Projets et candidats lauréats

La persistance d’un réservoir latent contenant des provirus intégrés compétents pour la réplication chalenge les perspectives d’éradication du virus de l’immunodéficience humaine (VIH). La pause proximale du promoteur est une étape clé de la transcription virale conduisant à l’accumulation de transcrits courts dans des cellules infectées de manière latente. Il est donc important d’identifier les facteurs régulant la pause et le redémarrage de l’ARN polymérase II (ARNPII) au niveau de la LTR 5 ’. Nous avons identifié le complexe “Polymerase II-Associated Factor“ (PAF1C) comme répresseur de la transcription basale du VIH. En utilisant à la fois des approches protéomiques et moléculaires, nous avons montré que PAF1C interagissait avec le complexe PTW: PP1 ainsi qu’avec Iws1 / Spt6 qui pourraient être impliqués dans la répression de la transcription du VIH. Ce projet utilisera une combinaison d’approches biochimiques et moléculaires de pointe, telles que l’ARN-seq, le ChIP et le GRO-seq, afin de déchiffrer le rôle de PAF1C dans le contrôle de la latence du VIH. Nous définirons le profil des transcrits viraux dans des modèles de latence en cellules primaires. Notre objectif est de caractériser les interactions entre PAF1C, PTW: PP1 et Spt6/Iws1 et de déterminer comment PAF1C est recruté sur les provirus latents. Nous explorerons le rôle de PAF1C dans les mécanismes qui contrôlent la pause proximale de l’ARNPII au LTR et la terminaison prématurée dans des modèles de cellules primaires infectées de manière latente. Nous déterminerons le rôle des complexes de terminaison de la transcription dans le contrôle de la latence du VIH induit par PAF1C. Que des stratégies efficaces pour éliminer le provirus latent nécessitent de réactiver ou de bloquer sa transcription, il est urgent d’identifier les principaux acteurs contrôlant les pauses proximales du promoteur du VIH. L’identification de PAF1C en tant que nouveau facteur de répression du VIH devrait aider à mieux comprendre les mécanismes contrôlant la latence du VIH.

Le virus de l’hépatite B (VHB) affecte plus de 250 millions de personnes dans le monde et est l’une des principales étiologies pour le développement de la cirrhose hépatique et du carcinome hépatocellulaire. Malgré l’existence de programmes de vaccination, l’infection chronique par le VHB reste un problème majeur de santé publique en raison du nombre limité de composés thérapeutiques disponibles, qui comprennent principalement des analogues de nucléos(t)ides et l’interféron alpha pégylé. Ces traitements nécessitent une utilisation en continu pour maintenir la suppression virale et prévenir la rechute virologique qui survient généralement après l’arrêt du traitement. De plus, les options thérapeutiques actuelles ne permettent pas d’éradiquer le virus. L’infection chronique par le VHB reste un problème de santé majeur qui nécessite un effort permanent pour développer et caractériser de nouvelles molécules et des thérapies combinées dans le but d’éliminer le VHB.

L’évaluation préclinique de nouveaux traitements à l’aide de modèles in vitro représente un défi, en raison des aspects techniques de la coculture de plusieurs types cellulaires et la difficulté de recréer leurs proportions observées in vivo. De même, l’utilisation de modèles animaux reste coûteuse et est associée à des préoccupations éthiques. Afin de surmonter ces défis, notre projet évaluera l’application des precision-cut liver slices (PCLS) en combinaison avec du single-cell RNA sequencing (sc-RNAseq) comme méthode de caractérisation des nouvelles thérapies ciblant les maladies du foie. L’utilisation des PCLS dans cette approche expérimentale offre un compromis entre les différents modèles disponibles. Il présente en effet les avantages pratiques d’une méthode in vitro, avec la possibilité d’étudier un contexte cellulaire plus proche du microenvironnement observé in vivo. De plus, l’application du sc-RNAseq permet de caractériser en détail l’action d’une molécule donnée dans chaque population cellulaire du microenvironnement hépatique humain.

Cette étude innovante utilisera le GS-9688, un agoniste du Toll-like receptor 8 (TLR8) qui fait partie des nouveaux agents thérapeutiques en cours de développement.  Actuellement en évaluation de phase II, cette molécule montre des résultats préliminaires prometteurs au regard de sa sécurité, sa tolérance et l’induction de changements sérologiques associés à la progression vers une guérison. L’effet immunomodulateur du GS-9688 a été exploré dans le compartiment immunitaire périphérique, mais la réponse intrahépatique à cet agoniste du TLR8 n’a pas été encore caractérisée d’où l’intérêt d’évaluer cette réponse avec notre stratégie. Les données transcriptomiques obtenues à l’aide de ce modèle seront comparées aux données cliniques des patients infectés par le VHB dans des bases de données publiques, afin d’identifier des biomarqueurs et des signatures associés aux paramètres viraux et hépatiques. Cette approche représente un moyen très pertinent de stratifier les patients en fonction de leur réponse immunitaire et de sélectionner les personnes les plus à même de répondre efficacement à ces nouvelles thérapies.

L’établissement d’une telle approche expérimentale pourrait en outre avoir une application plus large, car cette méthode, très pertinente, vise à acquérir des connaissances fonctionnelles à l’échelle de la cellule unique, dans des contextes physiologiques et pathologiques. En effet, la caractérisation des tissus solides par sc-RNAseq est à l’heure actuelle un domaine hautement descriptif, les études de perturbation s’appuyant sur l’expérimentation animale afin d’identifier les états cellulaires transcriptionnels. Par conséquent, l’utilisation des PCLS en combinaison avec le sc-RNAseq en tant que modèle ex vivo, représente une stratégie pratique pour surmonter ces défis techniques.

Les thérapies anti-rétrovirales traitent efficacement les infections au VIH. Cependant, l’arrêt du traitement entraîne un rebond viral et le traitement doit donc être poursuivi à vie, avec des risques importants. Les rebonds viraux sont provoqués par des cellules infectées de manière latente, qui peuvent être réactivées même après des années de traitements. De plus, alors qu’une variable médicale clé pour développer une cure est la vitesse à laquelle les cellules latentes se réactivent, nous savons très peu de choses sur la transcription virale dans les cellules latentes. Des données récentes indiquent que la sortie de latence est stochastique, ce qui reflète les fluctuations aléatoires de la transcription observées dans les cellules vivantes. Sachant que la plupart des gènes ne sont transcrits qu’épisodiquement, nous pensons que certaines cellules latentes ne sont pas complètement silencieuses mais expriment le virus de manière transitoire, lors de brèves impulsions, et donc de manière indétectables avec des méthodes conventionnelles. Ces cellules latentes pourraient être des facteurs clés de l’infection car elles pourraient échapper à la surveillance immunitaire et déclencher deux types d’événements: (i) des sursauts sporadiques de transcription virale, trop faibles pour activer complètement le virus mais néanmoins produisant suffisamment de virus pour déclencher un nouveau cycle infectieux; (ii) une sortie de latence, dans laquelle une impulsion produit suffisamment d’ARN pour initier la boucle de rétroaction de Tat, et donc pour activer complètement le virus. Ces événements stochastiques pourraient être dus à un bruit intrinsèque, créé par la stochasticité inhérente aux réactions biochimiques de l’initiation de la transcription, ou à un bruit extrinsèque, qui est généré par des facteurs affectant l’ensemble de la cellule, comme une activation aléatoire d’une voie de signalisation, un stress mécanique, etc…

          Dans ce projet, nous exploiterons la puissance de l’imagerie de molécule unique pour étudier la transcription virale dans les cellules infectées de manière latente par le VIH-1. Nous avons précédemment développé des systèmes permettant de visualiser des molécules uniques d’ARN viral dans des cellules vivantes, et ces méthodes sont parfaitement adaptés pour détecter les rares événements de transcription virale qui se produisent dans les cellules latentes. Grâce à de l’imagerie de cellules vivantes à haut débit, nous déterminerons:

• But 1: l’activité transcriptionnelle virale dans un grand nombre de cellules T latentes;
• But 2: l’hétérogénéité de la réponse virale à l’activation cellulaire;
• But 3: la contribution des facteurs extrinsèques et intrinsèques à ces évènements de transcription.

Ce projet offrira une vision renouvelée de la latence virale et aidera à concevoir des stratégies plus efficaces pour combattre le virus.

La tuberculose (TB) causée par Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est un problème majeur de santé publique dans le monde, y compris au Maroc ou l’incidence annuelle est de l’ordre de 1 pour 1000. Environ un quart de la population mondiale est infectée par Mtb, mais seule une minorité développe la tuberculose. Les études d’épidémiologie génétique suggèrent fortement que la tuberculose est aussi une maladie génétique. Les bases moléculaires de la TB ont été disséquées depuis les années 2000. Nous avons découvert deux types d’erreurs innées de l’immunité (IEI) aboutissant à la tuberculose, toutes deux altérant l’immunité liée à l’interféron (IFN)-γ: (i) des IEI rares, comme les défauts complets autosomiques récessifs d’IL-12Rβ1 et de TYK2, retrouvés chez quelques patients tuberculeux, et (ii) une IEI commune due à l’homozygotie pour le variant P1104A de TYK2 qui perturbe sélectivement l’immunité liée à l’IFN-γ, dépendante de l’IL-23, et qui représente jusqu’à 1% des cas de tuberculoses européens. Ces résultats ont fourni la preuve de principe qu’il existe à la fois des étiologies monogéniques rares et communes de la TB humaine, ils ont mis en évidence des variants spécifiques d’une origine ethnique (européen dans ce cas); ils ont établi que la production d’IFN-γ est essentielle pour l’immunité protectrice contre Mtb. Néanmoins, la grande majorité des patients tuberculeux n’ont pas d’étiologie génétique. Nous émettons l’hypothèse que la tuberculose est la conséquence d’IEIs monogéniques ou digéniques, encore à identifier, avec une pénétrance incomplète ou plus rarement complète, dans une proportion importante de la population. Pour découvrir ces variants, nous utiliserons une approche génome entier avec séquençage complet des exons et du génome si nécessaire. Les patients tuberculeux seront recrutés au Maroc, en particulier ceux appartenant à des familles consanguines et/ou multiplex (plusieurs atteints dans la famille) et/ou avec des formes récurrentes de tuberculose, car ces patients sont plus susceptibles d’être porteurs d’IEI. Notre projet suivra une stratégie combinant: (i) une étude génétique complète basée sur le séquençage de nouvelle génération de plus de 600 patients TB Marocains (dont 505 exomes déjà disponibles) et plus de 300 individus sains infectés pour rechercher des variants candidats à l’origine de la tuberculose à l’aide d’analyses de pointe testant différentes hypothèses génétiques (hétérogénéité ou homogénéité génétique, hérédité monogénique ou digénique), et (ii) des études fonctionnelles approfondies pour caractériser biochimiquement les effets des variants candidats nouvellement découverts, et pour valider immunologiquement leur rôle causal au niveau moléculaire et cellulaire. Notre projet bénéficiera également des patients TB précédemment recrutés d’autre origine (> 1000), afin de répliquer les résultats qui seront identifiés dans l’échantillon Marocain. Notre projet est très innovant et réalisable car il se base sur une collection unique de patients recrutés avec des critères d’inclusion rigoureux, une collaboration de longue date entre les partenaires Français et Marocains, et bénéficie des fortes compétences cliniques et génétiques des partenaires Marocains sur la TB et du partenaire Français dans la découverte de nouveaux IEI impliqués dans les maladies infectieuses. Nos données préliminaires indiquent que cette approche est fructueuse, car nous avons déjà identifié des mutations candidates très prometteuses, avec les variants gain de fonction mono-alléliques de STAT1 et des variants rares de perte de fonction bi-allélique dans LY9 et BTN3A3, et des variations mono- ou bi -alléliques communes de IL10RA. Notre recherche de variants rares et communes amenant à des IEI monogéniques ou digéniques qui contrôlent le développement de la TB à forte pénétrance permettra de déchiffrer les mécanismes de l’immunité protectrice contre Mtb chez l’homme. Cette approche ouvrira également la voie au développement de nouvelles approches préventives et thérapeutiques, visant à restaurer des réponses immunitaires déficientes, en particulier en rapport avec l’IFN-γ.

Le projet proposé vise à explorer les obstacles spécifiques auxquels sont confrontés les réfugiés ukrainiens vivant avec le VIH et touchés par la tuberculose dans les pays d’accueil à travers l’Europe, ainsi que les stratégies d’adaptation qu’ils utilisent pour accéder aux soins en utilisant une méthodologie qualitative. Nous analyserons différentes approches de soutien aux populations clés parmi les réfugiés ukrainiens (consommateurs de drogues, hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes, personnes trans, professionnel(le)s du sexe) dans six pays d’accueil en Europe: la France, l’Allemagne, la Géorgie, l’Estonie, la Moldavie et la Pologne. Notre objectif est d’identifier des solutions efficaces en matière de prévention, d’arrimage aux soins et de maintien dans les soins. Des consultations détaillées avec des organisations communautaires et des groupes de la société civile ukrainienne ont été menées lors de l’élaboration de cette proposition. Les résultats de cette étude seront discutés au sein de l’OMS Europe et d’autres plateformes pertinentes pour améliorer les normes de soins pour les réfugiés et les migrants et les populations clés en déplacement, ainsi que pour promouvoir une recherche plus nuancée parmi des populations clés spécifiques. La recherche sera menée et analysée par une équipe expérimentée de l’université Paris Cité.