à réduire la sécrétion de pseudo-particules virales (SVPs; subviral particles) et/ou de virions, tous deux porteurs de l'antigène de surface du VHB (AgHBs), dont la perte spontanée ou induite par traitement a été associée à un meilleur pronostic clinique. Cependant, l'accumulation intracellulaire de protéines d’enveloppe mutées a été associée à un risque pro-oncogène accru. Il semble important que de futurs traitements réduisant la sécrétion d'AgHBs n’entraînent pas son accumulation intracellulaire. Il est donc essentiel d'approfondir les connaissances sur les mécanismes moléculaires qui confèrent à la petite protéine de surface S du VHB (SHBs) la capacité intrinsèque de s'auto-assembler en structures oligomères complexes constituant l'élément structurel majeur des SVPs et de l’enveloppe des virions.

      Des études suggèrent que la boucle cytosolique 1 (CYL-1) de SHBs aurait un rôle important dans la morphogenèse et la sécrétion des SVPs, qui constituent la majeure partie du pool d'AgHBs. L'étude proposée vise à caractériser l'implication des motifs moléculaires et structurels spécifiques de CYL-1 et leur fonction dans l'oligomérisation et le trafic intracellulaire des protéines S conduisant à la sécrétion extracellulaire des SVPs, en étudiant les mutations aux positions sW35R, sW36R/G, sS38F/W, sC48H/Y/W, sH60C/Y, sC65G/H/R/S, sC69H/R/W et sM75T, précédemment associées à une rétention intracellulaire de l'AgHBs. L'effet des mutations sur la sécrétion de l'AgHBs sera confirmé in vitro dans des cellules Huh7 et HepG2 transfectées avec des plasmides recombinants exprimant soit les SHBs seules, soit inclues dans la protéine de surface longue du VHB (LHBs), un composant mineur des SVPs. L'oligomérisation et la localisation subcellulaire des SHBs mutées et sauvages (WT) seront étudiées dans des cellules transfectées à l'aide des techniques de microscopie en immunofluorescence confocale, et d’imagerie FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy), TEM (Transmission Electron microscopy) et FCS (Fluorescence correlation spectroscopy). Le niveau de stress du réticulum endoplasmique et l'efficacité de l'activation de la réponse UPR (Unfolded Protein Response) induite par l'accumulation de mutants CLY-1 seront étudiés in vitro. Nous émettons l’hypothèse que les mutants CYL-1 pourraient interférer avec les composants de la voie ERAD (ER-associated degradation) de l’UPR et la voie de l’autophagie afin d'échapper à la dégradation, et les mécanismes moléculaires potentiellement impliqués seront explorés. L'impact de mutants CYL-1 sur l'inflammation hépatique et le développement de la fibrose sera étudié in vivo dans un modèle murin, à l'aide du vecteur adénovirus-associé hépatotrope AAV2/8 et d'une lignée de souris transgéniques VHB. La nature et l'étendue de l'environnement pro-inflammatoire et des lésions hépatiques associés à la rétention de l'AgHBs dans les hépatocytes seront évaluées dans les tissus hépatiques animaux.

      L'analyse fonctionnelle des mutants CYL-1 altérant la production/sécrétion de l'AgHBs permettra d'approfondir les connaissances sur les motifs moléculaires et structurels de CYL-1 et leurs fonctions dans les premières étapes de l'oligomérisation et/ou dans le trafic intracellulaire des protéines S conduisant à la libération extracellulaire des pseudo-particules virales. La caractérisation des éléments critiques de CYL-1 pourrait faciliter le développement de nouvelles cibles thérapeutiques. L'accumulation intracellulaire de protéines virales étant un facteur pro-oncogène potentiel, il semble essentiel d'évaluer dans quelle mesure l'altération de la structure/fonction de CYL-1 peut contribuer à échapper au mécanisme de dégradation des protéines en interférant avec les mécanismes ERAD et de l’autophagie.

Les virus responsables du SIDA, HIV-1 et HIV-2, ont développé des protéines dîtes auxiliaires afin d’échapper aux défenses immunitaires de l’hôte. Ces protéines virales inactivent les facteurs de restriction qui inhibent la réplication virale. Ainsi, Vpx, qui appartient à la lignée lentivirale HIV-2/SIVsmm, augmente l’infection virale en induisant la dégradation du facteur cellulaire SAMHD1. La dégradation de SAMHD1 ne permet pas d’expliquer l’ensemble des phénotypes associés à Vpx, ce qui nous a conduit à rechercher de nouvelles protéines cellulaires ciblées par cette protéine virale Vpx. Suite à un crible protéomique, nous avons identifié le complexe HUSH en tant que nouvelle cible de Vpx, un complexe composé des protéines Tasor, MPP8 et periphilin, et qui est impliqué dans la répression épigénétique de transgènes. Nos résultats montrent une diminution de l’expression de HUSH dans les cellules primaires et dans les cellules infectées par un virus HIV-2 qui exprime Vpx. Vpx interagit avec HUSH et induit sa dégradation par le protéasome, via le recrutement d’une ubiquitine ligase assemblée par DCAF1. De ce fait, Vpx est capable de réactiver des virus latents dans un modèle de latence, contrairement à des mutants de Vpx incapables d’assurer la dégradation de HUSH. De plus, nous avons montré que la fonction d’antagonisme de HUSH est spécifique de protéines virales issues de certaines espèces de singe. L’ensemble de nos résultats révèle que HUSH est un facteur de restriction au même titre que SAMHD1, actif dans les cellules T primaires CD4+ et contrecarré par Vpx.

Notre hypothèse est donc que HUSH représente un facteur additionnel clé de la latence virale chez les individus infectés par les virus HIV. Le projet présenté vise à étudier le rôle de la restriction HUSH dans la pathogénèse chez le patient. Dans cette optique, trois axes sont proposés :

1- Identification d’un peptide ou molécule qui induirait la dégradation de HUSH.

Le but ultime de cet axe est de tester si l’inactivation de HUSH peut permettre de réactiver des virus latents présents dans les cellules de patients infectés. Malheureusement, l’outil « Vpx » ne permet pas d’aborder cette question car le simple fait de « transfecter » ou « transduire » des cellules les active et réveille les virus indépendamment de la présence de toute protéine virale. Ainsi, mimer l’activité de Vpx avec un peptide ou molécule pourrait constituer une alternative pour valider nos conclusions sur des échantillons cliniques.

2- Etude de protéines Vpx issues de patients HIV-2 à différents stades de la maladie afin d’établir une corrélation potentielle entre l’inactivation de HUSH et la pathogénèse.

Nous faisons l’hypothèse que l’évolution de la maladie chez des patients infectés par le virus HIV-2 pourrait dépendre (entre autres) de variations au niveau des séquences de Vpx qui auraient un impact sur la dégradation de HUSH.

3- Etude d’une corrélation potentielle entre l’activité de HUSH et la virémie chez les patients infectés par HIV-1 ou HIV-2.

Nous proposons d’étudier s’il existe une corrélation entre l’activité de HUSH, mesurée via l’expression des gènes cibles de HUSH (dont l’expression est favorisée si HUSH est inactivée) et les taux d’ARN viral plasmatique (rapportés aux charges d’ADN viral intégré).

Nous espérons que l’ensemble de nos résultats permettra de caractériser le rôle de la restriction HUSH chez les patients infectés.

Les troubles psychiatriques sont très fréquents chez les sujets injecteurs de drogues et sont associés à un retard à l’accès aux soins, une moindre efficience des prises en charge, un risque accru de pratiques à risques vis-à-vis du VIH et du VHC, une moindre qualité de vie et globalement, une morbidité et une mortalité accrues. Dans les pays en développement, le système sanitaire n’est le plus souvent pas en mesure de répondre aux besoins psychiatriques des populations clés en termes d’exposition au VIH. Une littérature croissante met en évidence l’importance de développer des interventions innovantes, notamment à soutien communautaire, permettant un accès aux soins psychiatriques dans la perspective de répondre aux objectifs de l’ONUSIDA (90-90-90) en matière de VIH et d’une prise en charge globale et intégrée.

Le projet DRIVE-Mind 2 a pour objectif de montrer l’impact d’une intervention psychiatrique communautaire durable sur l’exposition virale et la santé mentale d’une population à haut risque constituée de sujets injecteurs de drogues dans la ville de Haiphong, Vietnam. Il souhaite en particulier  mettre en évidence que ce type d’intervention est associé à une amélioration de l’ensemble des indicateurs clés dans cette population lorsqu’une intervention durable est proposée, à un niveau comparable à ce qui est observé dans une population similaire, initialement indemnes de troubles psychiatriques.

Pour cela, l’ensemble des patients de la cohorte DRIVE-Mind 1 (224 sujets), initiée en mars 2019 et qui avait pour objectif de montrer la faisabilité de mise en place d’une intervention psychiatrique communautaire auprès de personnes usagères de drogues présentant un trouble psychiatrique (dépression, syndrome psychotique, risque suicidaire) dans la même ville, seront rappelés. Il leur sera proposé d’être à nouveau inclus dans un suivi de cohorte de 12 mois et d’être évalués à M0, M6 et M12 pour leur exposition virale, leur usage de drogue, leur santé mentale et leur qualité de vie. L’exposition virale sera mesurée par une variable composite incluant l’injection, les pratiques à risques lors de l’injection, les rapports sexuels non protégés, l’instauration ou non d’un traitement par méthadone, reflétant au mieux le risque d’exposition virale dans cette population. Un groupe contrôle, constitué de 200 sujets VIH + et de 200 sujets VIH – identifiés comme indemnes de troubles psychiatriques lors de la visite de la cohorte DRIVE ayant permis le recrutement de la cohorte DRIVE-Mind 1, seront également recrutés pour servir de population de référence pour les variables évaluées.

Ce projet impliquera les même acteurs que ceux impliqués dans le projet DRIVE et le projet DRIVE-Mind 1 : le département de santé publique de la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Haiphong, le département de santé mentale de l’hôpital Universitaire de Haiphong, l’association vietnamienne non gouvernementale SCDI, l’Université de Montpellier, l’Université de New-York et le CESP/Inserm U1018. Le suivi de cohorte sera initié en Février-Mars 2021 pour une période de 12 mois.

Le virus de l’hépatite delta (VHD) est le plus petit des virus pathogènes pour l’homme. Comme il utilise la glycoprotéine d’enveloppe du virus de l’hépatite B (HBsAg) pour produire ses propres virions, l’infection par le VHD nécessite une co-infection par le VHB. Si la vaccination contre le VHB permet de prévenir l’infection par le VHD, on estime qu’entre 40 et 70 millions de personnes sont co-infectées chroniquement par ces deux virus. La co-infection par VHD augmente fortement le risque d’évolution vers la cirrhose et le cancer du foie. Le génome du VHD ne codant pas d’enzyme spécifique, il est impossible de développer un antiviral classique à action directe et il n’existe toujours pas de traitement satisfaisant. L’hépatite D représente ainsi un problème majeur de santé publique et les espoirs se tournent vers le développement d’approches thérapeutiques innovantes. C’est dans ce contexte que les équipes VIRIMI et HepVir (CIRI, Lyon) se sont lancées dans un programme de criblage pour identifier des molécules pouvant inhiber la réplication du VHD.

Ces efforts ont permis l’identification d’un nouvel inhibiteur non-nucléosidique du VHB et du VHD. Cette molécule, appelée APY1, appartient à une série chimique structurée autour d’un squelette alkoxypyrazole et développée à l’origine pour d’autres applications en collaboration avec le groupe d’Yves Janin (MNHN; Paris). L’activité antivirale d’APY1 a été établie sur des cultures de cellules HepaRG et d’hépatocytes humains primaires (PHH) co-infectés par le VHB et le VHD. Si APY1 réduit in vitro tous les paramètres virologiques du VHB (sécrétion d’HBsAg/HBeAg, ARN viral intracellulaire et sécrétion de virions), cette molécule inhibe de façon particulièrement efficace la production de particules infectieuses du VHD avec une IC50 de 1-2 microM. Dans le but de développer cette molécule comme antiviral contre le VHD, nous avons obtenu récemment un contrat d’initiation auprès de l’INSERM-Transfert et de la SATT Pulsalys pour l’optimisation pharmacologique de cette molécule (relations structure/activité et ADME-Tox). En complément de ce programme de chimie médicinale, le projet ANRS que nous proposons, plus fondamental et cognitif, vise à préciser le mode d’action de cette molécule et à identifier sa cible, qu’elle soit virale ou cellulaire.

Nous allons ainsi étudier en détail l’impact d’APY1 sur la production des particules VHD (WP1). Nous chercherons tout d’abord à dissocier les effets d’APY1 sur le VHD de ceux observés sur le VHB. Par des approches de protéomique, lipidomique et de séquençage à haut débit, nous analyserons également l’effet d’APY1 sur la composition des particules VHD sécrétées. Nous espérons identifier ainsi les raisons de leur perte d’infectivité spécifique. Afin de préciser quelle étape du cycle viral est la cible d’APY1 (WP2), nous étudierons son impact sur l’expression intracellulaire, la stabilité et le trafic des protéines virales. Nous caractériserons également l’effet d’APY1 sur les acides nucléiques viraux en étudiant la transcription et la stabilité des ARNm viraux et la persistance des génomes viraux dans les cellules co-infectées. Enfin (WP3), nous utiliserons différentes approches “omiques” non biaisées pour caractériser l’effet de l’APY1 sur le transcriptome, le protéome et le métabolome pour comprendre les effets d’APY1 sur le VHD mais aussi sur les voies cellulaires. En parallèle, la technologie PISA (Proteome Integral Solubility Alteration) sera utilisée pour identifier les protéines virales ou cellulaires interagissant directement avec APY1. Ces approches fourniront des informations essentielles pour caractériser le mode d’action et identifier la cible de cette molécule.

L’ensemble de ce projet permettra d’une part de préciser les effets d’APY1 sur le cycle viral pour valider l’intérêt de cette série chimique comme inhibiteur du VHD, et d’autre part de caractériser son mode d’action. De façon plus générale, ce projet devrait conduire à l’identification de nouveaux mécanismes essentiels à la production de particules infectieuses de VHD et qui représentent autant de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.