Projets et candidats lauréats

Le virus de l’hépatite E (HEV) est une cause majeure d’hépatite entéro-transmissible par voie entérique dans le monde. Quatre génotypes principaux circulent chez l’homme (HEV-1 à -4). Les génotypes HEV-3 et HEV-4 sont zoonotiques alors que les 2 autres (HEV-1 et HEV-2) infectent seulement les humains. Les suidés sont le réservoir principal du HEV zoonotique et le virus se transmet par contact direct avec les porcs infectés ou par la consommation de viandes infectées. En France, le HEV représente un problème important de santé publique et de sécurité alimentaire avec environ 60 000 cas annuels incluant plus de 500 hospitalisations et 20 décès. La gravité de l’infection par le HEV va d’une forme asymptomatique, à des hépatites aiguës résolutives mais peut aussi aller jusqu’à des formes très sévères avec des taux de mortalité élevés associés au HEV-1 chez les femmes enceintes. De plus, des cas chroniques d’hépatite E causés par HEV-3 et HEV-4 ont été rapportés chez des personnes immunodéprimées, notamment des receveurs d’organes. Aucun traitement spécifique contre le HEV n’a encore été validé même si plusieurs études ont rapporté un effet bénéfique de la ribavirine pour traiter les cas d’infection chronique. Le manque de modèle de culture cellulaire efficace et pertinent a longtemps limité les études sur les interactions HEV-cellules hôtes. Plusieurs travaux ont été conduits afin de mieux comprendre les interactions entre le HEV et la réponse interféron (IFN) de l’hôte mais celles-ci restent encore peu caractérisées. L’interféron (IFN) est la première ligne de défense contre les infections. Lorsqu’un pathogène est détecté, des voies de signalisation cellulaires sont activées, conduisant à la sécrétion d’IFN et à l’expression de gènes stimulés par l’IFN (ISGs) instaurant un état antiviral dans la cellule infectée et les cellules voisines. L’objectif principal de ce projet est de caractériser les voies de signalisation activées lors d’une infection par le HEV et l’activité antivirale de cette réponse de l’hôte dans les hépatocytes. Pour cela, un modèle d’infection dans les cellules HepaRG sera utilisé. Cette lignée de cellules humaines progénitrices et bipotentes est capable de se différentier en hépatocyte et choliangocyte et est un modèle pertinent pour étudier les interactions entre les virus hépatotropes et le système immunitaire inné. Tout d’abord, nous allons déterminer quels sont les senseurs et composants des voies de signalisation IFN impliqués dans la détection du HEV et la modulation de sa réplication. Pour cela, nous utiliserons des cellules HepaRG différentiées dans lesquelles l’expression des principaux senseurs, adaptateurs et facteurs de transcription impliqués dans la voie de signalisation IFN-I a été éteinte. Ensuite, nous identifierons les ISGs exprimés lors d’une infection par le HEV et déterminerons lesquels possèdent une activité antivirale contre la réplication du virus. Le mode d’action de quelques ISGs d’intérêt sera ensuite investiguer de façon plus approfondie. De plus, nous allons comparer la capacité de plusieurs souches d’HEV-1 et d’HEV-3 à activer la synthèse d’IFN et leur sensibilité à l’effet antiviral de la réponse IFN. Ce projet contribuera à une meilleure compréhension de la capacité du HEV à interagir avec la réponse antivirale de l’hôte et de la pathogénèse associée à l’infection par le HEV-1 et HEV-3. Ceci pourra aboutir à l’identification de nouvelles stratégies de contrôle et prévention du virus. Ceci est primordial pour le traitement des hépatites E chroniques chez les patients immunodéprimés qui nécessite le développement de thérapies antivirales avec moins d’effets secondaires.

Le dernier rapport IBBS 2019 souligne le fait que la moitié des hommes qui ont des rapports sexuels avec d’autres hommes (HSH) et un tiers des transgenres (TG) n’ont jamais été testes pour le VIH ou depuis plus d’un an. Avoir reçu de l’information sur le VIH dans les 6 derniers mois et se percevoir comme a risque d’acquisition du VIH sont les principaux facteurs associes a une augmentation de la couverture de dépistage. Dans ce même rapport, la grande majorité́ des HSH et TG étaient testes par les travailleurs communautaires au sein des organisations existantes alors que le réseau prive est très peu utilise (5% chez les HSH et 2% chez les TG). Les pharmacies privées peuvent être à même de délivrer des autotests VIH offrant ainsi l’avantage de la confidentialité, de l’anonymat, en particulier pour les HSH et TG ne souhaitant pas dévoiler leur orientation sexuelle. Le recrutement des participants via une méthode boule de neige basée sur une Application mobile pourrait permettre d’atteindre les HSH et TG en dehors du réseau communautaire en assurant un quasi complet anonymat puisque l’Application ne requiert aucune information personnelle.

L’objectif principal de l’étude est d’évaluer la faisabilité d’une délivrance d’autotests par un réseau de pharmacies privées et d’une méthode boule de neige basée sur une Application mobile pour améliorer la couverture de dépistage des HSH et TG à Phnom Penh. Les objectifs secondaires sont d’évaluer l’acceptabilité et la pertinence de la stratégie, d’identifier des freins et facilitateurs et d’estimer le recours aux soins ou aux services de prévention (PrEP) pour les participants.

Une étude pilote interventionnelle en utilisant une approche mixte quantitative et qualitative sera conduite à Phnom Penh chez des HSH et TG âgés de plus de 18 ans et ayant un smartphone. L’intervention sera conduite comme une méthode boule de neige basée sur une Application mobile avec une diversité de graines qui seront recrutes via les applications en ligne et les réseaux sociaux et dans des points chauds (sauna, spa, bars, clubs) afin d’atteindre une grande diversité de population et plus particulièrement, ceux en dehors du réseau communautaire. L’application sera installée sur le téléphone de chaque graine avec l’aide d’un travailleur communautaire. L’application contiendra un unique code QR donnant accès à un autotest VIH gratuit dans une des pharmacies partenaires. La délivrance de l’autotest génèrera 10 messages d’invitation pour télécharger l’application que le participant pourra envoyer au sein de son réseau de pairs. Au bout de 6 mois, une évaluation qualitative sera réalisée afin d’estimer la compréhension, l’acceptabilité et la pertinence de l’intervention et d’identifier des freins et facilitateurs. Chaque participant sera suivi pendant 18 mois et encourage a realiser un autotest tous les 6 mois pendant cette période. Un nouveau QR code sera automatiquement envoyé tous les 6 mois via l’application. Plusieurs sites de prise en charge VIH incluant des services de prévention seront sélectionnés comme sites partenaires afin de recueillir des informations concernant la prise en charge des patients positifs et l’accès à la PrEP pour les patients négatifs.

Les critères de jugement se centreront sur des critères de faisabilité, acceptabilité et pertinence de l’intervention. Nous essaierons d’atteindre le maximum de participants possibles et la precision attendue pour la couverture de dépistage (largeur des intervalles de confiance) sera estimee en fonction de la taille d’échantillon.    

Cette étude permettra de savoir si la délivrance d’autotest par des pharmacies privées peut permettre d’améliorer la couverture de dépistage chez les HSH et TG. Elle permettra peut-être d’identifier un nouveau profil de HSH et TG a risque d’acquisition du VIH et qui pourrait bénéficier de services PrEP tout en évaluant la répétition des tests dans cette population. Le réseau de pharmacies privées pourra être étendus en cas de résultats positifs et l’intervention pourra servir d’exemples pour d’autres études futures.

Le virus de l’hépatite E (VHE) est responsable d’infections chroniques chez les patients immunodéprimés. Les altérations immunitaires responsables de la persistance de l’infection sont largement incomprises. Nous étudions le rôle des lymphocytes T de type γδ et nos travaux récents sur des patients immunodéprimés (transplantés d’organes) ont mis en évidence une activation de ces lymphocytes et des marqueurs de leur mobilisation à la phase aigüe de l’infection. A partir d’une collection d’échantillons prélevés à la phase aigüe de l’infection chez des individus immunocompétents, nous avons confirmé que ces lymphocytes s’activent in vitro préférentiellement au contact d’hépatocytes infectés. A partir de lignées de lymphocytes γδ établies à partir de ces patients, nous avons mis en évidence que le virus modifie leur polarisation fonctionnelle et stimule une activité immunosuppressive en altérant leur réponse à certaines cytokines inflammatoires. Ceci représente un possible mécanisme d’échappement immunitaire. Notre projet vise  (i) à préciser dans un modèle d’infection in vitro les mécanismes inducteurs de propriétés régulatrices dans les lymphocytes Tγδ, en caractérisant les facteurs inducteurs au niveau du virus et des cellules infectées et en précisant comment ces facteurs modifient les cascades de signalisation de certaines cytokines. (ii) Nous voulons préciser les marqueurs phénotypiques des cellules γδ possédant des propriétés immunorégulatrices. (iii) Nous voulons préciser l’importance pathophysiologique de ces cellules γδ et des cytokines immunomodulatrices incriminées par l’étude d’échantillons sanguins issus de patients immunocompétents ou d’individus transplantés d’organes prélevés à la phase aigüe de l’infection, en recherchant la présence in vivo de ces cellules γδ régulatrices et en recherchant les cytokines incriminées afin de savoir dans quelle mesure ils corrèlent avec le statut et l’évolution clinique des patients (résolution spontanée ou chronicité). A terme, ce travail doit permettre de savoir si la mobilisation de ces lymphocytes est bénéfique ou non pour les patients et de préciser l’intérêt de cibler les lymphocytes γδ pour une immunothérapie préventive des infections chroniques par HEV.

Il existe une très grande différence de lipidation entre les lipoviroparticules (LVPs) du virus de l’hépatite C (VHC) produites au cours de l’infection naturelle et celles produites in vitro par les cellules Huh7 (et les clones dérivés – modèle VHCcc) qui présentent un métabolisme lipidique déficient. Ces modèles permettent ainsi difficilement la juste compréhension des liens étroits qui unissent lipides cellulaires et virus permettant de produire ces LVPs très étroitement associées à la voie de sécrétion des lipoprotéines chargées de lipides neutres et à des apolipoprotéines (apo). Les apo, notamment l’apoE, jouent un rôle central dans différentes étapes du cycle viral. Or, la physiologie hépatique est caractérisée par des hépatocytes différenciés, évoluant sous une faible tension en oxygène (hypoxie), loin des cellules Huh7 dé-différenciées, cultivées en condition atmosphérique d’oxygénation (normoxie), qui servent à la production in vitro du VHCcc. Ainsi, nos objectifs sont : 1) d’établir et de caractériser un modèle de culture de cellules Huh7.5 différenciées, cultivées en hypoxie physiologique ; 2) d’évaluer l’impact de cette culture originale sur les caractéristiques infectieuses et ultrastructurales des LVPs produites et 3) d’explorer les mécanismes moléculaires hypoxie et/ou différenciation-dépendant qui sous-tendent la morphogenèse et l’infection virale en lien avec le métabolisme lipidique.

Nos résultats préliminaires montrent que des cellules Huh7.5 exposées au DMSO et plongées dans une hypoxie prolongée (Huh7.5Hypo–Diff) rétablissent divers marqueurs de la différenciation hépatocytaire mais aussi stabilisent fonctionnellement des facteurs de transcription centraux du métabolisme de l’hypoxie (HIF-1 et HIF-2). Ces cellules stockent en outre de plus nombreuses et de plus grosses gouttelettes chargées de lipides neutres que les cellules contrôles (Huh7.5Std), les cellules différenciées en normoxie (Huh7.5Diff) ou les cellules dé-différenciées en hypoxie (Huh7.5Hypo). Les lipoprotéines produites par Huh7.5Hypo–Diff sont deux fois plus grosses que celles des autres conditions (immunocapture et microscopie électronique – IC-MET) suggérant une meilleure production extracellulaire de lipoprotéines, potentiellement mieux couvertes d’apoE. Les cellules Huh7.5Hypo–Diff sont permissives à l’infection par le clone JFH1 du VHC et favorisent fortement la production extracellulaire des particules virales. Enfin, les LVPs produites par les Huh7.5Hypo–Diff présentent une taille et une structure similaires à celles isolées d’un sérum de patient infecté.

Nous avons ainsi établi un modèle de culture original où l’hypoxie prolongée couplée à la différenciation cellulaire optimise le métabolisme lipidique des cellules Huh7.5 et améliore la production de particules virales présentant une ultrastructure physiologiquement relevante.

Nous souhaitons à présent caractériser plus finement le métabolisme des lipides de ce modèle original et comprendre les mécanismes qui sous-tendent la morphogenèse virale. Ainsi, nous analyserons les synthèse et production des autres apo importantes pour les LVPs, nous évaluerons le rôle des HIFs dans le phénotype cellulaire et viral par l’emploi de cellules exprimant constitutivement HIF-1 ou HIF-2 ou de drogues stabilisant l’un ou l’autre des HIFs, nous déterminerons le pouvoir infectieux des particules produites en relation avec la densité des virions présents, nous affinerons notre connaissance du rôle de l’apoE (emploi de cellules dont l’expression d’apoE est modulée) dans la morphogenèse et l’infectiosité du VHC et enfin, avec ce modèle Huh7.5Hypo–Diff nous déterminerons le pouvoir de neutralisation de l’infection par des Ac produits par le laboratoire à partir de particules vaccinales portant ou non de l’apoE à leur surface.

Au final, notre projet vise à proposer un modèle original de production de particules virales du VHC de caractéristiques biochimiques et morphologiques proches de particules natives. Il permettra alors de mieux comprendre le lien existant entre métabolisme lipidique et cycle viral et de fournir un outil d’étude in vitro du pouvoir neutralisant d’Ac à visée vaccinale.

La majorité des maladies émergentes infectieux (MIE) sont d’origine zoonotique et 70 % sont causés par des agents pathogènes provenant de la faune sauvage. L’épidémie actuelle de COVID-19 avec le virus SRAS-CoV2 illustre clairement les conséquences d’une seule transmission inter-espèce avec un coronovirus (CoV), infectant plus d’un million d’individus et conduisant à un blocage de 4 milliards de personnes dans le monde entier en quelques mois seulement. Les chauves-souris sont à l’origine de CoVs humains, soit directement, soit par un hôte intermédiaire. Les contacts entre l’Homme et les chauves-souris sont variés et augmentent avec les changements environnementaux et climatiques, comme l’exposition directe au sang ou aux tissus infectés par la chasse, ou l’exposition indirecte aux fruits contaminés par leur salive, leur urine ou leurs excréments. Une grande diversité d’espèces de chauves-souris sont chassées en Afrique de l’Ouest et centrale. Par conséquent, il est maintenant plus que crucial de documenter la prévalence et la diversité génétique des coronavirus chez les chauves-souris.

L’objectif général du projet est de documenter des coronavirus circulants chez les chauves-souris dans les pays africains avec une forte probabilité d’émergence d’infections zoonotiques à partir de chauves-souris. Les objectifs spécifiques sont (i) documenter la diversité génétique et l’évolution des coronavirus chez les chauves-souris Africains; (ii) développer un essai sérologique à haut débit pour étudier les anticorps à différents coronavirus et estimer la prévalence des coronavirus chez différentes espèces de chauves-souris et (iii) étudier la saisonnalité de l’excrétion de coronavirus chez les chauves-souris.

Par nos études antérieures menées en Guinée, au Cameroun, en République démocratique du Congo (RDC) et Zimbabwe, nous avons déjà des échantillons de >10 000 chauves-souris dans leur habitat naturel disponibles (sang sur papier buvard, écouvillons oraux et anaux et échantillons fécaux. Le dépistage rétrospectif de la présence de coronavirus se fera en amplifiant et en séquençant un fragment de 440bp de RdRp. Sur un sous-ensemble d’échantillons, des efforts supplémentaires de séquence seront faits pour obtenir des séquences dans les gènes qui sont importants pour les essais sérologiques (gènes S et/ou N) ou des génomes complets en utilisant la technologie MinION. Nous utiliserons un essai sérologique à haut débit (approche Luminex) pour détecter les anticorps contre les coronavirus (SRAS-CoV1, SRAS-CoV2, MERSV, ..). Des échantillons provenant de colonies de chauves-souris au Cameroun et Guinée, prélevés au cours d’un suivi mensuel sur une période d’un an seront analysés pour la présence d’ARN viral et pour les anticorps dans les échantillons de DBS pour documenter la saisonnalité de l’excrétion virale dans différentes espèces.

Dans l’ensemble, cette étude fournira rapidement des informations clés sur la diversité génétique des coronavirus chez les chauves-souris en Afrique et des estimations sur leur prévalence. Il s’agit de la première étude à grande échelle en Afrique qui utilisera les mêmes techniques moléculaires et sérologiques afin de pouvoir comparer les résultats par région géographique et par espèce. L’étude apportera des informations importants sur la proportion de chauves souris qui excrètent le virus, ceux qui ont éte infécté et sur les saisons qui sont les plus à risque pour les transmissions zoonotiques. Les informations obtenues par ce projet contribueront également à l’élaboration d’une plate-forme diagnostique qui peut inclure un panel d’antigènes couvrant autant que possible la diversité des coronavirus pour identifier rapidement la circulation des nouveaux coronavirus chez l’homme ainsi que le développement de vaccins à large spectre. De même, des renseignements supplémentaires sur les cibles des médicaments antiviraux pour une grande diversité de coronavirus ayant un potentiel zoonotique seront utiles pour identifier l’activité des antiviraux.