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La blennorragie ou gonorrhée est une infection sexuellement transmissible qui touche les femmes et les hommes. Elle est causée par la bactérie Neisseria gonorrhoeae ou « gonocoque ». L’incidence annuelle mondiale de cette infection est estimée à 86,9 millions d’adultes et une récente augmentation des cas, supérieure à 200 %, a été signalée dans l’Union européenne. N. gonorrhoeae infecte les sites urogénitaux, rectaux et/ou pharyngés. Les infections non traitées peuvent être responsables de graves complications, allant de l’épididymite et de la salpingite à la maladie inflammatoire pelvienne, à la grossesse extra-utérine et à la stérilité. En l’absence d’un vaccin contre le gonocoque, la gestion et le contrôle des infections reposent sur un traitement antimicrobien efficace, abordable et accessible, soutenu par une gestion clinique adéquate. Malheureusement, N. gonorrhoeae pose aujourd’hui un grave problème de santé publique puisqu’il est devenu hautement résistant à tous les antimicrobiens recommandés. Par conséquent, il est essentiel de réaliser des efforts concentrés sur la recherche sur ce germe afin de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques à cette infection.  

Jusqu’à présent, les chercheurs ont utilisé différents types de cellules eucaryotes et d’explants cellulaires pour étudier l’interaction de N. gonorrhoeae avec son hôte. Cependant, ces modèles ne reproduisent pas les conditions environnementales rencontrées par la bactérie in vivo, ce qui a probablement limité la compréhension complète de sa pathogénie. Aujourd’hui, les progrès dans la transcriptomique et la métabolomique ont révélé l’importance des conditions de culture et de croissance sur la physiologie bactérienne. In vitro, ces conditions ont un impact direct sur l’expression des gènes et sur le métabolisme et par voie de conséquence sur la croissance, la colonisation, la formation de biofilm et l’expression de bactériophages tempérés filamenteux. Par conséquent, nous pensons que le développement de modèles mimant au mieux les conditions in vivo sera bénéfique à une meilleure compréhension de la pathogénie des gonocoques ainsi qu’à la caractérisation de souches cliniques.

Dans ce “contrat d’initiation” d’un an, nous proposons de mettre en place de nouveaux modèles basés sur un fluide vaginal synthétique pour évaluer l’interaction de N. gonorrhoeae avec les cellules épithéliales et mieux mimer la niche vaginale normale. Ces modèles seront basés sur des précédentes études décrivant ce fluide vaginal synthétique. Nous mettrons en place deux modèles : un modèle de croissance planctonique et analyse du biofilm et un modèle d’interaction avec les cellules hôtes. Pour le premier modèle, nous préparerons un fluide vaginal synthétique modifié qui permettra la croissance bactérienne. Pour l’interaction avec les cellules hôtes, nous travaillerons dans des conditions de culture air-liquide, modèle qui a été développé pour les épithéliums pulmonaire et intestinal. Ce modèle permet l’étude de cellules recouvertes par une fine couche protectrice de mucus, comme c’est le cas chez l’hôte.

Pour mieux comprendre l’interaction de N. gonorrhoeae avec les cellules de l’hôte, ces modèles seront caractérisés en termes de croissance planctonique, de formation de biofilm, d’expression des bactériophages, de réponse des cellules épithéliales et nous mènerons une approche RNAseq, à la fois sur les bactéries et les cellules.

Ce projet, au-delà du développement de modèles innovants pour étudier la pathogénicité de N. gonorrhoeae, est l’occasion de mettre en place un programme de recherche fondamentale sur un pathogène peu étudié par les universitaires français. Nous pensons donc que, dans un contexte de compétition internationale et de résistance aux antibiotiques, ce projet nous permettra non seulement de développer de nouveaux modèles mais aussi de mettre en place de nouvelles collaborations avec des cliniciens et donc de nouvelles possibilités d’évaluer et d’étudier la virulence de N. gonorrhoeae.

La persistance de l’ADN viral dans les cellules est le principal obstacle à l’éradication du VIH. Les traitements antirétroviraux actuels inhibent uniquement l’initiation de nouveaux cycles complets de réplication, empêchant la production de virus par les cellules. Bien qu’ils soient capables de rendre le virus non infectieux, ils ne peuvent éliminer l’ADN viral.

Au cours d’un cycle normal de réplication du VIH, l’ADN linéaire non intégré (ULD) est synthétisé par transcription inverse de l’ARN génomique viral. Une fraction des ULD est importée dans le noyau où ils pourront soit s’intégrer dans le génome de la cellule, soit être sujets à des phénomènes de ligation, recombinaison et réparation formant des ADN circulaires qui ne contribuent que très peu à la réplication virale.

Lors de l’initiation d’un traitement antirétroviral sans inhibiteur de l’intégrase, la virémie plasmatique décroit selon deux phase. Une première rapide montrée comme étant due à des cellules productrices de virus à demi-vie courte et une seconde plus lente dont l’origine n’est à ce jour pas démontrée expérimentalement. En revanche, si le régime thérapeutique inclus un inhibiteur de l’intégrase virale, cette seconde phase n’est pas visible, suggérant alors qu’elle est en lien avec l’intégration.

Nous posons l’hypothèse qu’une proportion non négligeable des cellules infectées par le VIH héberge une ou plusieurs copies d’ULD avant l’initiation du traitement, une situation appelée latence pré-intégrative. Dans ces cellules, la production active d’ARN et de protéines du VIH doit attendre l’intégration de l’ADN viral, un processus qui peut se produire plusieurs jours ou plusieurs semaines après l’infection, selon la capacité de l’ULD à conserver son intégrité dans le temps. Cette intégration progressive serait à l’origine de la seconde phase de décroissance de la virémie chez les patients initiant un traitement ne comprenant pas d’inhibiteurs de l’intégrase.

Grâce au développement d’une nouvelle technologie ultra-sensible et à haut débit de quantification des ADN, (appelée DNA Ultra-Sensitive Quantification) nous avons récemment mis en évidence au laboratoire que les ULD ont une capacité de persistance bien supérieure à celle suggérée dans la littérature pouvant aller jusqu’à 3 mois dans des lymphocytes T CD4 quiescents. Nous proposons, chez des patients infectés par le VIH-1 diagnostiqués dès la primo-infection et initiant un traitement antirétroviral (essai national randomisé OptiPrim2), de suivre ex vivo l’effet du régime thérapeutique sur la dynamique des ULD au cours du temps (quantifiés par la technologie DUSQ) et, par une modélisation mathématique, de la corréler à la décroissance de la charge virale plasmatique mais également aux autres formes d’ADN viral (ADN VIH intégré, ADN VIH à 2-LTR, ADN total).

Cette étude pilote nous permettra pour la première fois d’initier une meilleure compréhension du rôle des ULD dans la dynamique de décroissance de la charge virale chez les patients initiant un traitement antirétroviral incluant ou non un inhibiteur d’intégrase. Par ce contrat d’initiation, nous pourrons donc obtenir des données sur 20 patients de chaque bras de l’essai Optiprim 2. Ces données seront de première importance et, en fonction des résultats générés, pourront permettre d’initier un projet de plus grande ampleur incluant plus de patients pour élaborer un modèle mathématique robuste.

Ces données préliminaires pourraient être de première importance pour initier un protocole chez le primate non humain pour identifier les sites et les cellules à l’origine d’une réplication virale résiduelle. De plus, les données accumulées dans ce contrat d’initiation pourront également être une base préliminaire à l’utilisation des ULD comme marqueur précoce du rebond viral dans les essais d’interruption de traitement antirétroviral, nécessaire dans les recherches de stratégies de cure.

Avec l’apparition de nouvelles classes d’antirétroviraux (ARV) l’espérance de vie des personnes vivant avec le VIH a considérablement progressé, et rejoint celle de la population générale. De plus, les causes de mortalité évoluent, puisque les cancers en constituent désormais la cause majoritaire. Une classe de traitements anticancéreux, les immunothérapies, en bloquant les récepteurs CTLA4 ou PD1 impliqués dans le rétrocontrôle négatif de la réponse immunitaire auraient le potentiel double avantage de pouvoir lutter contre les cellules cancéreuses, mais également contre le VIH présent à l’état de latence dans les lymphocytes T puisque l’activation lymphocytaire est associée à une réactivation virale. Ainsi en associant un agent réverseur de latence et un ARV, il serait possible de diminuer le nombre total de cellules contenant le génome viral (réservoir viral). C’est la théorie du « shock and kill », qui constitue l’une des principales stratégies d’élimination du virus.

L’objectif de ma thèse est d’étudier l’évolution qualitative du réservoir viral VIH-1 chez des patients traités par immunothérapie. Il s’appuie pour cela sur la cohorte ANRS CO24 OncoVIHAC, cohorte multicentrique de patients vivant avec le VIH traités par immunothérapie pour un cancer. Cette étude fait suite à des études qualitatives qui ont identifié pour une minorité de patients une diminution au moins transitoire de l’ADN proviral concomitamment à une majoration de la charge virale plasmatique (résultat en accord avec la théorie du « shock and kill »).

Ces résultats soulèvent de nouvelles questions, en lien avec la structure du réservoir viral. En effet, seuls 5% des provirus sont potentiellement réplicatifs, les autres possédant des délétions ou mutations les rendant non fonctionnels. Se pose alors la question de la part des virus réplicatifs dans la diminution parfois observée au cours de ces traitements puisqu’un réservoir bas est un facteur associé à l’absence de rebond de la charge virale à l’arrêt des antirétroviraux. Un effet sur la part « fonctionnelle » du réservoir ouvrirait donc la voie à des essais d’immunothérapies chez des patients VIH positifs sans cancer, à visée curatrice.

Du fait de la complexité du réservoir VIH, plusieurs techniques complémentaires ont été développées. Nous envisageons d’utiliser deux principales méthodes. La première, l’Intact Proviral DNA Assay, permet une estimation des différentes populations virales entre virus entier potentiellement réplicatif, virus possédant de larges délétions et virus muté par APOBEC (enzyme de restriction). Elle consiste en une digital droplet PCR, technique où l’échantillon à amplifier est fractionné en environ 20 000 gouttelettes dans chacune desquelles une réaction de qPCR s’effectue indépendamment. Puis chaque gouttelette est analysée séparément afin de déterminer si elle présente une ou plusieurs parties du virus, permettant ainsi une première estimation des proportions de virus réplicatif / non réplicatif. Cette technique a l’avantage d’avoir été validée après sa publication princeps sur plusieurs cohortes et, nécessite peu de cellules. Cependant, elle porte sur seulement deux régions du génome viral et peut surestimer la proportion de virus réplicatifs. Pour pallier ce problème nous envisageons également de réaliser une technique de dilution limite – séquençage de génome VIH. Elle consiste à diluer le prélèvement pour qu’un seul génome viral soit statistiquement présent par puits. Puis chaque génome viral est indépendamment amplifié et séquencé. La dilution est nécessaire car elle permet d’avoir une vision non biaisée de l’ensemble de la population virale : les provirus ayant de larges délétions, plus courts, seraient surreprésentés car plus rapidement amplifiables. L’inconvénient de cette technique est cette fois sa lourdeur, puisqu’elle nécessite de multiples PCR avant séquençage. Elle permet cependant une analyse plus fine des populations virales, et notamment leur évolution vis-à-vis des complexes majeurs d’histocompatibilités par des approches bio informatiques. Enfin, il est possible de coupler cette technique avec une recherche des sites d’insertion du génome viral.

Introduction

En France, 150 000 personnes vivent avec le VIH, dont 25% ont été diagnostiquées à un stade tardif de la maladie. Un diagnostic plus précoce permet d’améliorer la prise en charge de la maladie et de limiter sa propagation, mais suppose un dépistage plus systématique et ciblé sur les populations particulièrement touchées. Or, en France, d’après ONUSIDA, seuls 84% des personnes séropositives connaissent leur statut, 75% sont sous traitement antirétroviral et 68% ont une charge virale indétectable au seuil de 50 copies, alors que les objectifs sont que ces trois chiffres atteignent 90% en 2020. Les migrants sont particulièrement touchés par le VIH et les hépatites : En 2014, 48% des personnes diagnostiquées positives pour le VIH étaient nées à l’étranger, et l’enquête PARCOURS suggère que 58% étaient déjà infectés à leur arrivée. Les opportunités manquées de dépistage du VIH et des hépatites sont nombreuses et mettent en lumière la difficulté des patients et soignants à identifier les facteurs de risques et à aborder les questions de sexualité et de VIH et hépatites avec les migrants. A ces difficultés s’ajoute la barrière de la langue. Plusieurs études ont montré que les difficultés linguistiques des migrants sont un frein au test de dépistage du VIH ou des hépatites B et C, aussi du côté des soignants que du côté des migrants. Dans une PASS, une étude a révélé que 29.3% des patients ont besoin de traduction, et s’aident souvent de membres de leur famille, d’amis ou d’interprètes pour ce faire, ce qui peut compliquer l’abord de sujets sensibles et compromet la confidentialité de la rencontre.

Objectifs

Notre étude a pour objectif de développer une application multilingue et multiculturelle pour aider les soignants à proposer et expliquer le dépistage du VIH et des hépatites auprès du public allophone, et d’évaluer l’acceptabilité de cet outil et son impact en santé publique.

Méthodologie             

L’étude se déroule en trois étapes : le développement du concept, puis de l’application, et enfin son évaluation. Pour développer le concept, une étude qualitative sera menée auprès des soignants et des migrants pour cerner leurs attentes et leurs besoins, et pour recueillir des phrases-clés qui seront traduites incorporées à l’outil de dépistage. Dans le volet migrants, il s’agira aussi de chercher des moyens d’évaluer leur niveau de health literacy, de comprendre leur utilisation des moyens de traduction et leur position quant à la présence d’un interprète. En parallèle, une revue de la littérature sera menée puis un sondage Delphi auprès d’un large panel, pour sélectionner une banque d’items. L’outil sera développé avec l’aide de prestataires spécialisés en traduction avec adaptation culturelle. La maquette du projet sera testée en conditions réelles, suivis d’ajustements éventuels. L’évaluation de l’outil sera conduite à l’aide d’une étude randomisée en cluster à stepped wedges dans 16 centres proposant recevant des migrants et étant susceptibles de proposer des tests de dépistage. Les 16 centres cibles seront, à terme, couverts par le déploiement de cet outil. Les critères de jugement sont l’augmentation des propositions de dépistage, le nombre de cas positif dépistés et la satisfaction du personnel et des migrants.