Winning projects and candidates

L’infection chronique par HBV (CHB) augmente fortement le risque d’hépatocarcinome. Or, les traitements actuels du CHB ne sont pas curatifs car ils ne permettent pas d’éliminer l’ADN viral nucléaire épisomique (ADNccc) qui est responsable du rebond viral à l’arrêt des traitements. L’ADNccc sert de matrice à la transcription des ARNs viraux dont l’ARN prégenomique qui est  encapsidé et rétrotranscrit en ADN dans le cytoplasme, créant ainsi un cycle de renouvellement du pool d’ADNccc. Dans le but de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à éliminer le virus, il est important d’élucider les mécanismes contrôlant la transcription du cccDNA.

L’organisation spatiale tri-dimentionnelle (3D) du génome joue un rôle important dans la régulation de l’expression des gènes. On ignore cependant encore si les virus à ADN, dont l’HBV, entrent en contact avec des régions spécifiques du génome de l’hôte et tirent parti de l’architecture 3D du génome pour recruter ou mobiliser des facteurs nécessaires à leur propre réplication/transcription.

En utilisant des approches de «Chromosome Conformation Capture » (Hi-C) et de capture de l’ADN viral (CHi-C) à partir d’hépatocytes humains primaires (PHH) infectés par HBV, nous avons montré qu’HBV contacte préférentiellement la chromatine active au niveau des ilots CpG (CGIs). Les CGIs sont enrichis en facteurs Cfp1, un facteur qui est recruté sur l’ADNccc et qui est nécessaire à sa transcription. Enfin, nous avons également observé que les gènes associés aux CGIs contactés par HBV correspondent aux gènes dont l’expression est dérégulée dans les PHH infectés. Ces données suggèrent qu’HBV contacte préférentiellement des régions spécifiques de la chromatine active car elles offrent vraisemblablement un environnement favorable à sa propre transcription. De plus nos données suggèrent qu’HBV interfère avec l’expression des gènes cellulaires à travers des contacts ADN viral/ ADN Cellulaire (Moreau et al, Nature Comm., in press).

Le but de notre projet est de déterminer quels sont les mécanismes impliqués dans l’adressage de l’ADN de l’HBV à la chromatine active et d’en comprendre les conséquences fonctionnelles notamment au niveau de la transcription de l’ADNccc et de la dérégulation de l’expression des gènes cellulaires.

Dans ce but, par des approches de capture virale CHi-C, d’imagerie et d’immunoprécipitation de la chromatine et de séquençage (ChIP-seq) nous déterminerons le rôle des facteurs cellulaires Cfp1 et CTCF et de la protéine virale HBc dans le positionnement de l’ADN d’HBV aux CGIs. Nous  déterminerons également l’importance de ce positionnement aux CGIs dans la transcription de l’ADNccc. En parallèle, par des approches de capture HI-C (CHI-C) à partir de PHH infectés par l’HBV sauvage ou déficient pour l’expression d’HBc, nous rechercherons si HBV dérégule l’expression des gènes cellulaires en perturbant l’organisation 3D des CGIs, agissant ainsi comme un dérégulateur spatial de l’expression des gènes. Nous déterminerons si la dérégulation de l’expression des gènes corrèle alors avec des modifications épigénétiques comme la méthylation de l’ADN ou la déposition de marques répressives H3K27me3. 

L’objectif général du projet est d’identifier des cibles thérapeutiques permettant d’éradiquer le réservoir viral.

Le virus de l’hépatite E (VHE) est un pathogène majeur associé à l’hépatite virale aiguë dans le monde. L’infection par le VHE peut évoluer vers la chronicité chez 47 à 66% des patients immunodéprimés, avec un risque de cirrhose. Le VHE se réplique principalement dans le foie mais une réplication extra-hépatique a été observée dans le système nerveux central et l’intestin.

Nous avons développé un modèle porcin d’infection chronique par le VHE qui a permis d’observer une persistance de l’ARN du VHE dans l’intestin et le colon au cours de l’infection chronique. Ces résultats sont en faveur d’une réplication intestinale du VHE au cours de l’hépatite E chronique. Par ailleurs, nous avons observé une compartimentalisation des génomes du VHE entre le sang et les fèces de certains patients chroniquement infectés par le VHE. Cette compartimentalisation a également été observée pour l’ensemble des porcs chroniquement infectés par le VHE. Elle pourrait reposer sur une compartimentalisation du VHE dans l’intestin. Ces résultats soulignent la nécessité de caractériser et de modéliser la pathogenèse du VHE sur l’intestin humain.   

Le premier objectif de ce projet est de confirmer la réplication intestinale du VHE au cours de l’infection chronique et d’identifier les sites préférentiels de réplication dans l’intestin par qRT-PCR et hybridation in situ (équipe A&B). Le second objectif est de caractériser les populations virales présentes dans l’intestin et dans le foie, par séquençage haut débit (équipe A). Ces résultats permettront de clarifier le rôle respectif des compartiments intestinaux et hépatiques dans la pathogenèse de l’hépatite E.

Le troisième objectif de ce projet est de mettre au point un modèle in vitro d’organoïdes d’intestin humain infecté par le VHE. Ce modèle unique, mimant l’épithélium intestinal polarisé, se caractérise par une expression de l’ensemble des types cellulaires de l’épithélium intestinal. Ce modèle constituera un jalon dans la recherche sur la pathogenèse du VHE. Il permettra d’étudier les interactions virus-hôte, la morphogenèse, la réponse immunitaire innée et d’identifier de nouveaux antiviraux, dans le contexte du compartiment intestinal.

Le virus de l’hépatite E (VHE) est responsable de la majorité des cas d’hépatites aigües et de jaunisse dans le monde. Chaque année, 20 millions de personnes sont infectées et environ 60000 en décèdent. Le VHE représente un problème de santé publique à la fois pour les pays en voie de développement et pour les pays développés. Dans les premiers la contamination se fait essentiellement par ingestion d’eau souillée par de matières fécales alors que dans les second la transmission est principalement zoonotique ou alors associée à des greffes d’organes et transfusions sanguines. En Europe, lors des 10 dernières années le nombre de cas reportés d’infection par le VHE a été décuplé. A l’exception d’un vaccin uniquement disponible en Chine, il n’existe à ce jour pas de traitement spécifique pour combattre cette infection. Le VHE est un petit virus icosaédrique (27-34nm), de la famille des Hepeviridae, qui contient une molécule d’ARN simple brin de 7.2kb. Les particules infectieuses sont nues dans les selles et la bile mais enveloppées lorsqu’elles circulent dans le sang, par des lipides provenant des exosomes des cellules infectées. Le VHE est donc un virus quasi-enveloppé. Son ARN génomique code pour 3 protéines : ORF1, ORF2 et ORF3. ORF1 possède les enzymes requises pour la réplication de l’ARN viral, ORF2 correspond à la protéine de capside et est un déterminant antigénique majeur ; enfin ORF3 est une petite protéine encore mal caractérisée. Elle possède deux régions hydrophobes ainsi qu’une région riche en proline qui est prédite désordonnée. ORF3 interagit avec de nombreuses protéines de l’hôte et virales. Elle pourrait être impliquée dans l’établissement d’un contexte cellulaire favorable au cycle du virus. ORF3 n’est pas directement impliquée dans la réplication de l’ARN viral et dans l’assemblage des virions mais est requise pour la sécrétion des particules infectieuses. Ce processus se fait via l’interaction avec la protéine Tsg101 du complexe ESCRT-I, laquelle est impliquée dans le bourgeonnement de plusieurs virus enveloppés, comme le VIH ou Ebola. ORF3 a été localisée au niveau des membranes intracellulaires et également de la membrane plasmique. Une insertion transmembranaire, associée à un processus d’oligomérisation, a été proposée pour ORF3 qui formerait alors une viroporine. Cependant, il a également été montré que l’association membranaire de ORF3 est liée à la palmitoylation de sa région riche en cystéine.

Afin de mieux comprendre le(s) rôle(s) que joue(nt) ORF3 dans le cycle du VHE nous souhaitons réaliser une étude structurale et fonctionnelle de cette protéine. Nous produirons cette protéine de manière recombinante puis étudierons sa structure 3D et sa dynamique, par RMN en solution. Nous chercherons à identifier l’ensemble des déterminants moléculaires qui participent à l’ancrage membranaire de ORF3 et testerons sa fonction potentielle de viroporine. Pour étudier ORF3 dans un contexte membranaire par RMN en solution, nous utiliserons notamment la technologie des nanodisques (bicouche lipidique stabilisée par une protéine d’assemblage). Nous visons à déterminer un modèle structural de la protéine ORF3 ancrée à la membrane. Ensuite, nous chercherons à mettre en évidence une potentielle interaction entre ORF3 et deux peptidyl-prolyl cis/trans isomérases humaines, CypA et FKBP12, qui ont récemment été impliquées dans la palmitoylation et l’ancrage membranaire de la protéine Tat du VIH. Enfin, nous caractériserons, toujours par RMN, les bases moléculaires de l’interaction de ORF3 avec la protéine Tsg101. Les résultats de ce projet devraient nous permettre de mieux appréhender le fonctionnement de ORF3 au cours du cycle du VHE, et pourraient, à plus long terme, être utilisés pour concevoir des inhibiteurs ciblant cette protéine ou ses interactions.

A l’heure où des antiviraux très efficaces ont été mis au point contre le virus de l’hépatite C (VHC), de multiples études de terrain montrent ceux-ci ne pourront pas suffire à atteindre l’objectif d’une éradication de l’hépatite C à l’échelle planétaire, et que la mise au point d’un vaccin prophylactique contre ce virus reste une priorité. Notre équipe développe un concept de vaccin original basé sur la genèse de particules vaccinales ressemblant à celles du vaccin contre le virus de l’hépatite B (VHB), mais présentant l’avantage d’exposer également les glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2 du VHC en leur surface. Un tel vaccin pourrait ainsi représenter un vaccin bivalent, protégeant à la fois contre le VHB et le VHC. De fait, les particules vaccinales, produites en cellules de mammifères, induisent chez les animaux immunisés la production d’anticorps dirigés contre les protéines d’enveloppe du VHB et du VHC, et notamment d’anticorps capables de neutraliser in vitro des souches de VHC de génotypes différents, avec une efficacité toutefois génotype-dépendante. Puisque l’état de glycosylation des protéines E1 et E2 a récemment été montré moduler leur immunogénicité, nous proposons de conduire une analyse comparative de l’immunogénicité de notre candidat vaccin, généré à l’aide de différents systèmes d’expression engendrant des processus de glycosylation distincts, notamment les modèles de levures et de cellules d’insecte. L’objectif de ces investigations est double : identifier un mode de présentation optimal des protéines d’enveloppe du VHC en surface de nos particules vaccinales, et se rapprocher d’un mode de production plus performant et plus simple pour favoriser le développement industriel d’un tel vaccin.