Projets et candidats lauréats

Contexte: L’infection chronique par le virus de l’hépatite C (VHC) est la principale cause de développement de la maladie hépatique, de la cirrhose ainsi que du cancer du foie (carcinome hépatocellulaire (CHC) dans le monde. Il existe aujourd’hui des antiviraux capables de guérir l’infection chronique par le VHC, les antiviraux à action directe (AAD). Cependant, les stratégies thérapeutiques pour éviter la progression de la maladie hépatique et du CHC sont absentes, ce qui est problématique puisque l’éradication du virus n’empêche pas le risque de la progression de la maladie hépatique surtout chez les patients ayant développé une fibrose avancée. Les stratégies thérapeutiques pour éviter ou soigner la maladie hépatique ainsi que le CHC sont insuffisantes, ceci étant due à la mauvaise connaissance de la complexité de la maladie.  De ce fait, l’identification de gènes associés au développement du CHC est essentielle afin de caractériser la progression de la maladie hépatique et du CHC et pour identifier des cibles thérapeutiques pour éviter et soigner le CHC.

Résultats préliminaires: En utilisant une signature d’expression génique de 186 gènes permettant de prédire le risque de développer un CHC dans un modèle cellulaire que nous avons développé, nous avons découvert que la protéine transmembranaire Claudin-1 (CLDN1) est un gène important pour la carcinogénèse hépatique dont le mécanisme reste encore peu connu. De plus, les changements induis par CLDN1 au niveau transcriptionnel peuvent êtres réprimés en utilisant un anticorps monoclonal spécifique anti-CLDN1 développé par notre équipe.

Objectifs: En se basant sur le risqué élevé de développer une maladie hépatique et ainsi qu’un CHC chez les patients infectés par le VHC et considérant la nécessité de comprendre les gènes et voies de signalisations impliqués dans le processus, nous aimerions déterminer les mécanismes moléculaires d’action induis par CLDN1 qui favorisent la carcinogénèse hépatique.

Méthodes: Pour comprendre comment une protéine membranaire telle que CLDN1 peut induire des changements transcriptionnel, nous devons déterminer les sont les voies de signalisations impliquées. Afin de répondre à cette question, nous aimerions identifier les protéines qui interagissent avec CLDN1 au niveau de la membrane basolatérale de l’hépatocyte par co-immunoprécipitation. Aussi, nous aimerions identifier le domaine protéique de CLDN1 impliqué dans la signalisation induite par CLDN1. Pour ce faire, nous allons générer des mutants de CLDN1 qui vont être utilisés pour établir des lignées cellulaires hépatiques portant une inactivation génique pour CLDN1. Ces cellules vont être utilisées pour étudier l’effet de l’inactivation de CLDN1 sur l’expression de la signature génique des 186 gènes mais également sur les voies de signalisation cellulaire impliquées dans le CHC ainsi que la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) des cellules. Pour déterminer si les voies de signalisation Ephrin et Hedgehog sont impliquées, nous allons effectuer des analyses immunoblots sur des foies de souris traités avec l’anticorps monoclonal spécifique anti-CLDN1 en plus d’un anticorps contrôle. De plus, nous allons également étudier l’effect de l’environemment tumorale hépatique en générant des sphères de tumeurs ou «tumorspheres» à partir de tissus hépatiques humains, tumoraux ou adjacent à la tumeur et préalablement traités avec l’anticorps monoclonal spécifique anti-CLDN1 ou avec l’anticorps contrôle, provenant de patients ayant développé un CHC. Ces sphères seront analysées par RNA-Seq. En dernier lieu, afin de déterminer le role de CLDN1 dans la TEM des cellules, nous allons évaluer par immunoblot et PCR quantitative l’expression de marqueurs spécique de la TEM in dans des cellules préalablement traitées avec l’anticorps monoclonal spécifique anti-CLDN1 ou avec l’anticorps contrôle.

Résultats attendus: Nous anticipons de découvrir les mécanismes moléculaires d’action de CLDN1 la carcinogénèse hépatique. De plus les résultats de cette étude vont permettre l’identification de cibles thérapeutiques pour traiter la maladie hépatique ainsi que le CHC ainsi par l’infection par le VHC.

Le virus de l’hépatite E (HEV) est le 1er agent viral d’hépatite à l’échelle mondiale. Il peut être responsable d’une hépatite E chronique, définie par la persistance du virus pendant plus de 3 mois, chez les patients immunodéprimés. Des virus recombinants ayant incorporé des fragments de gène humain dans la région riche en proline (PPR) de leur génome ont été décrits au cours des infections chroniques. Ces fragments de gène humain possédaient une origine variée : protéine ribosomale S17, S19, tyrosine aminotransférase, inter alpha trypsine inhibiteur et favorisaient la réplication du HEV in vitro. Les mécanismes conduisant à cet avantage réplicatif comparativement au virus dépourvu du fragment humain sont actuellement inconnus.

L’objectif de ce projet est d’étudier le(s) mécanisme(s) conférant un avantage réplicatif aux virus recombinants ayant incorporé un fragment de gène humain.

 Dans la première partie de ce projet (semestre 1 et 2), nous allons étudier l’impact de 7 fragments humains récemment identifiés par notre équipe à l’aide d’une technique de séquençage haut-débit (SMRT PacBio). Les différents fragments seront insérés dans la PPR du plasmide codant pour le virus Kernow, principale souche de laboratoire utilisée pour l’étude du HEV. Le plasmide Kernow sans fragment humain sera utilisé comme contrôle. Après transcription in vitro, l’ARN obtenu sera transfecté dans la lignée cellulaire hépatique HepG2/C3A. Le stock viral obtenu après transfection sera utilisé pour infecter la lignée cellulaire hépatique HepG2/C3A. La capacité réplicative de chaque virus recombinant sera évaluée par quantification par RT-qPCR de l’ARN viral dans le surnageant de culture. Le nombre de foyers infectieux à J5 sera déterminé par immunofluorescence. Ces résultats seront confirmés sur des cellules d’hépatocytes primaires. L’impact de ces fragments humains sur le franchissement de la barrière d’espèce sera également étudié en introduisant ces fragments de gène humain dans une souche de génotype 1, génotype strictement humain. La capacité de ces virus recombinant à infecter des lignées cellulaires animale LLC-PK (rein de porc) et OHH1.Li (foie de biche) sera étudiée.

La deuxième partie de ce projet (semestre 3 et 4) vise à identifier les protéines interagissant avec la PPR. La région codant pour la PPR des virus recombinants possédant un avantage réplicatif sera amplifiée en utilisant une amorce permettant d’ajouter un tag HA et introduite dans un vecteur d’expression. Le plasmide sera ensuite transfecté dans la lignée cellulaire HepG2C3A. La protéine PPR sera concentrée par immunoprécipitation à l’aide de billes magnétiques coatés avec un anticorps anti-HA. Les protéines interagissant avec la PPR seront séparées par migration sur un gel SDS-PAGE et identifiées par spectrométrie de masse. L’identité des partenaires d’interaction sera confirmée par des approches de knock-down et surexpression pour mettre en évidence la perte/le gain d’avantage réplicatif en l’absence ou en présence de la cible de la PPR.

Ce projet permettra :

• de décrire le rôle de la PPR dans le cycle de réplication du HEV
• de déterminer l’impact de ces fragments humains dans le franchissement de la barrière d’espèce
• de préciser les mécanismes conduisant à l’amélioration de la capacité réplicative du HEV en présence de fragments de gènes humains.

The susceptibility of CD4 cells to HIV-1 infection is markedly augmented by T cell receptor (TCR) stimulation with recent data suggesting that this enhanced permissivity is regulated by changes in the lymphocyte’s metabolism. Notably, our group as well as others recently identified glutamine-induced oxidative phosphorylation (OXPHOS) as a critical metabolic pathway controlling HIV-1 infection in naïve as well as memory CD4 T lymphocytes. Furthermore, our study highlighted the balance between OXPHOS and aerobic glycolysis as a major regulator of HIV-1 infection in CD4 T lymphocytes (Clerc et al., Nature Metabolism, 2019). However, the link between the uptake of distinct nutrients––including glucose, glutamine and arginine––and the susceptibility of CD4 T cells to HIV-1 infection is not known. This uptake is likely to be an integral factor in infection as T cell activation requires augmented nutrient transport and utilization, and moreover, we and others have shown that the fueling of T cells via different nutrients alters their effector fate (Klysz et al., Science Signaling, 2015). Indeed, elegant studies have highlighted the differential impact of specific nutrients on T cell fate. We find that solute carriers transporting each of these three nutrients––GLUT1, ASCT2 and CAT–– are highly upregulated following TCR engagement of human CD4 lymphocytes. Furthermore, we report here that each of these transporters is essential for optimal CD4 T cell survival and expansion; downregulation of either GLUT1, ASCT2 or CAT1 by an shRNA-mediated approach results in a massive negative selection of transduced cells within 14 days. Importantly though, downregulation of these transporters differentially impacts the permissivity of CD4 T cells to HIV-1 infection: Loss of CAT1 markedly attenuates the level of HIV-1 infection while GLUT1 downregulation is compensated by a significantly increased OXPHOS/glycolysis ratio. Surprisingly though, ASCT2 knockdown resulted in an approximately 20% increase in infection and a concomitant increase in the ratio of naïve/ memory phenotype CD4 T cells. Based on these data, we hypothesize that the susceptibility to HIV-1 infection is regulated, at least in part, by the interplay between these nutrient transporters and the recruitment of downstream metabolic pathways that are essential for CD4 T cell survival, proliferation and differentiation.  

We now propose to elucidate the mechanisms regulating HIV-1 permissivity in T cell subsets as a function of GLUT1, ASCT2 and CAT1 expression, notably through the differential recruitment of metabolic pathways and molecular programs. To this end, we will:

• Determine the metabolic pathways resulting in both resistance and permissivity to HIV-1 infection in CD4 T cell subsets following nutrient transporter knockdown
• Characterize the interplay between GLUT1, ASCT2 and CAT1 in regulating early vs late phases of HIV-1 infection

The ensemble of these experiments will allow us to identify the mechanisms via which an intricate crosstalk between glucose, glutamine and arginine transporters regulate HIV-1 infection in distinct CD4 T cell subsets.

La glycoprotéine d’enveloppe (Env) est la protéine la plus diversifiée du VIH-1. Exposée à la surface du virus sous la forme d’un trimère de gp120/gp41 et jouant un rôle fondamental dans les premières étapes du cycle d’infection, elle est la cible privilégiée des anticorps neutralisants (AcN). Cependant, une fois l’infection établie, ces AcN favorisent l’apparition de variants d’échappement et ne permettent pas de contrôler la réplication virale. Plusieurs études récentes montrent que Env est également une cible importante des protéines de l’immunité innée. Différentes protéines antivirales dont l’expression est, pour la plupart d’entre elles, induite par les interférons de type I agissent sur Env en limitant sa synthèse, en dérégulant sa glycosylation, son clivage, son incorporation dans les virions ou encore en bloquant la processus de fusion lors de l’entrée du virus dans ses cellules cibles. Néanmoins, comme pour les AcN, nos récents travaux portant sur l’étude d’un de ces facteurs (IFITM3) ont montré que certains variants viraux sont capables d’y échapper.

Si l’activité antivirale de chaque facteur de restriction a été démontrée dans des modèles de culture cellulaire in vitro, la façon dont ces facteurs coopèrent in vivoentre eux et avec les AcN, une fois la réponse immune adaptative mise en place, n’a pas été explorée. Nous proposons d’aborder cette question grâce à 2 populations d’étude. La première est constituée de 5 sujets infectés par le VIH-1 chez lesquels nous suivrons l’évolution depuis la primo-infection jusqu’au stade d’infection chronique de la sensibilité/résistance des Env aux différents facteurs de restriction et aux AcN. Ce suivi longitudinal nous permettra de mieux comprendre quelle pression exerce chaque facteur de restriction sur Env, conjointement à celle exercée par les AcN, et quel est leur impact sur l’évolution de Env. La seconde population est constituée de 4 sujets appartenant à une chaîne de transmission identifiée par des analyses phylogénétiques au sein de la cohorte PRIMO 06 de l’ANRS. Grace à nos travaux antérieurs, nous disposons pour chacun de ces patients de virus pseudotypés exprimant les Env précoces (< 3 mois d’infection) et tardives (18 ou 24 mois d’infection) de la quasi-espèce virale les infectant. Cette population nous permettra d’étudier l’impact de la pression exercée par les facteurs de restriction et par les AcN sur Env dans la sélection des variants transmis et leur adaptation à un nouvel hôte. Enfin, la comparaison de séquences d’Env résistantes ou sensibles aux facteurs de restriction et la construction d’Env mutées ou chimères devraient également nous permettre d’identifier des déterminants moléculaires de Env qui modulent sa capacité d’échappement.

            La vaccination fait partie des moyens de prévention de certaines infections sexuellement transmissibles proposés aux hommes ayant des relations sexuelles avec des hommes (HSH). En raison des risques auxquels ils sont exposés, les recommandations vaccinales françaises préconisent que les HSH se vaccinent contre l’hépatite B, l’hépatite A et, pour les moins de 26 ans, contre les infections à papillomavirus humains (PVH). Les données de couvertures vaccinales et les études sur les déterminants du recours à la vaccination chez les HSH sont peu nombreuses en France, pays par ailleurs caractérisé par une défiance de la population générale envers les vaccins, alimentée par des controverses multiples.

     L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre les freins et leviers du recours à la vaccination chez les HSH en France. Il porte plus spécifiquement sur les vaccinations contre l’hépatite A, l’hépatite B et les infections à PVH. Les objectifs secondaires sont : 1) d’estimer les couvertures vaccinales déclarées pour ces trois vaccins et, parmi les personnes non vaccinées, la prévalence de l’intention de se faire vacciner ; 2) d’estimer la prévalence de l’hésitation vaccinale (i.e., avoir déjà refusé, retardé ou accepté un vaccin tout en ayant des doutes sur cette vaccination) dans cette population, la part des personnes hésitant vis-à-vis des trois vaccins considérés dans cette étude, et les motifs de cette hésitation ; 3) d’étudier les facteurs associés au fait d’être vacciné (ou d’avoir l’intention de se faire vacciner) et à l’hésitation vaccinale liée spécifiquement à ces trois vaccins, en s’intéressant plus particulièrement : i) à certaines connaissances, croyances et perceptions (vis-à-vis des vaccins, de la prévention diversifiée du VIH…) ; ii) aux antécédents médicaux et aux pratiques sexuelles ; iii) aux facteurs liés au système et aux professionnels de santé ; iv) aux caractéristiques démographiques, économiques et sociales ; v) au niveau de confiance accordé aux autorités de santé et à la médecine conventionnelle et au degré d’implication des individus dans les décisions de santé.

     Ce projet sera mené par une équipe pluridisciplinaire incluant des chercheurs en santé publique, en sociologie et des experts de Santé publique France.

     Ce projet repose sur une méthodologie innovante associant 1) une enquête quantitative administrée sur support digital (sites de rencontre gay sur internet, réseaux sociaux…) auprès d’environ 15 000 à 18 000 personnes, selon le retour d’expérience de précédentes enquêtes de ce type ; 2) une enquête qualitative par entretiens individuels semi-directifs menés auprès d’une trentaine de personnes ayant répondu à l’enquête quantitative ; 3) un recueil de données issues des carnets de vaccination auprès d’environ 800 personnes ayant répondu à l’enquête quantitative, ceci afin d’estimer la qualité des données déclarées de comportement de vaccination ou non. Ce projet sera réalisé sur une période de 36 mois. La 1ère année sera consacrée à l’élaboration du questionnaire de l’enquête quantitative et des demandes d’autorisations, à la définition de la stratégie de diffusion du questionnaire et à la réalisation d’une enquête pilote auprès d’une trentaine de personnes. La 2ème année du projet sera consacrée à la collecte des données quantitatives et qualitatives et à la préparation des bases de données. La 3ème année sera consacrée à la réalisation des analyses statistiques, à l’analyse des entretiens qualitatifs et à la valorisation des résultats de l’enquête.

     Les résultats de ce projet devraient permettre d’avoir une meilleure connaissance et compréhension des comportements et des processus de décisions vis-à-vis de la vaccination contre les hépatites B et A et contre les PVH parmi les HSH en France. Ces résultats sont essentiels pour guider les décisions et les choix des pouvoirs publics, des professionnels de santé et des acteurs impliqués dans la prévention auprès de ce public, en matière de stratégies d’intervention et de contenu des actions afin de promouvoir et faciliter l’accès à ces vaccins en tenant compte des besoins et attentes des personnes.

Les infections causées par le virus de l’hépatite C (VHC) sont toujours un problème majeur de santé publique, avec quelque 71 millions de personnes chroniquement infectées, causant la mort de 399000 d’entre elles en 2016. Des antiviraux à action directe ont été développés contre le VHC et permettent aujourd’hui des taux de guérison de 95%. Cependant, l’éradication du VHC sera difficile car l’infection est initialement asymptomatique, il n’ y a pas de vaccin et les traitements sont très coûteux. De fait, l’incidence de cancers associés au VHC continue à augmenter. Enfin, le VHC est devenu un excellent modèle de recherche fondamentale sur les virus à ARN, particulièrement les virus à ARN simple brin de polarité positive. Récemment, l’équipe de Volker Lohmann a publié une étude remarquable sur une souche de HCV de génotype 1b isolée d’un sérum à fort titre viral d’un patient ayant subi des transplantations de foie (German liver transplant 1, GLT1). Cet isolat post-transplantation a montré une haute efficacité de réplication en culture cellulaire. Après adaptation à la production de particules infectieuses in vitro, cette souche était toujours infectieuse in vivo, contrairement aux autres souches de HCV adaptées à la culture cellulaire.

De nouvelles données non publiées obtenues dans le cadre d’une collaboration entre les équipes Lohmann et Bressanelli ont identifié la protéine NS5A, et possiblement son interaction avec NS5B, comme étant à l’origine des propriétés particulières de GLT1. Nos résultats préliminaires ouvrent une toute nouvelle perspective sur les interactions établies par NS5A et pourraient contribuer à résoudre plusieurs énigmes sur la réplication du VHC. Ainsi, nos objectifs dans ce projet sont:

– Objectif 1 : une étude biophysique et structurale de peptides de NS5A définis à partir des résultats sur GLT1 et d’autres isolats post-transplantation et à partir de modélisations avancées utilisant AlphaFold.

– Objectf 2 : Des structures cristallographiques en phases cubiques lipidiques. Le construit envisagé a aussi été défini grâce à AlphaFold et devrait permettre à NS5A de s’assembler dans cet environnement mimant une membrane.

– Objectif 3 : La structure cristallographique en phases cubiques lipidiques du complexe NS5A-NS5B.

– Objectif 4 : Finalement, de nouvelles modélisations avancées de NS5A-NS5B de souches hyperréplicatives, modélisations appuyées sur les résultats structuraux des objectifs 1-3.